М лада: Трансавто-М – Официальный дилер LADA в г. Пригородный

Содержание

ЛАДА ПРОГРЕСС — официальный дилер LADA в г. Владимир

ЛАДА ПРОГРЕСС — официальный дилер LADA в г. Владимир и Владимирской области.

Лада Прогресс официальный дилер LADA, предлагает вашему вниманию весь актуальный модельный ряд легковых и коммерческих автомобилей. Мы – это не только салон продаж, но еще и сервисный центр автомобилей LADA, оказывающий полный спектр услуг по обслуживанию в городе Владимир.

Модельный ряд

Предлагаем все актуальные модели. Преимущественно в автосалоне представлены следующие автомобили:

Наш владимирский официальный дилерский центр LADA продает все модификации автомобилей. Например, LADA Granta представлена четырьмя моделями: хэтчбэк, универсал, лифтбек и седан.

Дополнительные услуги

Бесплатное обслуживание в течение гарантийного срока. Единственное условие — неисправность и причина ее возникновения должна подпадать под гарантийный случай.

У нас имеется все необходимое оборудование, а также высокопрофессиональные специалисты.

В официальном дилерском центре предоставляются следующие виды услуг:

оформление страховых полисов;
услуги технического осмотра;
тест-драйв.

Цены на автомобили и акции

Предлагаем Вам приобрести автомобили по рекомендованным производителем ценам. Конкретную стоимость можно посмотреть в соответствующем разделе.

Покупать автомобили у нас можно, в том числе и в кредит. Компания сотрудничает с несколькими банками, из предложений которых клиент может выбрать наилучшее для себя.

Покупка автомобиля может быть осуществлена, в том числе и по системе трейд-ин. Оценка по системе трейд-ин происходит по состоянию конкретного автомобиля. Предоставляем возможность заказывать покупку авто через форму в специальном разделе сайта. Это позволяет забронировать интересующую марку машины на непродолжительный срок, чтобы по прибытию в салон ее можно было сразу же выкупить.

Заинтересованы в покупке одной из новых моделей автомобилей российского автоконцерна или хотите сформировать/пополнить автопарк компании? Приходите к нам, звоните в офис по телефону + 7 (4922) 37-99-37, или обращайтесь к нам через форму обратной связи на сайте.

Появилось первое фото новой Lada Niva — Российская газета

В Сети опубликовали первое изображение рестайлинговой версии внедорожника Lada Niva. Ресурс Drom.ru утверждает, что это настоящее фото, а не коллаж.

Судя по снимку, снаружи внедорожник получит полностью новое оперение и обвес кузова. Заменены стальные штампованные панели капота и передних крыльев, а также бамперная группа и фары. Накрывающая крылья объемная панель капота ушла в прошлое, вместо каплевидных блок-фар применены зауженные.

Решетка радиатора стала больше по площади и выполнена в форме трапеции. Нижняя часть переднего бампера, расширители колесных арок и боковые молдинги сделаны из неокрашенного тисненого пластика. На снимке запечатлена версия для off-road — у нее к левому крылу прикреплен шноркель. Остальной кузов останется прежним, сзади можно ожидать новые фонари и другой бампер. Относительно машины уходящего образца у модернизированного внедорожника более агрессивный стиль.

Вероятно, автомобиль также получит новый интерьер. Планируются ли новшества по части техники — пока неизвестно.

Ранее паблик AvtovazNews сообщил, что первый экземпляр обновленной Нивы в Тольятти собрали в ноябре. На утекшем фото можно заметить и второй экземпляр рестайлингового внедорожника.

Напомним, Lada/Chevrolet Niva серийно выпускается с ноября 2002 года. В основе ее конструкции лежит проект ВАЗ-2123, который впервые представили широкой публике как новую Lada Niva в 1998-м. За все время модель пережила лишь одну крупную модернизацию — в 2009-м она получила обвес кузова разработки ателье Bertone и ряд изменений в салоне.

Автомобиль оснащается 1,7-литровым бензиновым мотором мощностью 80 л.с., механической 5-ступенчатой коробкой передач, раздаточной коробкой с понижающей передачей и блокировкой межосевого дифференциала. Привод — постоянный полный.

В декабре 2019-го АвтоВАЗ выкупил долю General Motors в тольяттинском ЗАО СП «GM-АвтоВАЗ». Автомобиль Chevrolet Niva выпускается под маркой Lada с июля нынешнего года.

По неофициальной информации, старт продаж обновленной Niva запланирован на февраль 2021 года.

Шарнир рычага балки задней подвески для а/м LADA LARGUS, RENAULT LOGAN, SANDERO «СЭВИ-ЭКСПЕРТ»

Фирменные разработки:

Применена инновационная технология USPK в изготовлении резины:

Эластичность +37%
Твердость + 20%

Выгоды автолюбителя:

Увеличен срок эксплуатации
Повышена управляемость автомобиля
Улучшено гашение вибраций

Гарантия 2 года без ограничения пробега

Применяемость

Марка Модель Объем двигателя л. Год выпуска
LADA LARGUS 1,6 2012-
RENAULT DUSTER 1,2 2010-
RENAULT DUSTER 1,5 2010-
RENAULT DUSTER 1,6 2010-
RENAULT DUSTER 2,0 2010-
RENAULT LOGAN I 1,0 2004-2015
RENAULT LOGAN I 1,2 2004-2015
RENAULT LOGAN I 1,4 2004-2015
RENAULT LOGAN I 1,5 2004-2015
RENAULT LOGAN I 1,6 2004-2015
RENAULT LOGAN II 0,9 2012-
RENAULT LOGAN II 1,0 2012-
RENAULT LOGAN II 1,2 2012-
RENAULT LOGAN II 1,5 2012-
RENAULT LOGAN II 1,6 2012-
RENAULT SANDERO I 1,0 2007-2014
RENAULT SANDERO I 1,2 2007-2014
RENAULT SANDERO I 1,4 2007-2014
RENAULT SANDERO I 1,5 2007-2014
RENAULT SANDERO I 1,6 2007-2014
RENAULT SANDERO II 0,9 2012-
RENAULT SANDERO II 1,2 2012-
RENAULT SANDERO II 1,5 2012-
RENAULT SANDERO II 1,6 2012-
DACIA DUSTER 1,2 2010-
DACIA DUSTER 1,5 2010-
DACIA DUSTER 1,6 2010-
DACIA DUSTER 2,0 2010-
DACIA LOGAN I 1,0 2004-2013
DACIA LOGAN I 1,2 2004-2013
DACIA LOGAN I 1,4 2004-2013
DACIA LOGAN I 1,5 2004-2013
DACIA LOGAN I 1,6 2004-2013
DACIA LOGAN II 0,9 2012-
DACIA LOGAN II 1,0 2012-
DACIA LOGAN II 1,2 2012-
DACIA LOGAN II 1,5 2012-
DACIA LOGAN II 1,6 2012-
DACIA SANDERO I 1,0 2007-2013
DACIA SANDERO I 1,2 2007-2013
DACIA SANDERO I 1,4 2007-2013
DACIA SANDERO I 1,5 2007-2013
DACIA SANDERO I 1,6 2007-2013
DACIA SANDERO II 0,9 2012-
DACIA SANDERO II 1,2 2012-
DACIA SANDERO II 1,5 2012-
DACIA SANDERO II 1,6 2012-

ООО «Лада Дом» | Главная

Фирменное наименование:
Общество с ограниченной ответственностью «Лада Дом» (ООО «Лада Дом»)

Руководитель:
Савицкий Герман Владимирович

ОГРН: 1143435001951
ИНН: 3435311173
выдан: ИФНС по г. Волжскому Волгоградской области, 10 апреля 2014 года.

Юридический/ Фактический/ Почтовый адрес:
404130 г. Волжский Волгоградской обл., ул. Машиностроителей, 9-б, тел./факс: 20-10-01

Электронный адрес:
[email protected]

Официальный сайт в сети Интернет:
www.ladadom34.ru

Номер лицензии: 034-000120
Дата получения лицензии: 29 апреля 2015 г.
Орган, выдавший лицензию: ИНСПЕКЦИЯ ГОСУДАРСТВЕННОГО ЖИЛИЩНОГО НАДЗОРА ВОЛГОГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ

Устав ООО «Лада Дом»

Режим работы компании:

Центральный аппарат:

Понедельник – четверг:	08⁰⁰ – 17⁰⁰
Пятница:	08⁰⁰ – 16⁰⁰
Обед:	12⁰⁰ – 12⁴⁸

Домоуправления:

Вторник — пятница:	08⁰⁰ – 17⁰⁰
Суббота:	08⁰⁰ – 16⁰⁰
Обед:	12⁰⁰ – 12⁴⁸

Аварийно-диспетчерская служба:
тел.

8 (8443) 20-10-58
круглосуточно

Часы приема граждан директором и главным инженером:
ул. Машиностроителей, 9 «Б»
Среда:14⁰⁰ – 16⁰⁰

Часы приема в домоуправлениях управляющими жилищным фондом:


Среда:	08⁰⁰ – 17⁰⁰
Суббота:	08⁰⁰ – 16⁰⁰
Обед:	12⁰⁰ – 12⁴⁸
Вторник, Четверг, Пятница:	неприемные дни

Доля участия субъекта Российской Федерации в уставном капитале организации	0 %
Доля участия муниципального образования в уставном капитале организации	0 %
Количество домов, находящихся в управлении	279
Площадь домов, находящихся в управлении	1 317 556,1 кв. м.
Количество домов, находящихся в обслуживании по непосредственному способу управления	1
Площадь домов, находящихся в обслуживании по непосредственному способу управления	1 421,6 кв.м.
Штатная численность (определяется по количеству заключенных трудовых договоров), в т .ч. : административный персонал, инженеры, рабочие	103 чел. 13 чел. 6 чел. 84 чел.

Фольклорный ансамбль «Млада» — Белгородский государственный институт искусств и культуры

Руководство коллектива

Ольга Яковлевна Жирова
Художественный руководитель ансамбля, заведующая кафедрой искусства народного пения, заслуженный работник культуры РФ
Ольга Ивановна Алексеева
Художественный руководитель ансамбля, доцент кафедры искусства народного пения, почётный работник среднего профессионального образования РФ

О коллективе

Фольклорный ансамбль «Млада» Белгородского государственного института искусств и культуры представляет собой своеобразную научную и творческую лабораторию, где апробируются инновационные технологии в освоении и популяризации подлинных образцов музыкально-обрядового фольклора Белгородского края. В составе коллектива студенты всех курсов кафедры искусства народного пения, для которых народное творчество, народное искусство и исполнительство составляют базовую основу профессионального образования. Не случайно многогранная деятельность ансамбля включает фольклорно-этнографические экспедиции в заповедные сельские территории, кропотливую работу по реконструкции собранного материала: расшифровку записей народных песен, восстановление фрагментов празднично-обрядовой культуры, сценическую интерпретацию народных песен и танцев.

Так, в репертуар коллектива входят авторские творческие программы «Круг жизни», «От весны до зимы», «Семик-Троица-Богородица», «Белгородчина заповедная», «Вечный свет Рождества», «Сретенские встречи» и фольклорно-этнографические абонементы «Вместе играем и поём, да старинушку Белгородскую узнаём», «Музыкальный фольклор Белгородчины», «Зимние святки на Белгородчине». Презентация этих программ состоялась на традиционных культурных мероприятиях города и области, ансамбль представил более 20 песен различных жанров, фрагменты из народной жизни и бытовые танцы.

Фольклорный ансамбль «Млада» является лауреатом и дипломантом престижных всероссийских и международных конкурсов, а также фестивалей народно-певческого искусства и исполнительства. Фольклорный ансамбль «Млада» неоднократно представлял уникальное народно-певческое искусство родного края на сценических площадках учреждений культуры и образования Белгородской области, где осуществил более 100 творческих выступлений. Аудиозапись музыкально-обрядового фольклора Белгородчины, осуществлённая ансамблем «Млада» в 2008 году, была удостоена II места во Всероссийском фестивале региональных радиопрограмм «Моя провинция» в городе Сочи.

На основании приказа управления культуры Белгородской области в 2013 году фольклорному ансамблю «Млада» было присвоено звание «Народный самодеятельный коллектив». В 2014 году ансамбль принял участие на VI Межрегиональном фестивале «Былина». Коллектив ежегодно принимает участие в фестивалях народных промыслов Белгородской области, например, «Маланья» и в межрегиональном фольклорном фестивале «Лето красное».

Официальнй диллер ЛАДА в Москве. LADA по выгодной цене

Официальный дилер Лада: продажа новых автомобилей ВАЗ на выгодных условиях. Кредит от 3.7%, скидки, трейд-ин. Комплектации и цены на LADA 2020-2021

Специальные предложения

«Семейный автомобиль» «Первый автомобиль»

Кредит по государственной программе «Семейный автомобиль»

Участники новой программы государственного субсидирования автомобилей «Семейный автомобиль» могут с дополнительной выгодой приобрести новый автомобиль Lada.

Получите дополнительную субсидию 10% от стоимости транспортного средства на внесение первоначального взноса при покупке новых автомобилей Lada Kalina, Lada Granta liftback, Lada Priora, Lada Vesta, Lada Vesta SW, Lada Vesta SW Cross, Lada Largus (все модификации), Lada 4×4 (все модификации)

Для кого?

Лицам, имеющим 2х и более детей.

Условия получения субсидии:

1. Водительское удостоверение;
2. Нет кредитов на авто в 2020 — 2021 году;
3. Лицам, имеющим 2х и более детей.

Кредит по государственной программе «Первый автомобиль»

Участники новой программы государственного субсидирования автомобилей «Первый автомобиль» могут с дополнительной выгодой приобрести новый автомобиль Lada.

Получите дополнительную субсидию 10% от стоимости транспортного средства на внесение первоначального взноса при покупке новых автомобилей Lada Kalina, Lada Granta liftback, Lada Priora, Lada Vesta, Lada Vesta SW Cross, Lada Largus (все модификации), Lada 4×4 (все модификации)

Для кого?

Лицам, которые никогда не владели автомобилем.

Условия получения субсидии:

1. Водительское удостоверение;
2. Нет кредитов на авто в 2020 — 2021 году;
3. Не было в собственности авто.

2011-2021 (c) ООО «Лада-МСК» − г. Москва, Варшавское шоссе, 172

Обращаем ваше внимание на то, что данный интернет-сайт носит исключительно информационный характер и ни при
каких условиях не является публичной офертой, определяемой положениями ч. 2 ст. 437 Гражданского кодекса
Российской Федерации. Цены на сайте представлены с учетом скидки на покупку автомобиля в кредит по
государственной программе льготного автокредитования и реализации Вашего автомобиля по системе trade in. Для получения подробной информации о стоимости автомобилей, пожалуйста, обращайтесь к менеджерам по продажам.

ООО «Русфинанс Банк», ген. лицензия ЦБ РФ №1792 от 13.02.2013

ООО «Лада М», Москва (ИНН 7726593201, ОГРН 1087746477422)

Добровольская Марина Анатольевна: добавлены сведения об ИНН руководителя 772600004653

Добавлены сведения об ИНН учредителя Добровольская Марина Анатольевна: 772600004653

Добавлены сведения о дополнительном виде деятельности: Деятельность по упаковыванию товаров (82. 92)

Добавлены сведения о дополнительном виде деятельности: Деятельность по письменному и устному переводу (74.3)

Добавлены сведения о дополнительном виде деятельности: Деятельность в области гидрометеорологии и смежных с ней областях, мониторинга состояния окружающей среды, ее загрязнения (71.12.5)

Добавлены сведения о дополнительном виде деятельности: Деятельность в области технического регулирования, стандартизации, метрологии, аккредитации, каталогизации продукции (71. 12.6)

Сравнение производительности mScarlet-I, mRuby3 и mCherry как акцепторов FRET для mNeonGreen

Abstract

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) стал чрезвычайно мощным инструментом для профилирования внутри- и межмолекулярных взаимодействий. Благодаря слиянию генетически кодируемых флуоресцентных белков (FP) исследователи смогли обнаружить олигомеризацию белков, активацию рецепторов и транслокацию белков среди других биофизических явлений. Недавно были разработаны два ярких мономерных красных флуоресцентных белка, mRuby3 и mScarlet-I.Эти белки обладают значительно улучшенными физическими свойствами по сравнению с предыдущими поколениями мономерных красных FP, что должно способствовать более широкому внедрению зеленого / красного FRET. Здесь мы оцениваем способность этих двух белков, наряду с mCherry, действовать в качестве акцептора FRET для яркого, мономерного, зелено-желтого FP mNeonGreen с использованием методов интенсивной FRET и 2-фотонной флуоресцентной микроскопии с визуализацией времени жизни (FLIM) FRET. Сначала мы определили, что mNeonGreen является стабильным донором для 2-фотонных экспериментов FLIM в различных условиях визуализации.Затем мы проверили способность красных FP действовать как акцепторы FRET, используя тандемную конструкцию mNeonGreen-Red FP. С помощью этих конструкций мы обнаружили, что mScarlet-I и mCherry способны эффективно использовать FRET с mNeonGreen в спектроскопии и FLIM FRET. Напротив, mNeonGreen и mRuby3 FRET с гораздо меньшей эффективностью, чем предсказано в тех же анализах. Мы исследуем возможные объяснения этой низкой производительности и определяем, что свойства созревания белка mRuby3 являются основным фактором. В целом, мы обнаружили, что mNeonGreen является отличным донором FRET, и mCherry и mScarlet-I, но не mRuby3, действуют как практические приемники FRET, причем более яркий mScarlet-I выполняет mCherry в интенсиометрических исследованиях, а mCherry выполняет mScarlet-I. в случаях, когда постоянная эффективность в популяции имеет решающее значение.

Образец цитирования: McCullock TW, MacLean DM, Kammermeier PJ (2020) Сравнение производительности mScarlet-I, mRuby3 и mCherry в качестве акцепторов FRET для mNeonGreen. PLoS ONE 15 (2): e0219886. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886

Редактор: Дегтяр Вадим Э., Калифорнийский университет в Беркли, США

Поступила: 3 июля 2019 г .; Принята к печати: 23 января 2020 г .; Опубликовано: 5 февраля 2020 г.

Авторские права: © 2020 McCullock et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Этот проект был поддержан Национальным институтом здравоохранения (https://www.nih.gov/), финансирующим R00NS094761, и премией Фонда молодых исследователей NARSAD (https: // www.bbrfoundation.org/grants-prizes/narsad-young-investigator-grants) Д.М.М. и Университет Рочестера (https://www.rochester.edu/) за промежуточное финансирование P.J.K .. T.W.M. была частично поддержана Фондом Джона Р. Мерлина Рочестерского университета. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Генетически кодируемые флуоресцентные белки (FP) обладают огромным прогрессом в базовой и трансляционной биологии.Начиная с клонирования зеленого FP Aequorea victoria [1], начались масштабные и постоянные усилия по увеличению количества доступных FP с различными физическими и спектральными свойствами. В настоящее время существует огромное разнообразие FP во всех частях видимого спектра и даже в некоторых частях ультрафиолетового и инфракрасного спектров. Эти новые белки были либо клонированы из других организмов [2–4], либо разработаны путем эволюции уже идентифицированных FP [4–11]. Этот постоянно расширяющийся каталог FP был рассмотрен другими [12–14], и были созданы новые усилия и архивы для организации этой информации, такие как база данных FPbase [15].

По мере расширения каталога FP увеличиваются и потенциальные применения. Особо следует отметить использование FP в качестве биосенсоров, которые могут измерять сигнальные события, клеточные метаболиты, pH, напряжение и многое другое [16]. Многие из этих биосенсоров используют Förster Resonance Energy Transfer (FRET) как часть своего механизма отчетности, производя изменение эмиссии акцептора при возбуждении донора, когда изменяется интересующее количество. FRET также зависит от ориентации и расстояния [17], что означает, что величина передачи энергии (описываемая как эффективность FRET) может использоваться для изучения либо устойчивого состояния, либо динамических изменений во взаимодействиях белков. Большая часть работы с использованием FP для FRET была выполнена с использованием пар Cyan / Yellow FP из-за их яркости, но эти белки страдают от большого перекрытия в их спектрах излучения, что делает интерпретацию результатов излишне сложной, среди других усложняющих факторов. Пары зеленого / красного FP предлагают большее разделение их спектров излучения, сохраняя при этом высокую степень спектрального перекрытия между излучением донора и поглощением акцептора, что обеспечивает эффективную передачу энергии. Зеленые / красные FP также имеют больший радиус Ферстера, чем большинство пар белков Cyan / Yellow, что позволяет использовать FRET на больших расстояниях.Возможность обнаружения FRET на больших расстояниях часто приводит к большему динамическому диапазону и чувствительности. Кроме того, клеточная токсичность для синего света была хорошо документирована в различных системах [18–22], что подчеркивает необходимость в лучших парах FRET с зеленым и красным смещением. Исторически сложилось так, что использование зеленого / красного FRET было ограничено из-за неблагоприятных флуоресцентных свойств красного белка [23–26], но сообщается, что несколько недавно разработанных мономерных красных флуоресцентных белков имеют улучшенное поглощение, яркость и стабильность, что указывает на то, что они могут действовать как высококачественный FRET. акцепторы для зеленых ФП.

Цель данного исследования — охарактеризовать эти недавно выпущенные красные FP как приемники FRET в надежде помочь более широкому распространению зеленого / красного FRET. Здесь мы исследуем способность красных FP следующего поколения, mRuby3 и mScarlet-I, а также mCherry действовать в качестве акцептора FRET для зелено-желтого донора FP mNeonGreen. mRuby3 [10] — новейшая итерация серии красных FP [8, 9] Ruby, первоначально разработанная на основе eqFP611 [3]. Серия красных FP mScarlet [11] была разработана из синтетической генной матрицы, основанной на нескольких встречающихся в природе красных FP.В результате этой стратегии были получены три мономерных красных FP: яркий вариант mScarlet, быстро созревающий вариант mScarlet-I и вариант с быстрым временем жизни mScarlet-H. Для этого исследования мы используем mScarlet-I из-за его быстрого созревания, так как более медленное созревание менее идеально для исследований слитых белков. mCherry [6], широко используемый мономерный красный FP, разработанный из DsRed [2], включен в это исследование в качестве стандарта. В качестве донорной молекулы мы выбрали mNeonGreen [4], невероятно яркий и стабильный зелено-желтый FP, полученный в результате мономеризации тетрамерного желтого флуоресцентного белка LanYFP [4].

Материалы и методы

Культивирование клеток и трансфекция

клеток HEK293A (ATCC; Манассас, Вирджиния) поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 1X GlutaMAX ^TM, 100 единиц / мл пенициллия, 100 мкг / мл стрептомицина (ThermoFisher Scientific; Waltham, MA) и 10 % термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (Atlas Biologicals; Fort Collins, CO). Чтобы вызвать экспрессию флуоресцентных белков, клетки временно трансфицировали с использованием трансфекции полиэтиенимином (PEI).Для всех трансфекций указанные количества ДНК и PEI смешивали вместе в среде DMEM, не содержащей добавок, в течение 30 минут перед добавлением к клеткам в указанный момент времени. Для экспериментов FLIM клетки высевали на покровные стекла номер 1 (Warner Instruments; Hamden, CT) в 12-луночные планшеты (Nest Scientific USA; Rahway, NJ) за 48 часов до экспериментов. Затем клетки трансфицировали за 24 часа до начала экспериментов с использованием 0,6 мкг кДНК для указанной конструкции и 1,6 мкг PEI в 1 мл среды.Для конфокальных экспериментов клетки высевали в пластиковые культуральные чашки диаметром 35 мм (Corning; Corning, NY) за 48–72 часа до экспериментов с последующей трансфекцией 1 мкг кДНК с использованием 2,4 мкг PEI в 2 мл среды за 24–36 часов. до начала визуализации. Для спектральных экспериментов по FRET и иммуноблоттингу клетки помещали в пластиковые чашки для культивирования 10 см и позволяли расти до 70% конфлюэнтности. Затем клетки трансфицировали 4 мкг кДНК с использованием 7,8 мкг PEI за 24 часа до начала экспериментов.

Плазмиды и клонирование

Все конструкции, используемые в этой рукописи, получены из плазмиды pKanCMV-mClover3-mRuby3 (плазмида № 74252), доступной на Addgene.org (Addgene; Уотертаун, Массачусетс). NG-mRuby3 был создан путем удаления mClover3 и всех, кроме последних 5 аминокислот линкера, из pKanCMV-mClover3-mRuby3 с помощью обратной ПЦР, и на его место была вставлена полная кодирующая последовательность mNeonGreen с помощью клонирования In-Fusion (Takara Bio; Mountain Вью, Калифорния). NG-mScarlet-I, NG-mScarlet и NG-mCherry были созданы путем удаления mRuby3 из NG-mRuby3 с помощью обратной ПЦР и вставки mScarlet-I, mScarlet или mCherry с использованием клонирования In-Fusion (Takara Bio). NG-Stop был создан с использованием того же продукта обратной ПЦР, что и NG-mScarlet-I и NG-mCherry, путем лигирования тупых концов с использованием NEBs KLD Mix (New England Biolabs; Ipswich, MA).NG-P2A-mRuby3 был получен из NG-mRuby3 с использованием обратной ПЦР и лигирования тупым концом для вставки последовательности P2A между линкером и mRuby3. Конструкцию mRuby3-GGSGG-NG получали с использованием мультифрагментной реакции In-Fusion с использованием продуктов ПЦР mRuby3 и mNeonGreen, где линкер GGSGG был присоединен к 3’-концу mRuby3 и 5’-концу продукта mNeonGreen с помощью ПЦР. mClover3-Stop получали удалением mRuby3 из вектора pKanCMV-mClover3-mRuby3 с помощью обратной ПЦР и последующего лигирования тупых концов.Аминокислотные последовательности для всех описанных здесь конструкций доступны в таблице S1. Ген mNeonGreen был получен из плазмиды pmNeonGreen-NT (Allele Biotechnology; Сан-Диего, Калифорния), ген mScarlet-I был получен из плазмиды Lck-mScarlet-I (Addgene, плазмида № 98821), и был получен ген mCherry. из плазмиды pmCherry-N1 (Takara Bio). Продукты реакции трансформировали, подвергали скринингу и амплифицировали в XL10-Gold Ultracompetent E . coli клеток (Agilent Technologies; Санта-Клара, Калифорния).Плазмиды выделяли с использованием набора E.Z.N.A Plasmid MiniPrep Kit (Omega Bio-teck; Norcross, Джорджия) или набора ZymoPure II Plasmid Midiprep Kit (Zymo Research; Ирвин, Калифорния) в соответствии с рекомендациями производителя. Все конструкции проверяли секвенированием по Сэнгеру (Eurofins Genomics; Louisville, KY) и хранили при концентрации 1 мкг / мкл в морозильной камере -20 ° C. Все плазмиды и конструкции, созданные для этой рукописи, можно бесплатно получить по запросу.

Spectral FRET

Для спектральных экспериментов FRET клетки использовали через 24–36 часов после трансфекции.Единственную 10-сантиметровую чашку с клетками, экспрессирующими интересующую конструкцию, промывали буфером для визуализации (136 мМ NaCl, 560 мкМ MgCl ₂, 4,7 мМ KCl, 1 мМ Na ₂ HPO ₄, 1,2 мМ CaCl ₂ , 10 мМ HEPES, 5,5 мМ глюкозы) несколько раз и осаждали. Затем осадок клеток ресуспендировали в 500 мкл буфера для визуализации и переносили в одноразовые акрилатные кюветы (Spectrocell Inc; Ореланд, Пенсильвания). Сканирование излучения проводилось при длине волны 490–750 нм с использованием длины волны возбуждения 470 нм с использованием флуоресцентного спектрофотометра Cary Eclipse (Agilent Technologies).Клетки ресуспендировали энергичным пипетированием непосредственно перед сканированием. Данные были собраны в программном пакете Cary Eclipse Scan Application (Agilent Technologies) и экспортированы в Microsoft Excel (Microsoft Corporation) для анализа. Чтобы оценить эффективность FRET по сканированию выбросов, линейное размешивание было выполнено в Igor Pro (WaveMetrics Inc; Lake Oswego, штат Орегон) с использованием сканирования только доноров и только акцепторов для определения вкладов донора и акцептора. Из-за высокого уровня согласованности между NG-Stop и зарегистрированным спектром для очищенного mNeonGreen (S1 Фиг.), Очищенный спектр mNeonGreen использовался только в качестве сканирования донора для линейного несмешивания.Для каждого из акцепторов были созданы индивидуальные сканирования только акцепторов на основе экспериментально собранных данных и их сообщенного очищенного спектра (как обсуждается на S1 Fig). Все необработанные сканы, используемые для спектрального FRET, доступны на S1 Fig. После определения веса донора и акцептора эффективность FRET была оценена с использованием следующего уравнения [27]: (1) где E — эффективность FRET, W _A и W _D — веса компонентов излучения только донора и только акцептора, рассчитанные посредством линейного несмешивания, а QY _A и QY _D — квантовый выход акцептора. и донор соответственно.

Флуоресцентная микроскопия для визуализации на весь срок службы (FLIM)

Для экспериментов FLIM клетки использовали через 1 день после трансфекции, если не указано иное. За 30 минут до начала экспериментов среду заменяли буфером для визуализации и давали нагреться до комнатной температуры. Покровные стекла переносили в специально изготовленную камеру и устанавливали на предметный столик многофотонного сканирующего конфокального микроскопа Olympus FluoView 1000-MP (Olympus; Токио, Япония). Возбуждение образцов достигалось с помощью фемтосекундного импульсного лазера Mai Tai Ti: Sapphire (Spectra-Physics; Санта-Клара, Калифорния), настроенного на 950 нм.Флуоресцентные затухания собирали с использованием водно-иммерсионного объектива XLPlan N 25x (NA 1,05) (Olympus) с разрешением 256×256 и временем пребывания пикселя 20 мкс. Данные передавались с помощью микроскопа на установку FLIM, состоящую из двух детекторов H7422P Hamamatsu (Hamamatsu; Hamamatsu City, Япония) и карты счета одиночных фотонов с временной корреляцией (Becker and Hickl; Берлин, Германия). Для разделения донорной и акцепторной эмиссии использовали дихроик BrightLine FF552-Bi02-25×36 (Semrock; Rochester, NY). Свет, испускаемый к детектору донора, дополнительно фильтровали с помощью фильтра BrightLine FF01-510 / 42-25, а излучение к детектору акцептора фильтровали с помощью фильтра BrightLine FF01-609 / 54-25 (Semrock).Микроскоп управлялся с помощью программного пакета FV10-ASW (Olympus), а система FLIM контролировалась с помощью программного пакета VistaVision от ISS (ISS Inc; Шампейн, Иллинойс). Анализ уменьшения времени жизни отдельных ячеек был выполнен с помощью VistaVision на ISS, а последующие времена жизни были проанализированы в Microsoft Excel (Microsoft Corporation; Редмонд, Вашингтон). Вкратце, клетки были изолированы в отдельные интересующие области (ROI), и данные о распаде для каждого пикселя в области выше порога суммировались для создания кривой затухания флуоресценции клеток.Затем эти кривые затухания были подогнаны, и времена жизни были извлечены с использованием нелинейной регрессии в режиме подгонки хвоста. Почти все кривые затухания были хорошо описаны с помощью одной экспоненциальной аппроксимации (как было определено с помощью анализа хи-квадрат, а также на глаз). Срок службы был извлечен из этих подгонок и использован для расчета эффективности FRET с использованием следующего уравнения [28]: (2)

Где E — эффективность FRET, 𝜏 _DA — время жизни донора в присутствии акцептора, а 𝜏 _D — время жизни только частиц донора (в данном случае среднее время жизни NG-Stop). .Для экспериментов, в которых было предварительно проведено фотообесцвечивание акцептора, клетки отбеливали сканированием лазером с длиной волны 559 нм при 100% мощности в течение 15 минут при тех же параметрах, что и данные о времени жизни.

Конфокальная микроскопия

Для экспериментов с конфокальной микроскопией клетки использовали через 1 день после трансфекции. За 30 минут до начала экспериментов среду заменяли буфером для визуализации и давали нагреться до комнатной температуры. Затем изображения были собраны на том же микроскопе, что и данные FLIM, с использованием сканера SIM и обычных лазерных линий 488 нм и 559 нм.Конфокальные изображения с широким полем были получены с помощью водно-иммерсионного объектива XLUMPlanFl 20X (NA 0,95) (Olympus) с разрешением 2048×2048. Образец возбуждался, и излучение собиралось в каждом канале индивидуально, чтобы предотвратить просачивание. Зеленое излучение собирали через фильтр 505–540 нм, а красное излучение собирали через фильтр 575–675 нм. Все параметры визуализации поддерживались согласованными во всех экспериментах, чтобы облегчить сравнение. Данные были собраны в программном пакете FV10-ASW (Olympus) и экспортированы в программный пакет Fiji [29] для анализа, как описано в основном тексте и S3 Fig, с использованием плагина Coloc2.

Иммуноблоттинг

Образцы для иммуноблоттинга собирали через 24 часа после трансфекции. Клетки удаляли из чашки для культивирования и дважды промывали DPBS, не содержащим кальция и магния (Corning). После клеточного лизиса в присутствии ингибиторов протеазы концентрацию белка оценивали с использованием набора Pierce ^TM BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher Scientific), и 10 мкг общего белка загружали в 16% гель SDS-PAGE. После электрофореза белки переводили в 0.Нитроцеллюлозная мембрана 2 мкм (BioRad; Hercules, CA). Присутствие белка mNeonGreen проверяли с помощью моноклонального мышиного антитела против mNeonGreen [32F6] (Chromotek; Planegg-Martinsried, Германия) в разведении 1: 1000 и визуализировали с использованием вторичного антитела осла против мышиного IgG DyLight 680 (ThermoFisher Scientific). при разведении 1: 5000. Эту же мембрану дополнительно исследовали на наличие mClover3 с использованием кроличьих антител против GFP (ThermoFisher Scientific, A11122) в разведении 1: 1000 и визуализировали с помощью вторичных антител козьего анти-кроличьего IgG DyLight 800 (ThermoFisher Scientific) при 1 : 10000 разведение.Обнаружение было выполнено с использованием системы визуализации Odyssey 3 (Li-cor Biosciences; Lincoln, NE).

Статистика

Чтобы избежать предположений относительно распределения данных, вся статистическая значимость в этой рукописи была определена с помощью теста перестановок, реализованного с помощью специального скрипта Python с использованием библиотеки MLxtend [30] с использованием метода аппроксимации с 1 000 000 перестановок. Для случаев, когда между двумя сравниваемыми наборами данных было меньше 10 точек данных, использовался точный метод.

Результаты

Физические свойства и спектр белков в этом исследовании

Для этого исследования мы использовали мономерный желто-зеленый флуоресцентный белок mNeonGreen, чтобы проверить способность двух новых красных флуоресцентных белков, mRuby3 и mScarlet-I, а также mCherry действовать как акцепторы FRET. Флуоресцентные и физические свойства этих белков перечислены в таблице 1. mNeonGreen — один из самых ярких флуоресцентных белков на сегодняшний день с высоким квантовым выходом и коэффициентом экстинкции, благодаря чему его сигналы легко наблюдать.Кроме того, mNeonGreen также обладает высокой фотостабильностью [4] и быстро созревает, что делает его идеальным донором FRET. И mRuby3, и mScarlet-I имеют высокие коэффициенты экстинкции, что делает их отличными приемниками FRET. По сравнению с mCherry, эти белки также предлагают значительно более высокий квантовый выход, что указывает на то, что будет легче обнаруживать события передачи энергии, используя испускание одного из этих двух белков. Спектр поглощения и излучения mNeonGreen накладывается на спектр mRuby3, mScarlet-I и mCherry на рис. 1A – 1C.Для каждого красного флуоресцентного белка значения интеграла перекрытия (J (λ)) и радиуса Ферстера (R ₀) с mNeonGreen перечислены в таблице 1. На основе этих фотофизических свойств ожидается, что все три красных FP будут FRET с mNeonGreen. Предполагая идентичное расположение между донором и акцептором, ожидается, что mRuby3 обеспечит наивысшую эффективность FRET, а mCherry — самую низкую эффективность FRET с mNeonGreen.

Рис. 1. Спектр mNeonGreen, mRuby3, mScarlet-I и mCherry.

Абсорбция (пунктирные линии) и спектр излучения (сплошные линии) очищенного mNeonGreen (зеленые линии), наложенные на спектр очищенного mRuby3 (A) , mScarlet-I (B) и mCherry (C) .Спектры были получены из эталона, указанного в таблице 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g001

тандемные конструкции mNeonGreen-RFP показывают низкую производительность mRuby3

Чтобы проверить способность красных FP действовать как акцепторы FRET, мы сконструировали тандемные конструкции FP, состоящие из полной кодирующей последовательности mNeonGreen (NG), за которой следует короткий аминокислотный линкер (SGLSKGEE), а затем полная кодирующая последовательность красного FP (рис. 2A с аминокислотными последовательностями, доступными в таблице S1 в дополнительной информации).Хотя линкер из 8 аминокислот является относительно коротким, включение полного c-конца mNeonGreen (который кажется неструктурированным или отсутствует в структуре mNeonGreen [31]) создает эффективный линкер из 17 аминокислот. Также была создана конструкция mNeonGreen-Stop, которая содержит полную кодирующую последовательность mNeonGreen, линкер из 8 аминокислот, а затем стоп-кодон, действующий как донорская контрольная конструкция. Чтобы определить, будет ли mNeonGreen FRET с красными FP в этих конструкциях, мы временно трансфицировали каждую конструкцию в клетки HEK293 и измерили эмиссию акцепторного FP при возбуждении с длиной волны, которая будет возбуждать только донора.Когда клетки, экспрессирующие конструкции NG-Stop, возбуждались светом с длиной волны 470 нм, был получен спектр, сравнимый с тем, что сообщалось для очищенного mNeonGreen (рис. 2В, рис. S1 в дополнительной информации). При анализе тандемных конструкций NG-красный FP появляется второй пик, соответствующий красному FP. Примерный спектр для конструкций NG-mRuby3, NG-mScarlet-I и NG-mCherry показан на рис. 2C, 2D и 2E, соответственно, розовым цветом, вместе с рассчитанными донорными (зеленый) и акцепторными компонентами (красный), определенными посредством линейного несмешивания, а также соответствие (черная пунктирная линия), полученное при добавлении рассчитанных донорных и акцепторных компонентов.Обратите внимание, что во всех случаях подгонка без микширования точно воспроизводила следы необработанных данных. Используя донорные и акцепторные компоненты, эффективность FRET каждой конструкции можно оценить с помощью уравнения. 1 (Рис. 2F, с необработанными кривыми, доступными на S1 Рис.). При трех независимых трансфекциях для каждой конструкции конструкция NG-mScarlet-I и NG-mCherry продемонстрировала эффективность FRET 29 ± 0,5% и 22 ± 0,8% соответственно. Удивительно, но конструкция NG-mRuby3 показала оценочную эффективность FRET в 16 ± 0,1%.Такая низкая производительность по сравнению с NG-mScarlet-I или NG-mCherry была весьма неожиданной, учитывая физические и спектральные свойства, указанные для mRuby3 [10], которые предсказывали, что он будет лучшим акцептором FRET из трех красных FP для mNeonGreen.

Рис. 2. Спектральный FRET каждой тандемной конструкции mNeonGreen-Red FP.

(A) Мультяшная схема тандемных конструкций mNeonGreen-Red FP, используемых для экспериментов FRET. (B) Сканирование среднего излучения клеток, экспрессирующих NG-Stop (черный) при возбуждении при 470 нм, наложенное на представленный спектр очищенного mNeonGreen зеленого цвета (n = 3 независимых трансфекции).Пример необработанного спектра излучения (розовый) тандема (C) NG-mRuby3, (D) NG-mScarlet-I и (E) NG-mCherry при возбуждении на длине волны 470 нм. Пунктирная черная линия показывает сумму донорного (зеленого) и акцепторного (красный) компонентов, вычисленную путем линейного несмешивания. (F) Эффективности FRET, рассчитанные из спектра для каждой конструкции (n = 3). *** = P <0,0005 между указанными условиями.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g002

mNeonGreen — подходящий донор для двухфотонного FLIM

Чтобы подтвердить наши спектральные результаты FRET, мы обратились к более точному методу 2-Photon Fluorescent Lifetime Imaging (FLIM). Сначала мы попытались определить, является ли mNeonGreen подходящим донором для экспериментов с 2-фотонным FLIM. Донор FRET с хорошим поведением мог бы легко возбуждаться двухфотонным лазером, быть стабильным при различных мощностях двухфотонного лазера и демонстрировать стабильное моноэкспоненциальное время жизни [32]. Насколько нам известно, существует только один отчет о производительности mNeonGreen с использованием двухфотонного освещения [33].Это исследование продемонстрировало, что флуоресцентные белки с синим смещением имеют тенденцию работать лучше при двухфотонном возбуждении, чем более желтые флуоресцентные белки со смещением, но не исключили возможность использования mNeonGreen в двухфотонных исследованиях. Используя свет с длиной волны 950 нм и конструкцию NG-Stop, мы оценили эффективность mNeonGreen в 2-фотонном FLIM в различных условиях, используя коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов. При различных мощностях лазера mNeonGreen обеспечивает стабильный срок службы 3,05 ± 0,01 нс в течение 50 кадров сбора данных (рис. 3A).Этот срок службы был стабильным до 300 кадров сбора данных для всех, кроме самой высокой протестированной мощности лазера, 25 Вт / см ², в которой время жизни линейно уменьшалось до 87 ± 4,5% от исходного значения после 300 кадров (рис. 3B). Напротив, значительное фотообесцвечивание наблюдалось при мощности лазера выше 15 Вт / см. ² (рис. 3C) с обесцвечиванием 20 Вт / см ² и 25 Вт / см. ² примерно 48 ± 14% и 94 ± 3% интенсивность образца соответственно через 300 кадров. Примеры следов распада одной ячейки, собранные в последовательных интервалах из 50 кадров, показаны при 15 Вт / см ² (рис. 3D) и 25 Вт / см ² (рис. 3E).Нормализация следов затухания к пиковой интенсивности для примера с 25 Вт / см ² демонстрирует сокращение срока службы и ухудшение качества данных в процессе сбора данных на этой мощности (рис. 2F). Чтобы служить в качестве сравнения, мы повторили эти эксперименты с использованием EGFP (S2 рис). EGFP обеспечивает стабильный срок службы 2,63 ± 0,01 нс при различных мощностях лазера. Подобно mNeonGreen, этот срок службы был стабильным для 300 кадров захвата для каждой мощности лазера, отличной от 25 Вт / см ².Кроме того, уровни мощности выше 15 Вт / см ² также вызывали значительное фотообесцвечивание более 300 кадров, хотя и в меньшей степени, чем то, что наблюдалось с mNeonGreen (S2 Рис). Учитывая эти данные, мы пришли к выводу, что mNeonGreen является подходящим донором для двухфотонных экспериментов FLIM, когда время жизни достигается при мощности лазера 15 Вт / см ² или меньше. Для всех дальнейших экспериментов FLIM данные собирались при мощности лазера 5–10 Вт / см ² для 100–150 кадров в зависимости от яркости кюветы.

Рис. 3. mNeonGreen хорошо работает при различных мощностях лазера для двухфотонной съемки FLIM во временной области.

(A) Данные о продолжительности жизни, собранные для отдельных клеток HEK293, экспрессирующих цитозольный mNeonGreen при различной мощности лазера до 25 Вт / см ² после 50 кадров. Черные полосы указывают средний доверительный интервал ± 95%. (B) Lifetime и (C) интенсивности образцов, снятых на протяжении 300 кадров при различной мощности лазера. * = P <0,05, ** = P <0.005, и *** = P <0,0005 по сравнению с кадром, сопоставленным с набором данных 5 Вт / см ². N для каждого образца составляет 5 Вт / см ²: 11 ячеек, 10 Вт / см ²: 10 ячеек, 15 Вт / см ²: 14 ячеек, 20 Вт / см ²: 9 ячеек, 25 Вт / см ²: 11 ячеек. (D) Пример кривых спада времени жизни, полученных при 15 Вт / см ² на 300 кадрах. (E) Пример спада времени жизни и нормализованного спада (F) , полученного при 25 Вт / см ² на 300 кадрах.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g003

Измерения FLIM-FRET подтверждают плохую работу mRuby3

При использовании FLIM FRET определяется как уменьшение времени жизни донора в присутствии акцептора [28]. Этот метод имеет преимущество определения состояния FRET между mNeonGreen и красным FP независимо от излучения красных FP, что позволяет нам определять эффективность FRET для каждой конструкции без необходимости учитывать различия между каждым красным FP.В ходе нескольких независимых трансфекций конструкция mNG-Stop продуцировала только донорское время жизни 3,05 ± 0,02 нс (фиг. 4A). Когда mScarlet-I или mCherry присутствуют в тандемах, время жизни mNeonGreen сокращается до 2,22 ± 0,06 нс и 2,23 ± 0,03 нс соответственно (рис. 4A). Это приводит к эффективности FRET конструкции NG-mScarlet-I 27 ± 2% и эффективности 27 ± 1% для конструкции NG-mCherry (рис. 4B). Анализ конструкции NG-mRuby3 показывает даже худшую производительность mRuby3, чем то, что было оценено с помощью спектрального FRET (рис. 2F).Среднее время жизни конструкции NG-mRuby3 составляло 2,92 ± 0,03 нс (рис. 4A), в результате чего эффективность FRET составляла всего 4 ± 0,9% (рис. 4B). Действительно, 35 клеток после 3 независимых трансфекций (более половины всех отобранных клеток) продемонстрировали время жизни в диапазоне от того, что было собрано для конструкции NG-Stop, тогда как ни у одной клетки, экспрессирующей NG-mScarlet-I или NG-mCherry, время жизни не было в пределах этого диапазона. (Рис. 4A). Примерные кривые распада, представляющие среднее значение для каждой конструкции, показаны на фиг. 4C, а примерные карты времени жизни клеток HEK293, экспрессирующих каждую конструкцию, показаны на фиг. 4D.

Рис. 4. Время жизни тандемных конструкций mNeonGreen-Red FP.

(A) Время жизни mNeonGreen в индивидуальных клетках, экспрессирующих тандемную конструкцию слияния mNeonGreen-красный белок. Черные полосы указывают средний доверительный интервал ± 95%. (B) Расчеты эффективности FRET для каждой тандемной конструкции. *** = P <0,0005 по сравнению с NG-Stop, а # означает P <0,0005 по сравнению с NG-Stop и P <0,0005 по сравнению с NG-mRuby3. NG-mScarlet-I и NG-mCherry статистически не различаются (P = 0.75) (C) Пример кривых распада для каждого тандема, представляющий среднее время жизни всех клеток для каждой конструкции. (D) Пример тепловой карты срока службы для одного кадра для каждой конструкции. N для каждой конструкции имеет следующий вид: NG-Stop: 68 клеток, NG-mRuby3: 63 клетки, NG-mScarlet-I: 64 клетки и NG-mCherry: 64 клетки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g004

Конфокальная визуализация демонстрирует более низкую, чем ожидалось, красную флуоресценцию для конструкции mNeonGreen-mRuby3

Для дальнейшего исследования плохой работы mRuby3 как акцептора FRET мы обратились к конфокальной микроскопии, чтобы проанализировать поведение каждой тандемной конструкции.Присутствие mNeonGreen и красных FP было независимо исследовано путем последовательного возбуждения лазерами 488 нм и 559 нм, при этом излучения каждого канала собирались отдельно для предотвращения просачивания. Примеры изображений с широким полем клеток, экспрессирующих каждую конструкцию, показаны на фиг. 5A. Качественно на объединенном изображении зеленого и красного каналов можно увидеть, что клетки, экспрессирующие конструкцию NG-mRuby3, имели широко варьирующуюся интенсивность зеленой и красной флуоресценции. Интересно, что регулярно наблюдались клетки, которые, по-видимому, содержат высокие уровни mNeonGreen и низкие уровни mRuby3 или наоборот, наряду с клетками, которые, по-видимому, содержат оба белка.Эта неоднородность также была отмечена в конструкциях NG-mScarlet-I и NG-mCherry, но с гораздо меньшей частотой (рис. 5A). Этот результат был довольно неожиданным, учитывая, что конструкции были разработаны для экспрессии mNeonGreen и красного FP стехиометрически и в тандеме. Теоретически можно ожидать, что выражение таких тандемных конструкций приведет к фиксированному отношению интенсивности зеленого к красному, где интенсивность красного изменяется в зависимости от яркости красного FP, а интенсивность зеленого изменяется из-за изменений в степени FRET.Чтобы проверить это предсказание и количественно оценить неоднородность для каждой конструкции, мы исследовали интересующие области (ROI), содержащие одну ячейку, извлекли интенсивности зеленого и красного для этой ячейки после вычитания фона и построили полученные интенсивности на уровне пикселей. Затем полученные зелено-красные графики интенсивности для каждой ячейки были подогнаны с помощью линейной регрессии. Пример этого рабочего процесса показан на рис. S3. Хотя абсолютное значение этого наклона будет различным для каждой пары флуорофоров и для разных условий визуализации, изменения этого наклона от клетки к клетке в одних и тех же условиях визуализации будут указывать на неоднородность каждая конструкция.Как и ожидалось от тандемной конструкции и на основе качественных оценок изображений (рис. 5A), гистограммы наклонов для отдельных клеток, экспрессирующих конструкции NG-mCherry и NG-mScarlet-I, показали разумное распределение и узкий разброс наклонов (рис. 5C и 5D). Это указывает на то, что большинство клеток, экспрессирующих эти конструкции, содержат фиксированное соотношение mNeonGreen к красному FP. Напротив, гистограмма наклонов для клеток, экспрессирующих NG-mRuby3, не была столь равномерно распределена (фиг. 5B). Действительно, большинство клеток, экспрессирующих эту конструкцию, имеют наклон, близкий к 0, предполагая, что эти клетки содержат измеримые уровни mNeonGreen, но низкие уровни флуоресцентного mRuby3.Интересно, что это отсутствие обильной красной флуоресценции не происходит из-за недостатка белка mRuby3, поскольку вестерн-блоттинг клеток, трансфицированных NG-mRuby3, дает такую же картину полос, как и клетки, трансфицированные NG-mScarlet-I и NG-mCherry (S4 Фиг.). Важно отметить, что в клетках, трансфицированных NG-mRuby3, нет полосы меньшего размера мономера, что указывает на то, что наши тандемные конструкции, как правило, не повреждены и исключает возможность производства mNeonGreen без mRuby3. Взятые вместе, эти данные обеспечивают механистическое объяснение наших данных FLIM, в которых все клетки, экспрессирующие конструкции NG-mScarlet-I и NG-mCherry, демонстрируют устойчивый FRET, тогда как подавляющее большинство конструкций NG-mRuby3 — нет.Кроме того, они предполагают, что низкая производительность NG-mRuby3 может быть связана с плохим созреванием акцептора по сравнению с NG-mScarlet-I и даже NG-mCherry.

Рис. 5. Конфокальная микроскопия тандемных конструкций.

(A) Примеры изображений конструкций NG-Red FP при прямом возбуждении лазерами с длиной волны 499 нм или 559 нм. Гистограммы наклонов корреляций интенсивности красного / зеленого для отдельных клеток, экспрессирующих (B), NG-mRuby3 (n = 1077 клеток), (C), NG-mScarlet-I (n = 1745 клеток) и ( D) NG-mCherry (n = 1557 клеток).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g005

mRuby3 демонстрирует поведение, аналогичное в нескольких конфигурациях, и поведение, подобное медленно созревающему варианту mScarlet

Чтобы лучше определить, является ли поведение mRuby3 специфическим для нашей системы или присуще самому mRuby3, мы разработали несколько дополнительных тандемных конструкций. Во-первых, мы поменяли местами ориентацию тандема, чтобы увидеть, является ли mRuby3 более толерантным к с-концевым слияниям, и заменили линкер на глицин-сериновый линкер немного меньшего размера (GGSGG).Эта конструкция mRuby3-GGSGG-NG преформирована аналогично исходной конструкции NG-mRuby3, давая среднее время жизни 2,96 ± 0,02 нс (фиг. 6A), что соответствует эффективности FRET 4 ± 1% (фиг. 6B). Конфокальный анализ этой конструкции (рис. 6C и 6D) также выявляет фенотип, аналогичный NG-mRuby3, где большинство клеток имеют наклон, близкий к 0, что указывает на то, что большинство клеток имеют детектируемую флуоресценцию mNeonGreen, но не имеют флуоресценции mRuby3. Затем мы вставили оптимизированную пептидную последовательность самосплайсинга (пептид P2A) [34] между NG и mRuby3 в конструкции NG-Ruby3.Эта последовательность вызывает событие пропуска рибосомы во время трансляции, которое приведет к высвобождению полипептида NG из рибосомы во время трансляции, прежде чем повторно инициировать трансляцию части конструкции mRuby3, в результате чего два отдельных белка транслируются с одного и того же транскрипта. Примечательно, что мы сконструировали конструкцию так, чтобы большая часть дополнительной пептидной последовательности P2A была присоединена к NG, с единственным добавлением к mRuby3, являющимся N-концевым пролином после успешного расщепления. Клетки, экспрессирующие NG-P2A-mRuby3, имели среднее время жизни 3.09 ± 0,01 нс (фиг. 6A), и время жизни было статистически неотличимо от времени жизни клеток, экспрессирующих NG-Stop, собранных в тот же день. Этот результат ожидался, поскольку NG и mRuby3 в этих клетках больше не должны быть связаны друг с другом, и действительно, вестерн-блот-анализ этой конструкции подтверждает, что пептид P2A расщепляется с высокой эффективностью (S4 фиг.). К сожалению, хотя эта конструкция показывает только незначительные улучшения в поведении mRuby3, как определено конфокальным анализом (рис. 6C и 6E), который по-прежнему показывает высокую долю клеток с почти нулевым наклоном, но также показывает вторичный, ненулевой пик.

Рис. 6. Поведение отдельных тандемных конструкций, содержащих mRuby3 и mScarlet.

(A) Время жизни отдельного набора экспрессирующих NG-Stop клеток со временем жизни 2 новых тандемных конструкций, содержащих mRuby3, и конструкции, содержащей mScarlet. Черные полосы указывают средний доверительный интервал ± 95%. *** = P <0,0005 по сравнению с NG-Stop. NG-Stop и NG-P2A-mRuby3 статистически не различаются (P = 0,65). N для измерения времени жизни каждой конструкции имеет следующий вид: NG-Stop: 64 клетки, mRuby3-GGSGG-NG: 66 клеток, NG-P2A-mRuby3: 69 клеток и NG-mScarlet: 77 клеток. (B) Средняя эффективность FRET для каждой из новых тандемных конструкций. (C) Пример слияния конфокальных изображений клеток HEK293, экспрессирующих каждую из новых тандемных конструкций. Объединенные гистограммы наклонов клеток, экспрессирующих (D) mRuby3-GGSGG-NG, (E) NG-P2A-mRuby3 и (F) NG-mScarlet. N для конфокальных измерений каждой конструкции имеет следующий вид: mRuby3-GGSGG-NG: 2302 клеток, NG-P2A-mRuby3: 1548 клеток и NG-mScarlet: 1150 клеток.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0219886.g006

В то время как mScarlet-I и mCherry созревают с периодом полураспада 36 и 15 минут соответственно, mRuby3, как сообщается, имеет полупериод созревания 136,5 минут. Чтобы проверить, может ли большая разница во времени созревания привести к фенотипу, который мы видим для mRuby3, мы мутировали mScarlet-I в тандеме NG-Scarlet-I в яркий, но медленно созревающий вариант Scarlet, mScarlet, введя мутацию I74T. Сообщается, что этот медленно созревающий вариант имеет период полувыведения 132.4 минуты в тех же условиях, что и измерения созревания mRuby3. Клетки, экспрессирующие NG-mScarlet, характеризовались сильно варьирующимся временем жизни, составляющим в среднем 2,67 ± 0,05 нс, что приводило к средней эффективности FRET 13 ± 2% (фиг. 6A и 6B). В конфокальном режиме клетки, экспрессирующие этот NG-Scarlet, также демонстрируют гетерогенный фенотип (рис. 6C), но большинство клеток демонстрируют ненулевой наклон, указывающий на то, что большинство клеток демонстрируют как зеленую, так и красную флуоресценцию (рис. 6F).

Наконец, мы обратились к анализу поведения mRuby3 с помощью эволюционно отличного зеленого FP, mClover3.Используя тандемную конструкцию mClover3-mRuby3, доступную от Addgene, мы создали конструкцию mClover3-Stop, которая служит только контролем донора, и проанализировали способность mRuby3 действовать как акцептор для mClover3 с помощью FLIM. В дополнение к использованию другого зеленого FP, эта конструкция также использует линкер из 12 аминокислот, а не эффективные линкеры из 17 или 15 аминокислот, которые мы использовали до сих пор (таблица S1). Клетки, экспрессирующие mClover3-Stop, демонстрируют стабильное моноэкспоненциальное время жизни 3,11 ± 0,01 нс (S5 фиг.).Когда mRuby3 присутствует в конструкции, чтобы действовать как акцептор, это время жизни сокращается в среднем до 2,81 ± 0,05 нс (S5 Рис.). Это приводит к средней эффективности FRET 10 ± 2%. Также стоит отметить, что, как и NG-mScarlet, mClover3-mRuby3 имеет большой диапазон времени жизни. Учитывая, что спектральные и физические свойства mClover3 очень похожи на mNeonGreen, это, по-видимому, указывает на небольшое улучшение производительности mRuby3, либо из-за линкера сортировщика, либо из-за включения mClover3 вместо mNeonGreen.Несмотря на это, по-прежнему наблюдается высокая гетерогенность в выражении этого тандема (S5 Fig), что указывает на то, что основные проблемы с mRuby3 все еще присутствуют.

Экспрессия mNeonGreen-mRuby3 в течение более длительных периодов времени улучшает его производительность

Наши предыдущие данные показали, что плохие акцепторные свойства mRuby3 частично могут быть связаны с неэффективным созреванием. Чтобы проверить это в дальнейшем, мы провели эксперименты FLIM в течение пяти дней после временной трансфекции конструкцией NG-mRuby3.Как видно на фиг. 7A, среднее время жизни mNeonGreen в конструкции NG-mRuby3 снижается с 2,92 ± 0,03 нс через 1 день после трансфекции (DPT) до 2,41 ± 0,09 нс 5 DPT. Это приводит к изменению средней эффективности FRET с 4 ± 0,9% 1 DPT до эффективности 21 ± 3% эффективности 5 DPT трансфекции (рис. 7B). Примеры карт продолжительности жизни отдельных клеток, экспрессирующих NG-mRuby3 2–5 DPT, показаны на фиг. 7C, а примерная карта продолжительности жизни для 1 DPT показана на фиг. 4D. Примеры флуоресцентных кривых затухания для каждой DPT доступны на S6 Рис.С течением времени количество ячеек, показывающих время жизни в пределах диапазона NG-Stop, также уменьшалось. Однако можно было наблюдать даже 5 клеток DPT, у которых время жизни донора было примерно таким же, как у них. Это указывает на то, что хотя неэффективное созревание в клетках млекопитающих может быть частью причины плохой работы mRuby3 в предыдущих экспериментах, это, вероятно, не единственный способствующий фактор. Чтобы гарантировать, что изменения, наблюдаемые с течением времени для конструкции NG-mRuby3, были вызваны изменениями, происходящими с белком mRuby3, а не с mNeonGreen, время жизни mNeonGreen конструкций NG-mRuby3 определяли до и после фотообесцвечивания акцептора на 5 DPT (рис. 7D). .Независимо от продолжительности жизни каждой клетки до фотообесцвечивания акцептора, все клетки показали время жизни, аналогичное времени жизни конструкции NG-Stop после фотообесцвечивания акцептора. Фиг. 7F показывает примерные карты времени жизни двух клеток, экспрессирующих NG-mRuby3, через 5 дней после трансфекции до и после фотообесцвечивания акцептора, а примерные следы флуоресцентного распада можно найти на фиг. S6. Эти результаты демонстрируют, что время жизни mNeonGreen оставалось стабильным в течение 5 дней. это указывает на то, что изменения, которые претерпела конструкция NG-mRuby3, были вызваны изменениями, происходящими с белком mRuby3.

Рис. 7. FRET NG-mRuby3 через 1–5 дней после трансфекции.

(A) Время жизни клеток, экспрессирующих конструкцию NG-mRuby3, через 1–5 дней после трансфекции (DPT) 1 DPT реплицируется с фиг. 3A для справки. Черные полосы указывают средний срок службы ± 95% доверительный интервал. Зеленая заливка указывает диапазон продолжительности жизни, наблюдаемый для конструкции NG-Stop. *** = P <0,0005 по сравнению с 1 DPT, и # = P <0,0005 по сравнению с 1 DPT и P <0,0005 по сравнению с днем ранее.N для каждого условия выглядит следующим образом: 2 DPT: 30 ячеек, 3 DPT: 34 ячейки, 4 DPT: 35 ячеек и 5 DPT: 31 ячейка. (B) Средняя эффективность FRET для NG-mRuby3 1–5 DPT. (C) Примеры карт продолжительности жизни, собранные каждый день тестирования. (D) Данные о времени жизни клеток, экспрессирующих NG-mRuby3, через 5 дней после трансфекции до и после фотообесцвечивания акцептора (n = 15). *** = P <0,0005 после фотообесцвечивания по сравнению с до фотообесцвечивания. (E) Примеры карт продолжительности жизни одних и тех же клеток до и после фотообесцвечивания акцепторов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.g007

Обсуждение

Разработка и проверка ярких мономерных пар зеленый / красный FP значительно увеличит общее распространение зеленого / красного FRET. Яркие флуорофоры упрощают обнаружение и повышают соотношение сигнал / шум. Использование зеленого и красного флуорофоров имеет несколько явных преимуществ, включая снижение токсичности источника возбуждения, большее спектральное разделение, большие радиусы Ферстера и лучшую проницаемость тканей для длин волн возбуждения и излучения.Эти преимущества позволяют проводить более новые, более точные и точные исследования с меньшим количеством вмешивающихся факторов, чем то, что можно было бы сделать с парами FRET голубой / желтый. mNeonGreen — идеальный донор для экспериментов Green / Red FRET. Его спектр возбуждения и излучения со смещением желтого цвета обеспечивает высокую степень перекрытия с красными FP, а также может возбуждаться синим светом с меньшей энергией, чем голубой, или более смещенным синим зеленым светом FP. Кроме того, mNeonGreen необычайно яркий при однофотонном освещении, что делает его сигналы удобными для наблюдения.Сообщается, что как mScarlet-I, так и mRuby3 имеют одни из самых высоких коэффициентов экстинкции среди всех красных FP, а также являются одними из самых ярких мономерных красных FP на сегодняшний день. Эти факты указывают на то, что из них должны получиться отличные акцепторы FRET, что сделает зеленый / красный FRET более доступным для исследователей. В этом исследовании мы стремились проверить это предсказание с помощью различных оптических методов.

Мы протестировали способность этих двух новых красных FP — mRuby3 и mScarlet-I — вместе с mCherry действовать как акцепторы FRET для mNeonGreen, используя подход тандемных белков.Первоначально мы использовали интенсиометрический спектральный FRET для оценки эффективности FRET между mNeonGreen и красными FP (рис. 2). В этом анализе NG-mScarlet-I продемонстрировал самую высокую эффективность FRET, за ним следовали NG-mCherry, а затем NG-mRuby3 (рис. 2F). Это было удивительно, учитывая, что сообщаемые свойства mRuby3 предсказывают, что он будет лучшим акцептором для mNeonGreen. В частности, mRuby3 имел самую высокую степень перекрытия между его спектром возбуждения и спектром излучения mNeonGreen, и он имеет самый высокий коэффициент экстинкции из трех красных FP в этом исследовании (таблица 1).Эти эксперименты также продемонстрировали преимущества этих новых белков по сравнению с mCherry, поскольку mScarlet-I производил почти в 3 раза больше интенсивности, чем mCherry, несмотря только на 7% разницу в оценочной эффективности, а mRuby3 производил почти в 1,5 раза больше интенсивности mCherry, несмотря на NG- mRuby3 демонстрирует более низкую эффективность FRET, чем NG-mCherry. Это отражает разницу в коэффициенте экстинкции и квантовом выходе между этими двумя белками и mCherry и демонстрирует, как mScarlet-I является лучшим общим акцептором, который будет обеспечивать больший сигнал и больший динамический диапазон для интенсивных экспериментов FRET на основе зеленого-красного.

Чтобы подтвердить эти результаты, мы обратились к более точной методике FLIM. Преимущество FLIM состоит в том, что необходимо наблюдать только за донором, что устраняет необходимость корректировать наши данные с учетом различий в физических свойствах акцепторов, о которых сообщают другие. Кроме того, наша установка FLIM позволяет анализировать отдельные клетки, чтобы получить более подробный профиль поведения тандемной конструкции. После определения mNeonGreen в качестве подходящего донора для экспериментов 2-Photon FLIM (рис. 3), мы использовали этот метод для измерения эффективности FRET каждого тандема в исследовании (рис. 4).Мы обнаружили, что и mScarlet-I, и mCherry были способны эффективно обрабатывать FRET с помощью mNeonGreen почти в одинаковой степени, но mRuby3 не мог вызывать значительную FRET (рис. 4A и 4B). Было несколько удивительно видеть, что mCherry предварительно сформирован так же хорошо, как mScarlet-I в качестве акцептора FRET в наших экспериментах с FLIM, несмотря на значительно более низкий коэффициент экстинкции. Это может быть демонстрацией быстрого созревания mCherry, что может позволить получить максимально возможное количество полностью развитых тандемов.Для дальнейшего исследования плохой работы mRuby3s мы использовали конфокальную микроскопию, чтобы выявить большую гетерогенность в способе экспрессии тандема NG-mRuby3 (рис. 5A и 5B), при этом многие клетки демонстрируют либо красную, либо зеленую флуоресценцию без другой. Это было несмотря на анализ вестерн-блоттинга, предполагающий, что большинство клеток должно экспрессировать полноразмерный тандемный белок (S4, фиг.). Такое поведение было постоянным для трех дополнительных конструкций mRuby3 (рис. 6). Изменение ориентации конструкций и укорочение линкера между ними (Ruby3-GGSGG-NG), по-видимому, практически не повлияло на работу mRuby3 как акцептора или на наблюдаемую гетерогенность в конфокальном режиме (рис. 6).Лишь незначительные улучшения наблюдались в конфокальной конструкции с конструкцией NG-P2A-mRuby3, которая позволила бы mRuby3 созревать без ковалентной связи с NG (конформация, которая препятствовала FRET, но позволяла нам оценить поведение mRuby3 как независимого белка). Примечательно, что это поведение было похоже на то, что наблюдалось с медленно созревающим вариантом Scarlet, mScarlet (рис. 6), предполагая, что низкая производительность mRuby3 может быть связана с его более длительным временем созревания. Учитывая эти результаты, были проведены эксперименты с конструкцией NG-mRuby3 через несколько дней после трансфекции, и действительно было обнаружено, что предоставление конструкции NG-mRuby3 большего времени для созревания улучшает ее характеристики в качестве акцептора FRET (фиг. 7).

Теоретически более высокий коэффициент экстинкции и квантовый выход mRuby3 предсказывает, что он должен превзойти mCherry и mScarlet-I. Однако, что шокирует, мы обнаружили противоположный результат (Рис. 2 и Рис. 4). Даже в самых идеальных испытанных условиях (через 4 или 5 дней после трансфекции) тандем NG-mRuby3 все еще не достиг эффективности FRET тандемов NG-mScarlet-I и NG-mCherry (рис. 7). Это контрастирует с предыдущим отчетом об очень хорошем преформировании аналогичной конструкции mNeonGreen-mRuby3, достигающей почти 40% эффективности как в клетках HEK293, так и в клетках Hela [10].На данный момент причины этого несоответствия неясны, хотя сходство в длине и составе линкеров, времени трансфекции и типах клеток предполагает, что это не связано с различием в составе используемых тандемных конструкций или различиями в условиях, в которых были проведены эксперименты (для каких условий сообщалось). Это несоответствие также сохраняется для конструкции mClover3-mRuby3 (S5 Рис), опять же, по неизвестным причинам. Кроме того, в ходе наших экспериментов мы обнаружили, что спектр излучения mRuby3 в этом тандеме был слегка смещен влево на 6 нм по сравнению с тем, что сообщается очищенным mRuby3 [10] (S1 Рис).Об этом открытии ранее не сообщалось, и, хотя этот сдвиг был незначительным, его необходимо было скорректировать, чтобы должным образом соответствовать нашим данным. Причина этого спектрального сдвига остается неясной, но может быть просто результатом того, что mRuby3 имеет несколько иное поведение в клетках по сравнению с очищенной системой. Это также может быть связано с фотохромным поведением, о котором ранее сообщалось для mRuby3 [11]. Какой бы ни была причина, непредсказуемые изменения в спектре очень важны для экспериментов с FRET, поскольку они могут привести к изменениям интенсивности флуоресценции, которые могут быть ошибочно интерпретированы как изменения в состоянии FRET.Возможно, что это поведение также повлияло на наши спектральные эксперименты с FRET (рис. 2) и могло объяснить несоответствие между вычисленными эффективностями FRET для конструкции NG-mRuby3 в спектральных анализах FRET и FLIM.

Хотя к настоящему времени опубликовано несколько исследований с использованием mRuby3, исследования, в которых использовался его предшественник, mRuby2, в целом показали положительные результаты [4, 9–11, 35, 36]. Хотя в исследовании, аналогичном нашему, с использованием зеленого FP mClover в качестве донора сообщается о гораздо более низкой, чем ожидалось, эффективности при использовании mRuby2 в качестве акцептора [37].Общность между нашим и их исследованиями заключается в использовании линий клеток млекопитающих. Это вместе с нашими данными, представленными здесь, предполагают, что низкая или медленная эффективность созревания серии Ruby является основным фактором низкой производительности mRuby3 через 1-3 дня после трансфекции. Проблемы созревания также могут сочетаться с вариабельностью скорости оборота белка от клетки к клетке или проблемами стабильности белка, и комбинация этих факторов, вероятно, объясняет высокую степень гетерогенности, которую мы наблюдаем в конфокальном режиме с нашими конструкциями mRuby3, а также с вариантом с медленным созреванием. mScarlet (Рис. 5 и Рис. 6).

В целом мы обнаружили, что и mCherry, и mScarlet-I действуют как отличные акцепторы для mNeonGreen в нашей модельной системе, причем каждый белок предлагает определенные преимущества в зависимости от используемых систем обнаружения. Кроме того, мы продемонстрировали, как факторы, выходящие за рамки классически рассматриваемых параметров FRET (квантовый выход донора, спектральное перекрытие и коэффициент экстинкции акцептора), могут непредсказуемо влиять на системы FRET. Именно один из этих «неклассических» факторов, время созревания, заставляет нас сделать вывод, что использование mRuby3 (и, возможно, медленно созревающего mScarlet) следует проводить с особой осторожностью только там, где мы столкнулись с недостатками (гетерогенная экспрессия и низкая производительность вскоре после начала экспрессии) будут смягчены или перевешены потенциальными преимуществами mRuby3.Также важно учитывать, что каждый из этих белков может вести себя по-разному в разных системах. Это остается возможным объяснением различий между нашими данными и данными, сообщенными другими, а наши противоречивые данные подчеркивают важность хорошо продуманного тестирования и контроля, особенно при разработке более сложной системы FRET.

Заключение

В этом исследовании мы проверяем жизнеспособность mNeonGreen в качестве донора FRET и mRuby3, mScarlet-I и mCherry в качестве акцепторов FRET с помощью тандемной модельной системы FP.Мы обнаружили, что mNeonGreen хорошо работает в качестве донора FRET как в интенсиометрических, так и в 2-фотонных экспериментах FLIM. При тестировании красных FP в качестве акцепторов для mNeonGreen мы обнаружили, что и mScarlet-I, и mCherry легко могли выполнять FRET с помощью mNeonGreen. Эти белки преобразуются одинаково хорошо в экспериментах FLIM, но mScarlet-I превосходит mCherry в интенсиометрическом исследовании из-за своего более высокого квантового выхода. Однако, когда обнаружение FRET измеряется независимо от интенсивности излучения акцептора, например, в нашей системе FLIM, mCherry демонстрирует равную эффективность FRET, но более последовательное выражение, что делает его лучшим выбором по сравнению с mScarlet-I в этом сценарии.Напротив, мы обнаружили, что mRuby3 плохо работает как акцептор FRET в нашей модельной системе, несмотря на то, что, по прогнозам, он является лучшим акцептором FRET из трех белков. Основным фактором этой плохой производительности является медленное созревание mRuby3, хотя стабильность белка и межклеточная гетерогенность в обмене белка также могут способствовать или усугублять эту проблему.

В целом, мы обнаружили, что mNeonGreen является отличным желто-зеленым донором, а mScarlet-I — одним из лучших универсальных акцепторов для экспериментов с зеленовато-красным FRET с использованием флуоресцентных белков.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Построение сканирования излучения, используемого для спектрального FRET.

(A) Сканирование выбросов нескольких независимых трансфекций NG-Stop при возбуждении на длине волны 470 нм, наложенное на зарегистрированное излучение чистого mNeonGreen. Среднее значение этих сканирований показано на рис. 2В. Из-за согласованности NG-Stop с чистым спектром mNeonGreen чистый спектр mNeonGreen использовался в качестве донорного спектра для линейного несмешивания. Сканирование эмиссии акцептора от нескольких независимых трансфекций (B), NG-mRuby3, (D), NG-mScarlet-I и (F) NG-mCherry, полученное путем возбуждения акцептора непосредственно с использованием света 530 и 540 нм, с наложенным чистым спектром красного FP в каждом состоянии.Среднее значение каждого состояния показано рядом с сообщенным чистым спектром для каждого акцептора, показанным в (C) , (E) и (G) соответственно. Сканирование как mScarlet-I, так и mCherry в конструкциях NG-mScarlet-I и NG-mCherry точно воспроизводило восходящий ход и пик очищенных mScarlet-I и mCherry, при этом основное различие между наблюдаемым и чистым спектром белка заключалось в более быстром распаде хвост спектра на высоких длинах волн. Напротив, сканирование mRuby3 в конструкции NG-mRuby3 выявило спектр излучения, который был на 6 нм смещен по сравнению с тем, что сообщалось для очищенного mRuby3.Из-за различий, наблюдаемых с каждым из красных акцепторных белков и различных уровней фона, были созданы индивидуальные акцепторные эмиссионные спектры, которые служат в качестве акцепторной эмиссии для линейного перемешивания, показанного в (C) , (E) и ( G) как черная пунктирная линия. Необработанные кривые, использованные для определения эффективности (H), NG-mRuby3, (I), NG-mScarlet-I и (J), NG-mCherry, показаны, что соответствует графику эффективности на рис. 2F.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s001

(TIF)

S2 Рис. Характеристики EGFP при визуализации с помощью 2-Photon FLIM.

(A) Данные о продолжительности жизни, собранные для отдельных клеток HEK293, экспрессирующих цитозольный EGFP при различной мощности лазера до 25 Вт / см. ² после 50 кадров. Черные полосы указывают средний доверительный интервал ± 95%. (B) Lifetime и (C) интенсивности образцов, снятых на протяжении 300 кадров при различной мощности лазера.* = P <0,05, ** = P <0,005 и *** = P <0,0005 по сравнению с набором данных 5 Вт / см ², сопоставленным с рамкой. N для каждого образца составляет 5 Вт / см ²: 10 ячеек, 10 Вт / см ²: 10 ячеек, 15 Вт / см ²: 10 ячеек, 20 Вт / см ²: 9 ячеек, 25 Вт / см ²: 10 ячеек.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s002

(TIF)

S4 Рис. Иммуноблот тандемных конструкций NG-Stop и NG-Red FP.

10 мкг общего белка, полученного из клетки, временно трансфицированной данной конструкцией, через один день после трансфекции загружали в 16% гель SDS-PAGE, и mNeonGreen визуализировали с использованием антитела (A), против mNeonGreen и (B) анти-GFP (для обнаружения конструкций, содержащих mClover3).NG-Stop имеет полосу, близкую к расчетной молекулярной массе 27 кДа. Каждый из тандемов, кроме NG-P2A-mRuby3, показывает яркую полосу при полном прогнозируемом весе тандемных конструкций, 54 кДА. Важно отметить, что только NG-Stop и NG-P2A-mRuby3 показывают полосы, соответствующие мономерному mNeonGreen. NG-mCherry, NG-mScarlet-I, NG-mScarlet и mClover3-mRuby3 демонстрируют продукты между ожидаемым полным тандемом и мономером mNeonGreen, которые, вероятно, связаны с гидролизом основной цепи красных FP во время лизиса клеток и последующей денатурации белка, ранее сообщалось о DsRed-подобных красных FP [38].Обратите внимание, что полоса, которая появляется между 75 и 100 кДа в (A) , присутствует на всех дорожках, указывая на то, что это неспецифическая мишень для антитела mNeonGreen.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s004

(TIF)

S5 Рис. Характеристики mRuby3 в качестве акцептора FRET для GFP, например зелено-желтого FP mClover3.

(A) Конфокальное изображение слияния клеток HEK293, экспрессирующих mClover3-mRuby3, демонстрирует, что mClover3-mRuby3 также демонстрирует высокую гетерогенность экспрессии, аналогичную той, что наблюдалась с другими конструкциями mRuby3.(B) Время жизни клеток HEK293, экспрессирующих mClover3-Stop (условие только для донора) и mClover3-mRuby3. Каждый символ представляет собой измерение одной ячейки. Черные полосы указывают средний доверительный интервал ± 95%. N для каждого образца имеет следующий вид: mClover3-Stop: 65 клеток и mClover3-mRuby3: 71 клетка. *** = P <0,0005 по сравнению с mClover3-Stop. (C) Средняя эффективность FRET mClover3-mRuby3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s005

(TIF)

S6 Рис.Пример кривых затухания из временного ряда NG-mRuby3.

(A) Пример кривых затухания флуоресценции отдельных клеток, экспрессирующих NG-mRuby3 через 2–5 дней после трансфекции (DPT), представляющий среднее значение для каждого условия. Кривая NG-Stop и кривые NG-mRuby3 1 DPT с рис. 3C также показаны для справки. (B) Пример кривых затухания флуоресценции для одной клетки, экспрессирующей NG-mRuby3 5 DPT, до и после фотообесцвечивания акцептора. Кривая NG-Stop с рис. 3C повторяется здесь для справки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s006

(TIF)

S1 Стол. Аминокислотные последовательности конструкций, использованных в этой рукописи.

Цветные аминокислотные последовательности для каждой конструкции показаны выше. Для NG-P2A-mRuby3 сайт расщепления находится между остатками глицина и пролина, обнаруженными непосредственно перед последовательностью mRuby3, и обозначен знаком |.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219886.s008

(TIF)

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Дэвида Юла и Эндрю Войтовича за полезные комментарии в ходе исследования, а также за щедрый обмен оборудованием.

Ссылки

1. Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG, Cormier MJ. Первичная структура зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria. Ген. 1992. 111 (2): 229–33. pmid: 1347277
2. Мац М.В., Фрадков А.Ф., Лабас Ю.А., Савицкий А.П., Зарайский А.Г., Маркелов М.Л. и др. Флуоресцентные белки небиолюминесцентных видов Anthozoa. Биотехнология природы. 1999. 17 (10): 969–73. pmid: 10504696
3. Wiedenmann J, Schenk A, Rocker C, Girod A, Spindler KD, Nienhaus GU.Ярко-красный флуоресцентный белок с быстрым созреванием и пониженной тенденцией к олигомеризации из Entacmaea quadricolor (Anthozoa, Actinaria). Proc Natl Acad Sci U S. A. 2002; 99 (18): 11646–51. Epub 2002/08/20. pmid: 12185250; PubMed Central PMCID: PMC129323.
4. Shaner NC, Lambert GG, Chammas A, Ni Y, Cranfill PJ, Baird MA и др. Яркий мономерный зеленый флуоресцентный белок, полученный из Branchiostoma lanceolatum. Природные методы. 2013; 10 (5): 407–9. Epub 2013/03/26. pmid: 23524392; PubMed Central PMCID: PMC3811051.
5. Алие Н., Фаббретти А., Лупиди Г., Цекоа Т., Спурио Р. Разработка вариантов цвета зеленого флуоресцентного белка (GFP) для термостабильности, чувствительности к pH и улучшения кинетики складывания. Прикладная микробиология и биотехнология. 2015; 99 (3): 1205–16. Epub 2014/08/13. pmid: 25112226.
6. Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, Tsien RY. Улучшенные мономерные красные, оранжевые и желтые флуоресцентные белки, полученные из Discosoma sp. красный флуоресцентный белок.Биотехнология природы. 2004. 22 (12): 1567–72. Epub 2004/11/24. pmid: 15558047.
7. Bayle V, Nussaume L, Bhat RA. Комбинация нового мутанта зеленого флуоресцентного белка TSapphire и варианта DsRed mOrange для создания универсального анализа FRET-FLIM in planta. Физиология растений. 2008. 148 (1): 51–60. Epub 2008/07/16. pmid: 18621983; PubMed Central PMCID: PMC2528103.
8. Кредель С., Освальд Ф., Ниенхаус К., Дойшл К., Рокер С., Вольф М. и др. mRuby, яркий мономерный красный флуоресцентный белок для мечения субклеточных структур.PLoS One. 2009; 4 (2): e4391. Epub 2009/02/06. pmid: 114; PubMed Central PMCID: PMC2633614.
9. Лам AJ, St-Pierre F, Gong Y, Marshall JD, Cranfill PJ, Baird MA и др. Улучшение динамического диапазона FRET с помощью ярко-зеленых и красных флуоресцентных белков. Природные методы. 2012; 9: 1005. https://www.nature.com/articles/nmeth.2171#supplementary-information. pmid: 22961245
10. Баджар Б.Т., Ван Э.С., Лам А.Дж., Ким Б.Б., Джейкобс С.Л., Хау Е.С. и др. Повышение яркости и фотостабильности зеленых и красных флуоресцентных белков для визуализации живых клеток и отчетов FRET.Научные отчеты. 2016; 6: 20889. https://www.nature.com/articles/srep20889#supplementary-information. pmid: 26879144
11. Биндельс Д.С., Хаарбош Л., ван Верен Л., Постма М., Визе К.Э., Мастоп М. и др. mScarlet: яркий мономерный красный флуоресцентный белок для визуализации клеток. Природные методы. 2017; 14 (1): 53–6. Epub 2016/11/22. pmid: 27869816.
12. Rodriguez EA, Campbell RE, Lin JY, Lin MZ, Miyawaki A, Palmer AE и др. Набор инструментов для выращивания и свечения флуоресцентных и фотоактивных белков.Направления биохимических наук. 2017; 42 (2): 111–29. Epub 2016/11/07. pmid: 27814948; PubMed Central PMCID: PMC5272834.
13. Кремерс Дж. Дж., Гилберт С. Г., Крэнфилл П. Дж., Дэвидсон М. В., Поршневой DW. Краткий обзор флуоресцентных белков. Журнал клеточной науки. 2011; 124 (2): 157–60. pmid: 21187342
14. Чудаков Д.М., Мац М.В., Лукьянов С, Лукьянов К.А. Флуоресцентные белки и их применение в визуализации живых клеток и тканей. Физиологические обзоры. 2010. 90 (3): 1103–63.pmid: 20664080.
15. Lambert TJ. FPbase: база данных флуоресцентных белков, редактируемая сообществом. Природные методы. 2019; 16 (4): 277–8. pmid: 30886412
16. Greenwald EC, Mehta S, Zhang J. Генетически закодированные флуоресцентные биосенсоры освещают пространственно-временную регуляцию сигнальных сетей. Химические обзоры. 2018; 118 (24): 11707–94. pmid: 30550275
17. Фогель С.С., Талер С., Кушик С.В. Причудливый FRET. STKE науки: среда знаний о трансдукции сигналов.2006; 2006 (331): re2. Epub 2006/04/20. pmid: 16622184.
18. Wall AC, Джиус Дж. П., Буглевич DJ, Бэнкс AB, Като Т.А. Окислительный стресс и эндоредупликация, вызванные воздействием синего света на клетки CHO. Мутационные исследования. 2019; 841: 31–5. Epub 2019/05/30. pmid: 31138408.
19. Сибуя К., Онодера С., Хори М. Длина токсичной волны синего света меняется по мере роста насекомых. PLoS One. 2018; 13 (6): e0199266. Epub 2018/06/20. pmid: 29
6; PubMed Central PMCID: PMC6007831.
20.Arthaut LD, Jourdan N, Mteyrek A, Procopio M, El-Esawi M, d’Harlingue A и др. Накопление активных форм кислорода, вызванное синим светом, является следствием фотоцикла криптохрома дрозофилы. PLoS One. 2017; 12 (3): e0171836. Epub 2017/03/16. pmid: 28296892; PubMed Central PMCID: PMC5351967.
21. Наканиши-Уэда Т., Мадзима Х.Дж., Ватанабе К., Уэда Т., Индо ХП, Суэнага С. и др. Воздействие синего светодиода приводит к развитию внутриклеточных активных форм кислорода, перекисному окислению липидов и последующим клеточным повреждениям в культивируемых клетках пигментного эпителия сетчатки крупного рогатого скота.Свободно-радикальные исследования. 2013. 47 (10): 774–80. pmid: 23898883
22. Джоу MJ, Jou SB, Guo MJ, Wu HY, Peng TI. Генерация активных форм кислорода в митохондриях и увеличение кальция в астроцитах под действием видимого света. Ann N Y Acad Sci. 2004; 1011: 45–56. Epub 2004/05/06. pmid: 15126282.
23. Сигел А.П., Бэрд М.А., Дэвидсон М.В., Дэй Р.Н. Сильные и слабые стороны недавно созданных красных флуоресцентных белков, оцененных на живых клетках с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии.Международный журнал молекулярных наук. 2013. 14 (10): 20340–58. Epub 2013/10/17. pmid: 24129172; PubMed Central PMCID: PMC3821618.
24. Шемякина И.И., Ермакова Г.В., Крэнфилл П.Дж., Бэрд М.А., Эванс Р.А., Суслова Е.А. и др. Мономерный красный флуоресцентный белок с низкой цитотоксичностью. Связь природы. 2012; 3: 1204. https://www.nature.com/articles/ncomms2208#supplementary-information. pmid: 23149748
25. Hoffman RM. Глава одиннадцатая — Визуализация живых клеток у живых животных с помощью флуоресцентных белков.В: Conn PM, редактор. Методы в энзимологии. 506: Academic Press; 2012. с. 197–224. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-3
-7.00035-4 pmid: 22341226
26. Кэмпбелл Р. Э., Тур О, Палмер А. Э., Штайнбах П. А., Бэрд Г. С., Захариас Д. А. и др. Мономерный красный флуоресцентный белок. Труды Национальной академии наук. 2002. 99 (12): 7877–82. pmid: 12060735
27. Lin F, Zhang C, Du M, Wang L, Mai Z, Chen T. Превосходная надежность метода ExEm-spFRET по сравнению с методом IIem-spFRET при измерении FRET живых клеток.Журнал микроскопии. 2018; 272 (2): 145–50. Epub 2018/10/20. pmid: 30338530.
28. Кушик С.В., Чен Х., Талер С., Пуль Х.Л., 3-й, Фогель С.С. Эталонные стандарты FRET Cerulean, Venus и VenusY67C. Biophys J. 2006; 91 (12): L99 – l101. Epub 2006/10/17. pmid: 17040988; PubMed Central PMCID: PMC1779932.
29. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frize E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T. и др. Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений. Природные методы.2012. 9 (7): 676–82. Epub 2012/06/30. pmid: 22743772; PubMed Central PMCID: PMC3855844.
30. Рашка С. MLxtend: предоставление утилит и расширений машинного обучения и обработки данных для стека научных вычислений Python. Журнал открытого программного обеспечения. 2018; 3 (24).
31. Клавель Д., Готтхард Дж., Фон Стеттен Д., Де Санктис Д., Паскье Х., Ламберт Г. Г. и др. Структурный анализ яркого мономерного желто-зеленого флуоресцентного белка mNeonGreen, полученного путем направленной эволюции.Acta crystallographica Раздел D, Структурная биология. 2016; 72 (Pt 12): 1298–307. Epub 2016/12/06. pmid: 27_{0; PubMed Central PMCID: PMC5137226.}
32. Padilla-Parra S, Auduge N, Lalucque H, Mevel JC, Coppey-Moisan M, Tramier M. Количественное сравнение различных пар флуоресцентных белков для быстрого получения FRET-FLIM. Biophys J. 2009; 97 (8): 2368–76. Epub 22.10.2009. pmid: 19843469; PubMed Central PMCID: PMC2764072.
33. Molina RS, Tran TM, Campbell RE, Lambert GG, Salih A, Shaner NC и др.Гомологи зеленого флуоресцентного белка со смещением синего цвета ярче, чем усиленный зеленый флуоресцентный белок при двухфотонном возбуждении. Журнал писем по физической химии. 2017; 8 (12): 2548–54. pmid: 28530831
34. Ким Дж. Х., Ли С. Р., Ли Л. Х., Пак Х. Дж., Пак Дж. Х., Ли К. Я. и др. Высокая эффективность расщепления пептида 2А, полученного из тешовируса-1 свиньи, в линиях клеток человека, рыбок данио и мышей. PLoS One. 2011; 6 (4): e18556. Epub 2011/05/24. pmid: 21602908; PubMed Central PMCID: PMC3084703.
35. Mastop M, Bindels DS, Shaner NC, Postma M, Gadella TWJ Jr., Goedhart J. Характеристика спектрально разнообразного набора флуоресцентных белков как акцепторов FRET для mTurquoise2. Научный доклад 2017; 7 (1): 11999. Epub 2017/09/22. pmid: 28931898; PubMed Central PMCID: PMC5607329.
36. Джордж Абрахам Б., Саркисян К.С., Мишин А.С., Сантала В., Ткаченко Н.В., Карп М. Пары FRET на основе флуоресцентного белка с улучшенным динамическим диапазоном для измерения времени жизни флуоресценции.PLoS One. 2015; 10 (8): e0134436. Epub 2015/08/04. pmid: 26237400; PubMed Central PMCID: PMC4523203.
37. Мартин К.Дж., МакГи Э.Дж., Шварц Дж. П., Дрисдейл М., Брахманн С. М., Штук В. и др. Прием от лучшего донора; анализ пар долгоживущих донорских флуоресцентных белков для оптимизации динамических экспериментов FRET на основе FLIM. PLoS One. 2018; 13 (1): e0183585. Epub 2018/01/03. pmid: 29293509; PubMed Central PMCID: PMC5749721.
38. Гросс Л.А., Бэрд Г.С., Хоффман Р.С., Болдридж К.К., Цзянь Р.Ю.Структура хромофора в DsRed, красном флуоресцентном белке коралла. Труды Национальной академии наук. 2000. 97 (22): 11990–5. pmid: 11050230

A FRET биосенсор выявляет пространственно-временную активацию и функции авроракиназы A в живых клетках

1
Wang, G., Jiang, Q. & Zhang, C. Роль митотических киназ в соединении центросомного цикла со сборкой митотической шпиндель. J. Cell Sci. 127 , 4111–4122 (2014).
CAS Статья Google Scholar

2
Малумбрес М. Физиологическая значимость киназ клеточного цикла. Physiol. Ред. 91 , 973–1007 (2011).
CAS Статья Google Scholar

3
Никонова А.С., Асцатуров И., Серебряский И.Г., Данбрак Р.Л., Големис Е.А. Киназа Aurora A (AURKA) в нормальном и патологическом делении клеток. Ячейка. Мол. Life Sci. 70 , 661–687 (2013).
CAS Статья Google Scholar

4
Bischoff, J. R. et al. Гомолог киназы Drosophila aurora является онкогенным и амплифицирован при колоректальном раке человека. EMBO J. 17 , 3052–3065 (1998).
CAS Статья Google Scholar

5
Zhou, H. et al. Киназа STK15 / BTAK, усиленная опухолью, индуцирует амплификацию, анеуплоидию и трансформацию центросом. Нат. Genet. 20 , 189–193 (1998).
CAS Статья Google Scholar

6
Cheetham, G.M.T. Кристаллическая структура Aurora-2, онкогенной серин / треонинкиназы. J. Biol. Chem. 277 , 42419–42422 (2002).
CAS Статья Google Scholar

7
Бейлисс Р., Сардон Т., Вернос И. и Конти Э.Структурная основа активации Aurora-A с помощью TPX2 на митотическом веретене. Мол. Ячейка 12 , 851–862 (2003).
CAS Статья Google Scholar

8
Zhang, Y. et al. Идентификация аутоингибиторных доменов киназы Aurora-A. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 357 , 347–352 (2007).
CAS Статья Google Scholar

9
Куфер Т.A. et al. TPX2 человека необходим для нацеливания киназы Aurora-A на веретено. J. Cell Biol. 158 , 617–623 (2002).
CAS Статья Google Scholar

10
Eyers, P. A., Erikson, E., Chen, L. G. и Maller, J. L. Новый механизм активации протеинкиназы Aurora A. Curr. Биол. 13 , 691–697 (2003).
CAS Статья Google Scholar

11
Брюне, С.и другие. Характеристика доменов TPX2, участвующих в зародышеобразовании микротрубочек и сборке веретена в экстрактах яиц ксенопсов. Мол. Биол. Ячейка 15 , 5318–5328 (2004).
CAS Статья Google Scholar

12
Satinover, D. L., Leach, C. A., Stukenberg, P. T. & Brautigan, D. L. Активация киназы Aurora-A ингибитором протеинфосфатазы-2, бифункциональным сигнальным белком. Proc. Natl Acad.Sci. США 101 , 8625–8630 (2004).
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

13
Nowakowski, J. et al. Структуры связанных с раком протеинкиназ Aurora-A, FAK и EphA2 из нанообъемной кристаллографии. Структура 10 , 1659–1667 (2002).
CAS Статья Google Scholar

14
Фукуда Т., Мишина Ю., Walker, M. P. и DiAugustine, R. P. Условная трансгенная система для мышиной киназы Aurora A: деградация убиквитинового протеасомного пути контролирует уровень трансгенного белка. Мол. Клетка. Биол. 25 , 5270–5281 (2005).
CAS Статья Google Scholar

15
Zorba, A. et al. Молекулярный механизм аутофосфорилирования киназы Aurora A и ее аллостерическая активация TPX2. Элиф 3 , e02667 (2014).
Артикул Google Scholar

16
Honda, K. et al. Деградация протеинкиназы Aurora2 человека с помощью пути комплекс-убиквитин-протеасома, способствующий анафазе. Онкоген 19 , 2812–2819 (2000).
CAS Статья Google Scholar

17
Клотцбухер А., Паскро Г., Приджент К. и Арлот-Боннемейнс Ю. Метод анализа убиквитинирования и деградации Авроры-А. Biol. Процедуры. Интернет 4 , 62–69 (2002).
CAS Статья Google Scholar

18
Littlepage, L. E. и Ruderman, J. V. Идентификация нового домена узнавания APC / C, A-бокса, который необходим для Cdh2-зависимого разрушения киназы Aurora-A во время выхода из митоза. Genes Dev. 16 , 2274–2285 (2002).
CAS Статья Google Scholar

19
Аоки, К., Камиока, Ю. и Мацуда, М. Флуоресцентная визуализация с резонансным переносом энергии клеточной передачи сигналов от in vitro до in vivo : основы конструкции биосенсора, получение изображений в реальном времени и обработка изображений. Dev. Разница в росте. 55 , 515–522 (2013).
CAS Статья Google Scholar

20
Gheghiani, L. & Gavet, O. Расшифровка пространственно-временной регуляции входа и продвижения через митоз. Biotechnol. J. 9 , 213–223 (2014).
CAS Статья Google Scholar

21
Giubettini, M. et al. Контроль стабильности Aurora-A через взаимодействие с TPX2. J. Cell Sci. 124 , 113–122 (2011).
CAS Статья Google Scholar

22
Joukov, V., Walter, J. C. & De Nicolo, A. Cep192-организованный каскад Aurora A-Plk1 важен для цикла центросом и сборки биполярного веретена. Мол. Ячейка 55 , 578–591 (2014).
CAS Статья Google Scholar

23
Бейлисс Р., Фрай А., Хак Т. и Йео С. Молекулярные механизмы активации митотических киназ. Open Biol. 2 , 120136 (2012).
Артикул Google Scholar

24
Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M. & Tramier, M.Количественный FRET-анализ с помощью быстрого сбора данных FLIM во временной области с высоким пространственным разрешением в живых клетках. Biophys. J. 95 , 2976–2988 (2008).
CAS Статья Google Scholar

25
Падилья-Парра, С. и Трамье, М. Микроскопия FRET в живой клетке: различные подходы, сильные и слабые стороны. BioEssays 34 , 369–376 (2012).
Артикул Google Scholar

26
Бруссар, Дж.A., Rappaz, B., Webb, D. J. и Brown, C. M. Микроскопия флуоресцентного резонансного переноса энергии, продемонстрированная путем измерения активации серин / треонинкиназы Akt. Нат. Protoc. 8 , 265–281 (2013).
CAS Статья Google Scholar

27
Эспозито, А. и Воутерс, Ф. С. Флуоресцентная микроскопия для визуализации времени жизни. Curr. Protoc. Cell Biol. 25 , 4.14.1–4.14.30 (2004).
Артикул Google Scholar

28
Padilla-Parra, S. et al. Количественное сравнение различных пар флуоресцентных белков для быстрого получения FRET-FLIM. Biophys. J. 97 , 2368–2376 (2009).
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

29
Haydon, C.E. et al. Идентификация новых сайтов фосфорилирования на Xenopus laevis Aurora A и анализ обогащения фосфопептидами с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом. Мол. Клетка. Протеомика 2 , 1055–1067 (2003).
CAS Статья Google Scholar

30
Scrittori, L. et al. pEg2 Aurora-A киназа, фосфорилирование гистона h4 и сборка хромосом в экстракте яиц Xenopus. J. Biol. Chem. 276 , 30002–30010 (2001).
CAS Статья Google Scholar

31
Катаяма, Х.и другие. Фосфорилирование киназой Aurora A вызывает опосредованную Mdm2 дестабилизацию и ингибирование p53. Нат. Genet. 36 , 55–62 (2004).
CAS Статья Google Scholar

32
Manfredi, M. G. et al. Противоопухолевая активность MLN8054, орально активного низкомолекулярного ингибитора киназы Aurora A. Proc. Natl Acad. Sci. США 104 , 4106–4111 (2007).
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

33
Гёргюн, Г.и другие. Новый ингибитор киназы Aurora-A MLN8237 вызывает цитотоксичность и остановку клеточного цикла при множественной миеломе. Кровь 115 , 5202–5213 (2010).
Артикул Google Scholar

34
Marumoto, T. et al. Киназа Aurora-A поддерживает точность ранних и поздних митотических событий в клетках HeLa. J. Biol. Chem. 278 , 51786–51795 (2003).
CAS Статья Google Scholar

35
Де Лука, М.и другие. Aurora-A и ch-TOG действуют общим путем, контролируя целостность полюса веретена. Онкоген 27 , 6539–6549 (2008).
CAS Статья Google Scholar

36
Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P. & Guarguaglini, G. Инактивация Aurora-A вызывает фрагментацию митотического полюса веретена за счет дисбаланса сил, генерируемых микротрубочками. Мол. Рак 10 , 131 (2011).
CAS Статья Google Scholar

37
Ребутье, Д.и другие. Aurora A участвует в сборке центрального веретена посредством фосфорилирования Ser 19 в P150Glued. J. Cell Biol. 201 , 65–79 (2013).
CAS Статья Google Scholar

38
Goepfert, T. M. et al. Амплификация центросом и сверхэкспрессия Aurora A являются ранними событиями в канцерогенезе молочной железы крыс. Cancer Res. 62 , 4115–4122 (2002).
CAS PubMed Google Scholar

39
Танака, М.и другие. Зависимая от клеточного цикла регуляция полярного сияния человека A Транскрипция опосредуется периодической репрессией E4TF1. J. Biol. Chem. 277 , 10719–10726 (2002).
CAS Статья Google Scholar

40
Ананд, С., Пенрин-Лоу, С. и Венкитараман, А. Р. Амплификация AURORA-A отменяет контрольную точку сборки митотического веретена, вызывая устойчивость к таксолу. Cancer Cell 3 , 51–62 (2003).
CAS Статья Google Scholar

41
Dutertre, S. et al. Фосфорилирование CDC25B с помощью Aurora-A в центросоме вносит вклад в переход G2 – M. J. Cell Sci. 117 , 2523–2531 (2004).
CAS Статья Google Scholar

42
Marumoto, T. et al. Роль киназы aurora-A в митотическом входе и контрольной точке G2 в клетках млекопитающих. Гены Клеток 7 , 1173–1182 (2002).
CAS Статья Google Scholar

43
Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D. & Pelletier, L. Субдифракционная визуализация центросом выявляет организационные особенности более высокого порядка перицентриолярного материала. Нат. Cell Biol. 14 , 1148–1158 (2012).
CAS Статья Google Scholar

44
Парк, С.-Y. и другие. Молекулярная основа однонаправленного переключения каркаса человеческого Plk4 в биогенезе центриолей. Нат. Struct. Мол. Биол. 21 , 696–703 (2014).
CAS Статья Google Scholar

45
Karna, P. et al. Новый носкапиноид, модулирующий микротрубочки, запускает апоптоз, индуцируя мультиполярность веретена посредством амплификации и декластеризации центросом. Cell Death Differ. 18 , 632–644 (2011).
CAS Статья Google Scholar

46
Zitouni, S., Nabais, C., Jana, S.C., Guerrero, A. & Bettencourt-Dias, M. Поло-подобные киназы: структурные изменения приводят к множеству функций. Нат. Rev. Mol. Cell Biol. 15 , 433–452 (2014).
CAS Статья Google Scholar

47
Bird, A. W. и Hyman, A. A. Создание веретена правильной длины в человеческих клетках требует взаимодействия между TPX2 и Aurora A. J. Cell Biol. 182 , 289–300 (2008).
CAS Статья Google Scholar

48
Hégarat, N. et al. Аврора А и Аврора В совместно координируют сегрегацию хромосом и динамику анафазных микротрубочек. J. Cell Biol. 195 , 1103–1113 (2011).
Артикул Google Scholar

49
Эртыч Н. и др. Повышенная скорость сборки микротрубочек влияет на хромосомную нестабильность в клетках колоректального рака. Нат. Cell Biol. 16 , 779–791 (2014).
CAS Статья Google Scholar

50
Fuller, B.G. et al. Активация средней зоны полярного сияния B в анафазе вызывает внутриклеточный градиент фосфорилирования. Природа 453 , 1132–1136 (2008).
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

51
Лю Д., Вейдер Г., Вроманс, М. Дж. М., Лэмпсон, М. А. и Ленс, С. М. А. Определение би-ориентации хромосом путем пространственного разделения киназы Aurora B от кинетохорных субстратов. Наука 323 , 1350–1353 (2009).
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

52
Гавет О. и Пайнс Дж. Активация циклина B1-Cdk1 синхронизирует события в ядре и цитоплазме при митозе. J. Cell Biol. 189 , 247–259 (2010).
CAS Статья Google Scholar

53
Liu, D., Davydenko, O. & Lampson, M. A. Polo-like kinase-1 регулирует динамику кинетохор-микротрубочек и молчание контрольных точек веретена. J. Cell Biol. 198 , 491–499 (2012).
CAS Статья Google Scholar

54
Goedhart, J. & Gadella, T. W. J. Визуализация флуоресцентного резонансного переноса энергии передачи сигналов PKC в живых клетках с использованием генетически кодируемых флуоресцентных зондов. J. R. Soc. Интерфейс 6 , S27 – S34 (2009).
CAS Статья Google Scholar

55
Ле Паж, Ю., Шартрен, И., Бадуэль, К., Тассан, Ж.-П. Функциональный анализ MELK при делении клеток показывает переход в режиме цитокинеза во время развития Xenopus. J. Cell Sci. 124 , 958–968 (2011).
CAS Статья Google Scholar

56
Додсон, К.A., Yeoh, S., Haq, T. и Bayliss, R. Кинетический тест характеризует механизмы внутримолекулярного и межмолекулярного аутофосфорилирования киназ. Sci. Сигнал. 6 , ra54 – ra54 (2013).
Артикул Google Scholar

57
Tyler, R.K., Shpiro, N., Marquez, R. & Eyers, P.A. VX-680 ингибирует активность киназ Aurora A и Aurora B в клетках человека. Cell Cycle 6 , 2846–2854 (2007).
CAS Статья Google Scholar

58
Скатт, П.J. et al. Открытие и использование устойчивых к ингибиторам мутантов Aurora и Polo kinase для анализа митотических сетей. J. Biol. Chem. 284 , 15880–15893 (2009).
CAS Статья Google Scholar

59
Zeng, K., Bastos, R. N., Barr, F. A. & Gruneberg, U. Протеиновая фосфатаза 6 регулирует образование митотического веретена, контролируя состояние фосфорилирования Т-петли Aurora A, связанного с его активатором TPX2. J. Cell Biol. 191 , 1315–1332 (2010).
CAS Статья Google Scholar

60
Марумото Т., Чжан Д. и Сая Х. Аврора-А — хранительница полюсов. Нат. Rev. Cancer 5 , 42–50 (2005).
CAS Статья Google Scholar

61
Pugacheva, E. N. & Golemis, E. A. Опорный белок фокальной адгезии HEF1 регулирует активацию киназ Aurora-A и Nek2 в центросоме. Нат. Cell Biol. 7 , 937–946 (2005).
CAS Статья Google Scholar

62
Inoko, A. et al. Трихоплейн и Аврора Блокируют аберрантную сборку первичных ресничек в пролиферирующих клетках. J. Cell Biol. 197 , 391–405 (2012).
CAS Статья Google Scholar

63
Лентини, Л., Иовино, Ф., Амато, А.И Ди Леонардо, А. Амплификация центросом, индуцированная гидроксимочевиной, приводит к анеуплоидии в фибробластах человека и мыши с дефицитом pRB. Cancer Lett. 238 , 153–160 (2006).
CAS Статья Google Scholar

64
Quintyne, N.J., Reing, J.E., Hoffelder, D.R., Gollin, S.M. & Saunders, W.S. Многополярность веретена предотвращается центросомной кластеризацией. Наука 307 , 127–129 (2005).
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

65
Basto, R. et al. Амплификация центросом может инициировать онкогенез у мух. Ячейка 133 , 1032–1042 (2008).
CAS Статья Google Scholar

66
Kwon, M. et al. Механизмы подавления мультиполярных делений раковых клеток с дополнительными центросомами. Genes Dev. 22 , 2189–2203 (2008).
CAS Статья Google Scholar

67
Щербакова Д. М., Верхуша В. В. Флуоресцентные белки ближнего инфракрасного диапазона для многоцветной визуализации in vivo. Нат. Методы 10 , 751–754 (2013).
CAS Статья Google Scholar

68
Cremet, J. Y., Descamps, S., Vérite, F., Martin, A. & Prigent, C. Получение и характеристика человеческого моноклонального антитела к киназе aurora-A. Мол. Клетка. Biochem. 243 , 123–131 (2003).
CAS Статья Google Scholar

69
Leray, A., Padilla-Parra, S., Roul, J., Héliot, L. & Tramier, M. Пространственно-временная количественная оценка FRET в живых клетках с помощью быстрой FLIM во временной области: сравнительное исследование неподходящих методов [исправлено]. PLoS ONE 8 , e69335 (2013).
CAS Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ Google Scholar

70
Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G. & Ellenberg, J. Методы возмущения флуоресценции для изучения подвижности и молекулярной динамики белков в живых клетках: FRAP, фотоактивация, фотопреобразование и FLIP. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 , 1303–1324 (2010).
Артикул Google Scholar

Биосенсор на основе FRET для количественного определения глюкозы в культуральных супернатантах при культивировании микробов в миллилитровом масштабе | Фабрики микробных клеток

Характеристики сенсора

Концентрация d-глюкозы при культивировании микробов обычно находится в диапазоне от 0 до 200 мМ, что требует сравнительно низкого сродства сенсора d-глюкозы в нижнем миллимолярном диапазоне для определения истощения d-глюкозы.Первый вариант растворимого сенсора, Glu ^[-], изученный в этой работе, показывает значения K _d 0,4 ± 0,1 мМ для d-глюкозы и очень хорошую чувствительность в буфере, что можно вывести из соотношения FRET. изменение (ΔR) 75% между несвязанным и связанным состояниями (дополнительный файл 1: рисунок S1). Таким образом, диапазон обнаружения в буфере MOPS составляет от 0,01 мМ до 10 мМ (от 0,0018 г л ^-1 до 1,8 г л ^-1) d-глюкозы.

Помимо высокой интенсивности сигнала датчик также должен быть стабильным в условиях микробиореактора, где биосенсор подвергается воздействию температуры и механической нагрузки из-за встряхивания.Во-первых, термостойкость сенсора растворимого Glu ^[-] была протестирована на предмет его стабильности при различных температурах. В то время как соотношение FRET в присутствии и в отсутствие d-глюкозы оставалось стабильным в течение 21 дня инкубации при 4 ° C и -20 ° C, соответственно, соотношение FRET уже явно изменилось через 3 дня при 25 ° C (рис. 1а), что явно ограничивает применимость этого датчика при комнатной температуре. Таким образом, сеньор подходит для применения в лабораторных условиях со временем культивирования в диапазоне от 24 до 48 часов.Анализ SDS-PAGE показал, что наблюдаемая нестабильность вызвана главным образом возрастающей деградацией слитого белка (рис. 1b). Белок биосенсора распадается на фрагменты размером около 30 кДа (рис. 1b, красный прямоугольник), которые соответствуют размерам как FP, так и центрального MglB, соответственно. Аналогичные результаты были получены и ранее при попытках кристаллизации разных аналогичных сенсоров (данные не показаны). Однако лежащий в основе механизм еще предстоит выяснить.

Рис. 1
Стабильность сенсора Glu ^[-] (20 мкМ) в буфере MOPS (20 мМ, pH 7.3) при 25 ° С. — соотношение FRET сенсора Glu ^[-], демонстрирующее явное свидетельство деградации после инкубации в течение 3 дней. b Анализ SDS-PAGE датчика Glu ^[-]. Ярлыки над полосами обозначают количество дней инкубации. Размер полноразмерного белка составляет ~ 90 кДа (зеленая рамка). Через 2 дня при 25 ° C сенсор начинает распадаться на более мелкие фрагменты ~ 60 кДа (оранжевая рамка, дорожка 3) и ~ 25–30 кДа (красная рамка). Через 4 дня (дорожки 4–11) датчик полностью распадается на фрагмент ~ 25–30 кДа (подробности см. В тексте)
Помимо температуры, датчик должен быть устойчивым также по отношению к различным средам культивирования.Чтобы тщательно протестировать применение нового сенсора d-глюкозы для применения с Corynebacterium glutamicum , среда CGXII была протестирована как типичная среда культивирования [30] на предмет влияния на свойства сенсора. Соответствующая изотерма связывания сенсора Glu ^[-], записанная в присутствии культуральной среды, демонстрирует сильное влияние среды CGXII на чувствительность сенсора относительно буфера (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S2). Из-за сильного фона и гашения среды CGXII измерения приемлемы только для среды CGXII, разбавленной как минимум 95% буфером (об. / Об.).Кроме того, это разведение позволяет проводить измерения в присутствии клеток C. glutamicum . Таким образом, разделение клеток перед измерением d-глюкозы на линии не требуется. К счастью, среда не повлияла на кажущийся K _d варианта сенсора, что указывает на то, что гасящий эффект среды влияет на флуоресцентные белки, а не на MglB (дополнительный файл 1: Рисунок S2). Пределы обнаружения от 0,01 мМ до 10 мМ (от 0,0018 г л ^-1 до 1,8 г л ^-1) d-глюкозы, однако, могут быть смещены путем разбавления образцов культивирования.Разбавление в 40 раз позволило бы количественно определить d-глюкозу от 0,4 мМ до 400 мМ (от 0,072 до 72 г л ^-1), что охватывает диапазон концентраций большинства культивирований микробов.
Еще одним предварительным условием для применения таких датчиков является воспроизводимость калибровок во время типичного эксперимента по выращиванию, указывающая на их стабильность в условиях процесса. Повторные сравнительные калибровки в буфере MOPS в присутствии и в отсутствие среды CGXII (2,5% об. / Об., Разведение 1:40) не показали значительного влияния на кажущееся сродство (K _d) и интенсивность сигнала Glu. ^[-] датчик.Как показано на рис. 2, изотермы связывания оставались стабильными на протяжении всего эксперимента, демонстрируя, что этот датчик может использоваться для повторных измерений.
Рис. 2
Изотерма связывания биосенсора Glu ^[-] в любом MOPS (20 мМ, pH 7,3) ( a ) со средой CGXII (2,5% об.) И ( b ) без добавление среды без встряхивания. FRET-соотношение (I _A / I _D) было рассчитано на основе выбросов донора mTurquoise2 на 485 нм (± 20 нм) и акцептора Венеры на 528 нм (± 20 нм) после возбуждения донора на 428 нм. нм (± 9 нм) согласно формуле.(1). Между измерениями датчик хранился в защищенном от света месте при температуре 4 ° C. Кривые (пунктирные) были подогнаны к данным в соответствии с формулой. (2)
Помимо термического разложения и воздействия среды, также встряхивание сенсора Glu ^[-] в цветочных пластинах ^® устройства BioLector ^® оказалось вредным, поскольку эмиссия обоих FRET-партнеров значительно снизилась (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S5). Уменьшение обеих интенсивностей излучения указывает на деградацию по крайней мере донора и, скорее всего, также акцептора.Кроме того, частота встряхивания> 800 об / мин приводила к агрегированию датчика Glu ^[-] (данные не показаны). Агрегированный сенсор больше не реагировал на изменения концентрации d-глюкозы, что делало сенсор Glu ^[-] непригодным для онлайн-применения во встряхиваемых культурах. Тем не менее, растворимый сенсор Glu ^[-] может применяться в автоматизированном процессе для измерения d-глюкозы на линии. При такой настройке запас биосенсора можно легко хранить при температуре 4 ° C между измерениями, что значительно увеличивает срок его службы.Кроме того, датчик Glu ^[-] не будет подвергаться тряске, что способствует стабильности датчика.
Прямое нанесение растворимого Glu
^[-] сенсора
При наличии достаточно стабильного сенсора и воспроизводимой калибровки был разработан поточный протокол количественного определения d-глюкозы для широко используемого производственного штамма Corynebacterium glutamicum (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S7). Во время культивирования C. glutamicum ATCC 13032 в BioLector ^® отслеживали рост биомассы, потребление кислорода и изменения pH в режиме онлайн.Как описано в разделе «Методы», каждый час с помощью системы обработки жидкости отбирали три образца, разбавляли и измеряли концентрацию d-глюкозы с помощью биосенсора Glu ^[-] (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S8 для калибровки). Супернатант оставшихся образцов хранили при 4 ° C для сравнительной автономной аналитики с использованием ВЭЖХ и ферментативного анализа d-глюкозы [2].
Как показано на фиг. 3, сенсорный анализ Glu ^[-] работал очень хорошо и отражал потребление d-глюкозы в соответствии с анализами ВЭЖХ и ферментативного анализа.Примечательно, что измерение проводилось в присутствии бактериальных клеток с использованием небольшого количества образца (15 мкл) и очень короткого времени инкубации (<1 мин). Эти свойства способствуют быстрому процессу измерения, и, таким образом, наш рабочий процесс позволяет количественно определять d-глюкозу в большом количестве образцов во время выполнения процесса культивирования.
Рис. 3
Рост биомассы ( a ) и потребление d-глюкозы C. glutamicum ATCC 13032 в среде CGXII с последующим через ( b ) датчик Glu ^[-] сенсор ( c ) ферментативный анализ d-глюкозы и ( d ) анализ ВЭЖХ.Хотя сенсорный анализ можно было проводить в режиме реального времени, ферментативные анализы и анализы ВЭЖХ проводились в автономном режиме после завершения культивирования. Каждая кривая напоминает биологическую копию. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение (SD) в трех технических повторностях
.
Ферментативные анализы обычно используются для количественного определения d-глюкозы в образцах микробных культур [2, 3], а также могут использоваться в автоматизированной поточной установке [33]. Однако есть ярко выраженные недостатки: во-первых, они требуют предварительного отделения бактериальных клеток, часто с помощью центрифугирования или фильтрации.Это усложняет рабочий процесс, отнимает больше времени и требует сложной платформы для обработки жидкостей. Напротив, для сенсорного анализа d-глюкозы требуются только этапы разбавления, которые можно быстро выполнить с помощью стандартных операций с жидкостью. Во-вторых, ферментные анализы включают этапы инкубации от 10 мин [34] до 30 мин [2]. Хотя этот трудоемкий этап не вызывает проблем при параллельной обработке большого количества выборок, он ограничивает интервал измерений на линии. Например, предыдущее исследование продемонстрировало измерение d-глюкозы на линии с помощью ферментативного анализа с 80-минутными интервалами [33].С другой стороны, биосенсор Glu ^[-] немедленно реагирует на d-глюкозу в окружающей среде, в том числе в присутствии клеток, что открывает путь к очень коротким циклам измерения и, таким образом, увеличивает плотность данных.
Насколько нам известно, в настоящее время не существует метода поточной ВЭЖХ для микробиореакторов из-за длительного времени удерживания и иногда сложной подготовки образцов [35]. Хотя подготовку образцов путем фильтрации можно легко автоматизировать, недостаток измерения только одного образца за раз серьезно препятствует применению методов ВЭЖХ на линии при культивировании в микробиореакторах, которые часто включают несколько параллельных культивирований.Однако хроматографические методы имеют преимущество измерения нескольких аналитов за один прогон.
Иммобилизация
После успешной настройки протокола измерения на линии в среде CGXII, мы остановились на приложении для онлайн-измерений. Как показано выше, растворимый сенсор Glu ^[-] не обладает долговременной стабильностью при температурах выше 25 ° C и подвержен механическим воздействиям. Нельзя избежать механического стресса, поскольку перемешивание необходимо для любого микробного культивирования, чтобы обеспечить достаточное перемешивание и, в случае аэробных культивирований, перенос кислорода.Таким образом, стабильность датчика должна быть улучшена. Первоначальные исследования иммобилизации с помощью His-tag не увенчались успехом, поскольку хелатная связь Co ²⁺ с гранулами диоксида кремния, функционализированными нитрилотриуксусной кислотой (Dynabeads, ThermoScientific), не была стабильной в условиях процесса (данные не показаны). Альтернативным подходом является иммобилизация с помощью HaloTag ^® [21], который обеспечивает ковалентную иммобилизацию и очистку в одну стадию, начиная также непосредственно с сырых клеточных экстрактов, как недавно было успешно продемонстрировано для иммобилизации различных ферментов [22, 36, 37 ].
Слияние HaloTag ^® с C-концом сенсора d-глюкозы привело к сенсору Glu ^{[+ Halo]}. Это слияние уменьшило общее соотношение FRET, а также ΔR в растворе с 75% до почти 40% по сравнению с датчиком Glu ^[-]. Однако после иммобилизации датчик Glu ^{[+ Halo]} восстанавливает функциональность и высокую интенсивность сигнала (ΔR 74%) датчика Glu ^[-] (подробности см. В дополнительном файле 1: Рисунок S1). Этот удивительный результат можно объяснить следующим образом: как мы показали ранее, эффективность FRET (интенсивность сигнала) сильно зависит от расстояния и гибкости донорного FP mTurquoise2 относительно центрального связывающего глюкозу белка (MglB) [20].Из-за аналогичного размера FP и HaloTag ^® (около 30 кДа) нельзя исключить отрицательные стерические эффекты C-концевого HaloTag ^® в растворимой рецептуре сенсора, что могло бы объяснить снижение общей эффективности переноса, как показано в спектрах излучения (рис. 4). Здесь пониженная эффективность переноса отражается в уменьшенном излучении акцепторной Венеры после возбуждения донора mTurquoise2 (λ _ex = 425 ± 9 нм). Поскольку HaloTag ^® расположен на С-конце сенсора, белок, вероятно, искажается, тем самым изменяя расстояние и / или ориентацию между донором и акцептором.Иммобилизация на поверхности шариков Sepharose ^® предположительно снижает взаимодействие HaloTag ^® с партнерами FRET, что приводит к восстановлению функциональности. Примечательно, что на сродство (K _d) датчика не влияет ни добавление метки, ни иммобилизация. В растворимом составе, а также в иммобилизованной форме сродство оставалось в том же диапазоне (0,8 мМ ± 0,2 мМ), что указывает на то, что HaloTag ^® не влияет на сайт связывания d-глюкозы (дополнительный файл 1: рисунок S1).
Рис. 4
Спектры излучения датчика Glu ^{[+ Halo]} ( a ) не иммобилизованного и ( b ) иммобилизованного на смоле HaloLink ^®. Спектры получали после возбуждения FRET-донора mTurquoise2 при λ _ex = 425 нм (± 9 нм) в присутствии (черная кривая) и отсутствии (серая кривая) 1 М d-глюкозы. Интенсивности нормированы на излучение при 485 нм (λ _em mTurquoise2)
По сравнению с другими методами иммобилизации для таких датчиков, такими как инкапсуляция, сайт-ориентированная иммобилизация с помощью HaloTag ^® не превосходит ни гибкость, ни отрицательно сказывается доступность обездвиженного датчика.В предыдущем исследовании аналогичный датчик d-глюкозы на основе FRET был инкапсулирован в частицы кремнезема, что значительно снизило интенсивность FRET [38]. Кроме того, биосенсор может быть иммобилизован непосредственно из неочищенного клеточного экстракта, что позволяет избежать трудоемкой и дорогостоящей хроматографической очистки белка [39].
Онлайн-применение иммобилизованного сенсора Glu
^{[+ Halo]}

С сенсором Glu ^{[+ Halo]}, ковалентно иммобилизованным на поверхности шариков сефарозы ^®, устойчивость сенсора к механическим воздействиям была значительно увеличена , что было необходимым условием для применения этих шариков непосредственно в культивировании микробов (дополнительный файл 1: Рисунок S6).Хотя иммобилизация решает проблемы стабильности, тушение среды CGXII остается. Кроме того, увеличение концентрации C. glutamicum также приводит к увеличению фона из-за аутофлуоресценции [40]. Чтобы преодолеть это, иммобилизованный сенсор Glu ^{[+ Halo]} был протестирован в среде M9, типичной среде культивирования для Escherichia coli [32]. Несмотря на снижение ΔR до 35%, изменение отношения FRET заметно (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S3).Как следствие, измерения в среде M9 можно проводить с датчиком непосредственно в культивировании, что упрощает онлайн-приложение.

Результаты онлайн-применения иммобилизованного сенсора Glu ^{[+ Halo]} во время культивирования E. coli K12 MG1655 в среде M9 показаны на рис. 5. На протяжении всего культивирования отслеживались оба флуоресцентных сигнала сенсора. с помощью BioLector ^® и был рассчитан FRET-коэффициент (I _A / I _D).Затем рассчитывалась внеклеточная концентрация d-глюкозы на основе отношения FRET и калибровки иммобилизованного сенсора Glu ^{[+ Halo]} в той же среде в той же цветочной пластине (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S9 для калибровки). . За потреблением d-глюкозы можно было следить в течение всего эксперимента по культивированию (20 ч). Здесь датчик Glu ^{[+ Halo]} имел диапазон обнаружения от 0,02 до 2 мМ (от 0,0036 до 0,36 г л ^-1). В соответствии с этим диапазоном после истощения d-глюкозы (через 18 ч) дальнейшее изменение сигнала FRET не могло быть обнаружено.Несмотря на то, что в среде не осталось d-глюкозы, биомасса увеличилась еще больше, предположительно в результате метаболизма переполнения [41].

Рис. 5

FRET-отношение ( a ), истощение глюкозы ( b ) и рост биомассы ( c ) при культивировании E. coli в среде M9, измеренное с помощью иммобилизованного биосенсора на основе FRET на смоле HaloLink ^®. Коэффициент FRET использовался для расчета текущей концентрации d-глюкозы на основе калибровки иммобилизованного сенсора (см. Дополнительный файл 1: Рисунок S9)

Преимущество онлайн-измерения согласуется с недостатком ограничения определенным измерительным окном, определяемым динамическим диапазоном датчика.В отличие от измерений на месте, где конечная концентрация d-глюкозы в образцах может быть адаптирована к сродству сенсора, для онлайн-измерений требуются либо сенсоры с более широким динамическим диапазоном, либо другие сенсоры с соответствующим сродством, чтобы охватить более широкий диапазон концентраций целевого метаболита. . Сродство сенсора d-глюкозы можно регулировать либо соответствующей аминокислотной заменой в связывающих глюкозу белках [24, 42, 43], выбирая альтернативные связывающие глюкозу белки с более низким сродством [44, 45], либо вставляя линкер последовательности [9, 20].Поскольку до сих пор не известен сенсор на основе FRET с очень широким диапазоном обнаружения [7], комбинация нескольких сенсоров d-глюкозы с разной аффинностью и пар FRET, иммобилизованных на одном носителе, может рассматриваться как расширение диапазона обнаружения.

Границы | FRET в биофизике мембран: обзор

Введение

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это фотофизический процесс, при котором первоначально электронно возбужденный флуорофор, называемый донором (D), передает свою энергию возбуждения (и, таким образом, гасится) другому хромофору, называемому акцептором (A), электронный спектр поглощения которого перекрывает эмиссию D.Последний, первоначально находящийся в основном электронном состоянии, возбуждается при переносе и может (а может и не) флуоресцировать. FRET не включает ни эмиссию фотонов, ни молекулярный контакт между двумя видами, но сильно зависит от расстояния между ними. Для изолированной донорно-акцепторной пары коэффициент скорости (первого порядка) для взаимодействия FRET пропорционален обратной шестой степени этого расстояния (Förster, 1949). Характерная длина для FRET — это радиус Ферстера, R ₀, определяемый как расстояние донор / акцептор, для которого FRET в данной паре D / A эффективен на 50% (то есть так же вероятен, как и другие процессы D затухание возбуждения).На практике диапазон расстояний, для которого чувствителен FRET, составляет от 0,5 R ₀ до 2 R ₀, поскольку эффективность FRET в этом интервале изменяется от 98,5 до 1,5%. Значение R ₀ характерно для каждой пары ЦАП в данной среде, но обычно находится в диапазоне от 1,5 до 6 нм. Это означает, что FRET в основном чувствителен к расстояниям в масштабе от 1 до 10 нм, что недостижимо для традиционных методов оптической микроскопии, но полностью соответствует изучению важных вопросов биофизики мембран, таких как обнаружение и определение характеристик. нанодоменов / рафтов и взаимодействия липид-белок или белок-белок (Рисунок 1).

Рис. 1. Схематическое изображение применения FRET в биофизике мембран . Изображена только одна двухслойная листовка. (А) неоднородность мембраны; (B) определение поперечного расположения флуоресцентного остатка / метки; (C) селективность белок / липид; (D) олигомеризация белка.

Могут быть предусмотрены различные подходы, начиная от качественных исследований изменения эффективности FRET в установившемся режиме, без учета лежащей в основе кинетики, до анализа данных флуоресценции с временным разрешением с соответствующими формализмами, позволяющими количественно восстанавливать топологическую информацию о системе под изучение.До недавнего времени эти последние сложные приложения в основном ограничивались простыми системами (обычно одно- или двухкомпонентными модельными мембранами), в то время как FRET изучает сложные системы, такие как мембраны живых клеток (для которых получение качественных данных флуоресценции с временным разрешением требовалось технически невыполнимо) полагались на более качественные обработки. В настоящее время, с огромным развитием методов, основанных на флуоресцентной микроскопии, пространственное и временное разрешение могут быть эффективно объединены с изучением реальных биологических мембран.В этом обзоре описываются основные формализмы FRET в мембранах и указываются важные иллюстративные приложения FRET к множеству проблем в мембранных системах (Таблица 1).

Таблица 1 . Избранные примеры исследований мембран FRET .

Феноменологические применения FRET в мембранах

Даже если FRET используется в качестве качественного индикатора близости хромофора, без учета его реальной кинетики, все еще существует широкий спектр приложений в биофизике мембран.Кроме того, сложность некоторых систем является серьезным препятствием для применения сложных формализмов, и более феноменологический подход может быть единственным доступным вариантом.

Классическим применением FRET является мониторинг липидного обмена или смешивания и слияния мембран, как описано Struck et al. (1981). Эти авторы проследили слияние везикул фосфатидилсерина (PS), вызванное ионом кальция. Смешивали две популяции везикул, одна из которых содержала зонды D и A, а другая — только немеченый фосфолипид.Выбранная пара FRET состояла из меченых фосфолипидов N — (7-нитро-2,2,3-бензоксадиазол-4-ил) фосфатидилэтаноламин (NBD-PE, D) и N — (лиссамин Родамин B сульфонил ) -диолеоилфосфатидилтаноламин (Rh-PE, A), и с тех пор стала, вероятно, наиболее часто используемой парой в исследованиях мембран FRET. При добавлении иона кальция слияние вызывает смешивание меченых и немеченых везикул. После перераспределения липидов за счет боковой диффузии поверхностная концентрация акцепторных зондов, окружающих каждого донора, уменьшается.Это приводит к уменьшению степени тушения донора FRET, эффективность передачи энергии снижается и, следовательно, увеличивается интенсивность эмиссии донора. Другая возможность состоит в том, чтобы отслеживать увеличение эффективности FRET (уменьшение флуоресценции D) при смешивании популяции везикул, меченных только D, с другими, только меченными A, как показано в недавнем исследовании SNARE-опосредованного слияния (van den Bogaart et al. ., 2010).

При изучении латерального распределения липидов FRET между зондами с идентичными характеристиками распределения станет более эффективным в результате разделения фаз (и, наоборот, для зондов, демонстрирующих предпочтение комплементарной фазы).Однако разделение зонда — не единственное явление, которое может повлиять на эффективность FRET. При изменении состава мембраны могут происходить вариации площади / липида и фотофизических параметров зонда (и, следовательно, R ₀), что потенциально может привести либо к ошибочной идентификации, либо к маскировке образования домена. С этой целью могут быть разработаны оригинальные схемы для более точного обнаружения начала формирования домена, такие как предложенная Сильвиусом (2003), в которой эффективности FRET получены с акцептором, имеющим сродство к одной из липидных фаз и двум различным донорам. которые распределяются по разным мембранным доменам.Пока мембрана является гомогенной, вариации липидного состава будут одинаково влиять на эффективность FRET обеих пар D / A. Однако, если домены образуются, два донора разделяются на разные фазы, и эффективность тушения для каждой из них будет затронута противоположным образом.

Как упомянуто ниже, разделение D или A можно количественно оценить по параметрам разрешенной во времени флуоресценции D в присутствии A (анализируется глобально вместе с флуоресценцией в отсутствие A).FRET также можно использовать более простым способом в качестве индикатора предпочтения домена, как это проиллюстрировано недавно предложенным «FRET анализом ассоциации рафтов» (Nelson et al., 2010). Эффективность FRET между исследуемым белком (D) и одним из двух акцепторов, пирен-ДОФЭ (предпочитает фазу ld) и LcTMADPH (предпочитает фазу lo), измеряется и сравнивается с использованием других доноров, пептида LW (тип трансмембранной спирали). пептид с высоким сродством к доменам ld) и холерный токсин-B (белок, который связывается с ганглиозидом GM1, ассоциированным с рафтом, и имеет очень высокое сродство к доменам lo) в смеси липидов сосуществования в фазах ld / lo.Таким образом, в примерах этих авторов показано, что перфринголизин O имеет промежуточное сродство к рафту между пептидом LW и холерным токсином-B в везикулах, содержащих упорядоченные домены, богатые сфингомиелином головного мозга или 1,2-дистеароил- sn -3-глицерофосфохолин ( DSPC).

При исследовании липид / белкового взаимодействия FRET между, например, мембранным пептидом или белком D и липидными акцепторами различных классов / ацильных цепей может указывать на предпочтительную ассоциацию или селективность для конкретного типа липидов, а FRET между D-несущими и А-несущие мембранные белки можно использовать для обнаружения образования гетеро- или гомоолигомеров белка.В этом случае количественные модели необходимы для дальнейшей характеристики этих взаимодействий (см. Формализмы для взаимодействия липид-белок или белок-белок ниже).

Внутримолекулярный FRET: «спектроскопическая линейка»

Резонансный перенос энергии Ферстера между парами D / A, для которых расстояние D – A одинаково, например, подтвержденный в растворе двух хромофорных частиц, часто называют «внутримолекулярным» FRET. Количественную оценку степени FRET дает эффективность FRET, E , которая рассчитывается как

в этом уравнении, i _D ( t ) и i _DA ( t ) являются распадами D в отсутствие и в присутствии A (соответственно).Эффект FRET на флуоресценцию D заключается в уменьшении его времени жизни и квантового выхода. В этом простом случае закон затухания D остается экспоненциальным, хотя и быстрее, чем в отсутствие акцептора. Связь между временем жизни D в отсутствие и в присутствии A (τ ₀ и τ соответственно) определяется выражением

, где R — разделение D – A. Выражение, идентичное формуле. 2 можно записать для квантового выхода флуоресценции или для стационарной интенсивности флуоресценции. R ₀ рассчитывается независимо от спектроскопических данных,

, где κ ² — фактор ориентации (подробное обсуждение см. В Van Der Meer et al., 1994), Φ _D — квантовый выход D в отсутствие A, n — показатель преломления, λ — длина волны (в единицах нм), I (λ) — это нормализованный спектр излучения D, а ε (λ) — молярный спектр поглощения. Таким образом, R легко вычисляется как в стационарном режиме, так и по времени -решенные данные.Это основа использования внутримолекулярного FRET в качестве «спектроскопической линейки» (Страйер, 1978).

В контексте мембранной биофизики внутримолекулярный FRET все еще используется для получения структурной и динамической информации о мембранных белках. Это особенно важно, учитывая, что структуры с высоким разрешением многих мембранных белков (традиционно получаемых с помощью рентгеновской кристаллографии, криоэлектронной микроскопии или ЯМР-спектроскопии) все еще отсутствуют. Сайт-направленное мечение позволяет включать подходящие донорные и акцепторные группы FRET, и, исходя из измерения эффективности FRET, можно изучать белковое картирование и / или кинетику конформационных изменений.Последние приложения перечислены и кратко описаны в таблице 1.

Равномерное распределение флуорофоров в мембранах

В мембранах каждая молекула D обычно окружена распределением молекул A. Следовательно, измерение одиночных расстояний D / A не имеет смысла и неосуществимо. Затухание излучения D становится сложным и зависит от топологии исследуемой системы, а также от концентрации A. Аналитические растворы все еще могут быть получены для равномерного распределения хромофоров.Для планарных распределений D и A распад D в присутствии A дан Фангом и Страйером (1978), Волбером и Хадсоном (1979):

В этом уравнении γ — неполная гамма-функция, R _e — минимальное расстояние D / A (расстояние исключения) и n — числовая концентрация A (молекул на единицу площади). Хотя он был первоначально получен для плоскости акцепторов, содержащей донор ( цис- перенос), он также действителен, если молекула D отделена от плоскости A расстоянием R _e, что является обычным для мембран, поскольку D и A часто расположены на разной глубине бислоя.

При приготовлении липидных пузырьков молекулы D и A часто с равной вероятностью вставляются в любой из двухслойных листочков. В этом случае необходимо рассматривать две плоскости A для данного D, одна из которых соответствует акцепторам, лежащим в той же двухслойной листке, что и донор, а другая — тем, которые расположены в противоположной листке. Закон распада в этом случае получается простым умножением собственного D-распада на члены FRET, соответствующие каждой плоскости A.

Еще одно обычное явление в мембранных системах — сложный распад D даже в отсутствие A, при этом для правильного описания требуется сумма двух или трех экспонент.В этом случае приведенные выше уравнения все еще можно использовать при условии, что экспоненциальный член собственного распада D заменен этой функцией, а τ ₀ заменено средним по интенсивности (Lakowicz, 2006) временем распада. Это так, потому что каждый компонент срока службы характеризуется различным значением R ₀, пропорциональным обратной шестой степени соответствующего квантового выхода флуоресценции Φ _D (уравнение 3). Если все эти компоненты имеют одинаковые константы радиационного распада (обычно хорошее приближение), их значения Φ _D, в свою очередь, пропорциональны значениям τ ₀.Это означает, что скорости FRET для данного A, расположенного на расстоянии R [заданное как (1 / τ ₀) ( R ₀/ R ) ⁶], одинаковы независимо от D Компонент времени жизни учитывается, потому что он инвариантен (Loura et al., 1996, 2000b). Из-за этого постоянства уравнение. 4 можно использовать со средними значениями R ₀ и τ ₀. Здесь можно использовать спектроскопический R ₀ (рассчитанный с экспериментальным усредненным значением Φ _D) и истинное статистическое среднее значение τ ₀, которое является средним по интенсивности.

Для стационарных приложений уравнение. 4 можно интегрировать численно (в программе или электронной таблице) для получения кривых эффективности FRET E (рассчитанных с использованием уравнения 1) как функции концентрации акцепторов n с R _e в качестве параметра. В качестве альтернативы фиксируется R _e, и экспериментальные спады / эффективности FRET сравниваются с теоретическими ожиданиями. Возможная неспособность проанализировать кинетику FRET с помощью формализма равномерного распределения зондов может иметь значение (например,g., добавление нового компонента к данной однофазной двухслойной системе липидов может вызвать компартментализацию и / или разделение фаз и, следовательно, отклонения от теоретического ожидания однородного распределения).

Неравномерное распределение флуорофоров содержит топологическую информацию

Неравномерное распределение компонентов и разделение фаз — обычное явление в липидных смесях. Молекулы, несущие флуорофоры D и A в эксперименте FRET в такой системе, естественно, будут иметь неоднородное распределение после их разделения между сосуществующими фазовыми доменами.Будем считать, что присутствуют только две фазы или типы доменов (наиболее частая экспериментальная ситуация). Если они достаточно велики, чтобы быть бесконечным в масштабе FRET (т. Е. Осложнения, возникающие из-за FRET с участием молекул в разных доменах или граничные эффекты, пренебрежимо малы; это имеет место, если размер доменов превышает ~ 5–10 R ₀), то закон распада донора представляет собой просто линейную комбинацию гипотетических законов распада в каждой фазе i _DA, _{фазе i} (заданных уравнением.4), взвешенное по относительному количеству D в каждой фазе A _i (Loura et al., 2000a, 2001):

Обратите внимание, что времена жизни D обычно различны в двух фазах, как и поверхностные концентрации A (и, возможно, также расстояния исключения D – A). Это вводит большое количество подгоночных параметров в уравнение. 5. Чтобы гарантировать значимое восстановление этих параметров, распад D в присутствии A анализируется глобально вместе с распадом в отсутствие A,

, где τ ₁ и τ ₂ — времена жизни D в каждой фазе.Восстановленные параметры обычно равны τ ₁, τ ₂, A ₂/ A ₁ (из которых получается коэффициент распределения D K _pD), а концентрации A в две фазы: C ₁ и C ₂ (из которых получается коэффициент распределения A K _pA; Loura et al., 2000a). Частным случаем этого формализма является ситуация так называемых «изолированных доноров», которая соответствует C ₂ = 0.

Будучи строго верной для бесконечного разделения фаз, эта модель может быть применена к образованию наноразмерных доменов; в этом случае восстановленный коэффициент распределения A («FRET» K _pA) не будет равен истинному коэффициенту, полученному из независимых измерений (интенсивность флуоресценции, анизотропия или время жизни A) («без FRET» K _pA), и на него влияет (ближе к единице, чем значение «без FRET») тот факт, что доноры в одной фазе чувствительны к акцепторам в другой.Степень этого отклонения отражает размер нанодоменов. В пределе очень малого размера домена (< R ₀) «FRET» K _pA по существу равно единице. Следовательно, этот вид анализа может дать представление о размере доменов и в случае бесконечного разделения фаз (что может быть подтверждено, если значения «FRET» и «non-FRET» K _pA неразличимы) было показано, что фазовая диаграмма бинарной смеси может быть получена из параметров распада (Loura et al., 2001). Бубольц (2007) предложил экспериментальный метод характеристики фазового разделения в липидных мембранах (и определение бинарных и тройных фазовых диаграмм в пределе бесконечной фазы), основанный на этом формализме, но опирающийся исключительно на акцепторную стационарную сенсибилизированную эмиссию. кто назвал это «FRET с постоянным разделением зонда» или SP-FRET. Применения этих методологий перечислены в Таблице 1.

Численное и упрощенное аналитическое рассмотрение FRET в неоднородных системах

Не было получено точного решения скорости или эффективности FRET для случая неполного разделения фаз с доменами нанометрового размера данного типа, диспергированными в непрерывной фазе.Это происходит из-за очевидной потери симметрии, вызванной наличием доменов. Один из способов справиться с этой сложностью — вычислить D-распад с помощью численного моделирования. По сути, процесс начинается с построения топологии липидной матрицы (т. Е. Определения размера моделируемой системы, формы домена, среднего размера и распределения размеров, а затем размещения доменов на матрице, гарантируя, что общая доля каждой фазы равна как предполагалось) и размещение молекул D и A с учетом их предпочтения в домене.Затем выбирается данный D и вычисляется его взаимодействие со всеми акцепторами (или теми, которые находятся в пределах отсечения нескольких длин R ₀). Затем этот шаг повторяется для всех доноров, чтобы получить среднее значение по ансамблю для всей системы. Получают средний распад D, и, используя уравнение. 1 — значение КПД FRET.

Этот вид численного моделирования уже был описан Wolber и Hudson (1979) для равномерного распределения в плоской геометрии для проверки их аналитической теории.Первое численное решение FRET для неравномерного распределения мембранных зондов было дано Снайдером и Фрейром (1982). В этой работе неоднородность распределения зондов была введена путем включения эвристической потенциальной функции в случайное размещение зондов. Таким образом, домены фактически не моделируются, и хотя уравнения авторов подходят для анализа агрегации зондов в однофазной системе, они бесполезны в отношении разделения фаз. Моделирование, в котором неоднородность распределения зонда вводится путем построения двухфазной системы и с учетом разделения зонда, было представлено авторами для проверки их аналитических формализмов (Loura and Prieto, 2000; Loura et al., 2001; Тоулз и Дэн, 2007; Towles et al., 2007).

Другой подход к моделированию состоит в воссоздании процессов возбуждения и снятия возбуждения каждой молекулы D или A путем выполнения стохастического моделирования. Эти расчеты учитывают вероятности возбуждения донора, распада донора не-FRET процессами, FRET на данный акцептор и девозбуждение акцептора. Эффективность FRET просто рассчитывается как отношение общего числа передач к общему числу D-возбуждений.Этот тип моделирования был применен к случаю FRET в плоской геометрии с дисковыми доменами (Kiskowski and Kenworthy, 2007).

Все предыдущие работы характеризуются предварительной фиксацией лежащей в основе липидной матрицы, включая размер и форму домена, а моделирование касается исключительно расчета скоростей и вероятностей FRET. Другой подход был недавно предпринят Frazier et al. (2007), которые объединили моделирование статистической механической решетки методом Монте-Карло (для описания липидной матрицы и генерации в ней положений хромофоров) с упрощенной ступенчатой зависимостью FRET от расстояния (FRET считался возникающим тогда и только тогда, когда расстояние D – A в данной паре были менее R ( ₀) для анализа экспериментальных данных FRET в тройной смеси плот-модель.Эта работа демонстрирует, что FRET и вычислительные методы могут быть объединены для создания мощной комбинации, подходящей для изучения разделения липидных фаз.

В глобальном масштабе численное моделирование имеет то преимущество, что позволяет вычислять FRET в системах, точное решение которых невозможно из-за их сложности. Однако до сих пор они не позволяют напрямую анализировать экспериментальные данные, поскольку в реальном эксперименте ожидается много степеней свободы. Для каждого моделирования необходимо фиксировать значения для R ₀, времени жизни D, расстояния исключения D / A (все они могут быть разными в каждой сосуществующей фазе), формы и размера домена, а также коэффициентов разделения D и A.Такое множество переменных исключает возможность подбора простых эмпирических функций, которые могли бы описать, например, изменение эффективности FRET в зависимости от концентрации A в общем виде, что было бы удобно для большинства исследователей. Изучение конкретной системы требует индивидуальной настройки и процедур моделирования.

Альтернативой численному моделированию FRET в наногетерогенных бислоях является использование упрощенных аналитических методов, которые, в отличие от первого, потенциально могут быть пригодны для прямого анализа экспериментальных данных, позволяющих восстановить интересующие параметры.Однако этот вид формализмов характеризовался либо жесткими упрощающими приближениями (Gutierrez-Merino, 1981; Brown et al., 2007a, b), либо в некоторой степени полагающимися на численные результаты (Towles et al., 2007; см. Loura et al. ., 2010а для подробного обсуждения), что исключает их широкое использование.

Формализмы для взаимодействия липид-белок или белок-белок

Относительно простым применением FRET в мембранных системах, содержащих пептиды / белки, несущие флуоресцентные остатки (триптофан и тирозин), является определение их поперечного расположения.Триптофан и тирозин действуют как доноры передачи энергии, поскольку они поглощают на коротких длинах волн, поэтому следует использовать подходящие акцепторы с известным положением в мембране (см. Таблицу 1). Поскольку эффективность передачи зависит от расстояния исключения D – A, значение R _e (и, следовательно, поперечное расположение) может быть получено путем подгонки уравнений 1 и 4 к экспериментальным данным. Доступен ряд стеариновых кислот, дериватизированных антроилхромофором, которые подробно описаны в литературе (см. E.г., Blatt et al., 1984). Поскольку существует почти неизменность спектров поглощения различных акцепторов, радиус Ферстера постоянен для всех из них, а для триптофана как D он близок к R ₀ = 25 Å. Можно показать, что, когда R _e> приблизительно 1,7 R ₀, получается зависимость типа Штерна – Фольмера (Shaklai et al., 1977; Dewey and Hammes, 1980), выраженная очень простое уравнение

, где I _DA и I _D обозначают интенсивность стационарного излучения D в присутствии и отсутствии A, соответственно.В то время как уравнения 4 и 7 предполагают осевое распределение хромофоров A вокруг остатка D, Yguerabide (1994) обобщил теорию, включив в нее случай, когда D не находится на оси симметрии меченого белка, и распространил ее применимость на случаи, когда R _e < R ₀, что неизбежно с некоторой дополнительной сложностью.

Белки, включенные в модельные мембраны, содержащие липиды с разными электростатическими свойствами или гидрофобной длиной, могут проявлять селективность к одному липидному компоненту на границе раздела белок-липид, что традиционно рассматривалось с помощью спектроскопии электронного спинового резонанса (Marsh and Horváth, 1998).Однако практически идентичную информацию можно получить с помощью FRET. Качественную информацию легко получить, сравнивая степень FRET от белка к флуоресцентно меченным липидам различных классов / ацильных цепей, как упомянуто выше. Было предложено несколько количественных моделей, которые недавно подверглись критическому анализу (Loura et al., 2010b). В таблице 1 перечислены применения этих формализмов к экспериментальным данным FRET.

Характеристика межбелкового взаимодействия с использованием FRET с участием двух различных меченых производных белков или пептидов была описана более 30 лет назад.В уже исторической статье, используя простой формализм, в котором не учитывается межмолекулярный FRET, но учитываются различные схемы олигомеризации (димеры / тримеры / тетрамеры), Вич и Страйер (1977) подтвердили, что гипотеза образования димеров грамицидина (D: дансил-грамицидин) C; A: 4- (диэтиламино) -фенилазобензол-4-сульфонилхлоридное производное грамицидина C) привело к лучшему соответствию модели, чем сценарии образования как тримеров, так и тетрамеров. Агрегация белков мембраны хромаффинных гранул, меченных малеимид-йодоаминонафтилсульфонатом (D) и флуоресцеин-ацетатом ртути или флуоресцеин-5-малеимидом (A), была качественно подтверждена Morris et al.(1982) при добавлении иона кальция. После этих ранних исследований FRET стал важным инструментом в характеристике агрегации белков / пептидов. Необходимо тщательно выбирать формализм, который будет использоваться для анализа данных, поскольку ранние модели фокусируются на внутриагрегатном переносе энергии, игнорируя межмолекулярный FRET «стороннего наблюдателя» (например, Adair and Engelman, 1994; Li et al., 1999). Это приближение, как правило, справедливо только в пределе очень разбавленного меченого белка и обычно используется в недавних работах, применяющих FRET или биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET, см.g., James et al., 2006) к изучению олигомеризации мембранных белков, перечисленных в Таблице 1. Другие методы лечения стремятся вычислить чистый внутриагрегированный член (см. Raicu, 2007 для недавнего примера). Следует отметить, что сочетание внутриагрегатных и межмолекулярных терминов следует проводить осторожно. В частности, неточно вычитать чистую межмолекулярную эффективность из комбинированной межагрегатной и межмолекулярной FRET (You et al., 2005). Если популяция доноров подвергается тушению двумя разными типами акцепторов (например,g., связанных и несвязанных с данным донором), правильный способ расчета эффективности FRET — это умножение членов FRET, соответствующих всем вкладам в гашение, для получения i _DA ( t ) и интегрирование в конец (уравнение 1). Это подтверждается недавним исследованием, в котором сделан вывод, что N-концевой домен N-BAR образует антипараллельные димеры в 1-пальмитоил-2-олеоил- sn -глицеро-3- [фосфорац- (1-глицерин)] (POPG) везикулы (Fernandes et al., 2008).

FRET с улучшенной диффузией

В предыдущих разделах предполагалось, что поступательной диффузией как D, так и A можно пренебречь во время жизни возбужденного состояния D, то есть при условии D _DA τ ₀/ s ² 1 (где D _DA — это сумма коэффициентов боковой диффузии D и A, а с — среднее расстояние D – A).В противном случае быстрая диффузия хромофора приводит к увеличению скорости FRET, что может быть интуитивно понятно, если учесть, что пара D / A, изначально разделенная большим расстоянием, которое препятствовало бы FRET, может стать достаточно близкой для возникновения FRET с высоким вероятность в течение жизни возбужденного состояния D как следствие диффузии.

Общая теория усиленного диффузией FRET была установлена Стейнбергом и Качальски (1968) и экспериментально подтверждена Томасом и др.(1978). Особый интерес представляет так называемый предел быстрой диффузии, характеризуемый величиной D _DA τ ₀/ с ², 1, что приводит к чрезвычайно упрощенным уравнениям для скорости FRET. Это условие требует времени жизни D в диапазоне от микросекунд до миллисекунды, что обычно достижимо с использованием подходящих хелатов лантаноидов в качестве D-частиц. Для равномерного двумерного распределения незаряженных сферических хромофоров можно показать, что получается экспоненциальный D-распад со временем жизни

где

Последнее уравнение (которое, что довольно любопытно, формально идентично уравнению7, который является приблизительным решением совсем другой проблемы) показывает, что скорость FRET в этом режиме сильно зависит от R _e. Это причина того, почему предел быстрой диффузии FRET нашел применение в измерении расстояния ближайшего подхода D – A (где обычно разновидностью A является белок) в 1980-х годах (см. Примеры в таблице 1). Кроме того, усиленная FRET диффузия заряженных частиц D / A чувствительна к электростатическому потенциалу и, следовательно, может использоваться для определения мембранных потенциалов (Meltzer et al., 2006). Удивительно, но недавних применений в мембранах было очень мало, что привело к оживленному комментарию: «С середины 1980-х годов метод [FRET с усиленной диффузией], кажется, бездействовал, ожидая подходящей возможности вернуться к жизни» (Fairclough, 2006 г.).

Homo-FRET против гетеро-FRET

В предыдущих разделах предполагалось, что хромофоры D и A различны (гетеро-FRET). Это подразумевало необратимость процесса переноса, который можно было контролировать, измеряя либо степень тушения D, либо сенсибилизированную флуоресценцию A.Напротив, FRET между идентичными флуорофорами (гомо-FRET) не приводит к снижению интенсивности или времени жизни донорной флуоресценции, поскольку популяция возбужденного состояния донора не уменьшается во время акта переноса. На практике единственной наблюдаемой, которая отражает это явление, является анизотропия флуоресценции (Lakowicz, 2006), которая уменьшается в результате гомотрансфера. Для измерения анизотропии флуоресценции требуются поляризаторы, и, поскольку они приводят к значительному снижению детектируемого излучения, часто требуется большее количество флуорофора (по сравнению с тем, которое использовалось бы при измерении интенсивности) для заданной точности.Если прибор не является проблемой, уменьшение анизотропии совершенно очевидно: если две молекулы разделены расстоянием R = R ₀, измеренная анизотропия будет только ~ 2/3 от анизотропии мономера, что является значительным уменьшением.

Несмотря на очевидное преимущество, заключающееся в том, что требуется только один флуорофор, использование гомо-FRET более ограничено, чем гетеро-FRET. Рационализация степени деполяризации из-за гомо-FRET более сложна, чем тушение из-за гетеро-FRET, потому что: (i) существует возможность обратного переноса на непосредственно возбужденный донор или передачи любому донору, в конечном итоге включает в себя большое количество этапов переноса и (ii) из-за анизотропии флуоресценции, соответствующей наблюдаемой, в дополнение к RET, другим источником деполяризации является вращение флуорофора.Если вращение и RET происходят в одном и том же масштабе времени, эти два явления взаимосвязаны, что является основным препятствием для количественного анализа данных гомотрансфера. К теоретическим описаниям, которые не учитывают эти особенности должным образом (например, Yeow and Clayton, 2007), следует относиться с осторожностью. Несмотря на эту сложность, гомо-FRET по-прежнему регулярно используется в исследованиях мембран, в последнее время в сочетании с флуоресцентной микроскопией (см. Раздел ниже и таблицу 1; Bader et al., 2011) для обнаружения и характеристики хромофора (например,g., меченый белок) удержание или агрегация. В этой связи следует отметить, что использование объективов с высокой числовой апертурой приводит к уменьшению наблюдаемой анизотропии (Axelrod, 1979). Этот артефакт можно минимизировать, используя более низкую числовую апертуру (≤0,8), с потерей разрешения и чувствительности, или скорректировать, например, с помощью стандартной молекулы (Tramier and Coppey-Moisan, 2008).

FRET под микроскопом

Недавние разработки в области визуализации с многоволновым и поляризационным разрешением привели к широкому использованию визуализации FRET в исследованиях функциональных узлов в клеточных мембранах.Экспериментальные методы визуализации микродоменов мембран и количественной оценки эффективности FRET в микроскопии FRET с акцентом на новые стратегии были рассмотрены в других источниках (Rao and Mayor, 2005; Jares-Erijman and Jovin, 2006; Owen et al., 2007; Padilla-Parra et al. ., 2008). Было разработано несколько подходов для исследования в наноразмерном диапазоне специфических взаимодействий белок-белок, липид-липид или липид-белок в живых клетках, как с использованием гомо-, так и гетеро-FRET.

Клеточные мембраны характеризуются большим количеством липидных и белковых компонентов в неравновесном состоянии.Одним из распространенных упрощений является предположение о двух типах доменов, например, плотный / неплотный или упорядоченный / неупорядоченный. Затем результаты можно сравнить, например, с сосуществованием ld / lo на фазовой диаграмме липидов в тройной модельной системе. Из-за внутренних ограничений, таких как стабильность клеток, и потому что обычно в клетках проводятся микроскопические исследования (чтобы контролировать состояние клеток, знать локализацию флуорофора и использовать сигнал, исходящий только от интересующей мембраны) интенсивность флуоресценции спадает с большое количество фотонов и низкий фоновый сигнал (необходимые для приложений большинства описанных выше формализмов), как правило, недопустимы.Обычно получают стационарные данные и сравнивают с интегрированным формализмом FRET. Даже когда визуализирующая микроскопия времени жизни флуоресценции (FLIM; обзор ее приложений к неоднородности мембран см. В Stöckl and Herrmann, 2010) получены данные о времени жизни (FRET – FLIM), часто получается относительно небольшое количество отсчетов, что означает, что затухание традиционно используется для расчета эффективности FRET по формуле. 1, а не непосредственно анализировать с помощью лежащей в основе кинетической модели FRET. Однако с инструментальными улучшениями, а также развитием новых подходов к анализу (Grecco et al., 2009) эта тенденция меняется на противоположную. Избранные работы, сочетающие FRET и микроскопию, перечислены в таблице 1, в которой кратко описаны иллюстративные литературные отчеты, в которых FRET использовался (по крайней мере) в одном из описанных выше приложений.

Заключение

В этом обзоре описаны применения FRET в биофизике мембран, включая исследования картирования мембранных белков, латеральной гетерогенности (мембранные домены), определения поперечного расположения (глубины) флуоресцентных остатков / меток внутри мембраны, селективности белков / липидов ( предпочтение конкретного липида по отношению к белку) и олигомеризация мембранного белка.

Была рассмотрена сложность FRET в мембранах, представлена оценка гетеро и гомо-FRET, и подробная топологическая информация может быть получена с помощью этой методологии, если адекватное моделирование будет принято во внимание. Критически рассмотрены примеры соответствующих работ в этой области и упомянуты недавние применения FRET под микроскопом, а именно на основе данных с временным разрешением (FRET – FLIM). В целом подчеркивается мощь FRET как инструмента мембранной биофизики.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы признают финансирование FEDER через программу COMPETE и FCT, ссылки на проекты FCOMP-01-0124-FEDER-010787 (FCT PTDC / QUI-QUI / 098198/2008), PTDC / QUI-BIQ / 099947/2008 и PTDC / QUI-BIQ / 112067/2009.

Список литературы

Acasandrei, M.A., Dale, R.E., VandeVen, M., and Ameloot, M. (2006). Двумерный резонансный перенос энергии Ферстера (2D FRET) и гипотеза мембранного плота. Chem. Phys. Lett. 419, 469–473.

CrossRef Полный текст

Аниковский М., Дейл Л., Фергюсон С. и Петерсен Н. (2008). Резонансная передача энергии в клетках: новый взгляд на эффект фиксации и агрегации рецепторов на клеточной мембране. Biophys. J. 95, 1349–1359.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Антоллини, С. С., и Баррантес, Ф. Дж. (1998). Выявление дискретных сайтов для фосфолипидов и стеринов на границе раздела белок-липид в нативной мембране, богатой рецепторами ацетилхолина. Биохимия 37, 16653–16662.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Бадер, А.Н., Хетцл, С., Хофман, Э.Г., Воортман, Дж., Ван Берген и Хенегувен, П. М. П., ван Меер, Г., и Герритсен, Х. К. (2011). Визуализация Homo-FRET как инструмент для количественной оценки кластеризации белков и липидов. Chemphyschem 12, 475–483.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Blatt, E., Chatelier, R.C., and Sawyer, W.H. (1984). Поперечное расположение флуорофоров в липидных бислоях и мицеллах, определяемое методами флуоресценции. Photochem. Photobiol. 39, 477–483.

CrossRef Полный текст

Браун А.С., Тоулз К.Б. и Ренн С.П. (2007a). Измерение размера рафта в зависимости от состава мембраны в системах на базе ПК: часть I — бинарные системы. Langmuir 23, 11180–11187.

CrossRef Полный текст

Браун А.С., Тоулз К.Б. и Ренн С.П. (2007b). Измерение размера рафта в зависимости от состава мембраны в системах на основе ПК: часть II — тройные системы. Langmuir 23, 11188–11196.

CrossRef Полный текст

Бубольц, Дж. Т., Бваля, К., Уильямс, К., и Шутцер, М. (2007). Картирование с высоким разрешением фазового поведения в тройной липидной смеси: зависят ли фазовые границы липид-рафт от процедуры подготовки образца? Langmuir 23, 11968–11971.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Capeta, R.C., Poveda, J.A., and Loura, L.М. С. (2006). Неравномерное распределение мембранных зондов при резонансном переносе энергии: приложение к белково-липидной селективности. J. Fluoresc. 16, 161–172.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Ча А., Снайдер Г. Э., Селвин П. Р. и Безанилла Ф. (1999). Движение в атомном масштабе области измерения напряжения в калиевом канале, измеренное с помощью спектроскопии. Природа 402, 809–813.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Роговица, R.Л., Ниту, Ф., Грубер, С., Колер, К., Зацер, М., Томас, Д. Д., и Фруен, Б. Р. (2009). Картирование на основе FRET кальмодулина, связанного с каналом высвобождения RyR1 Ca2 ⁺. Proc. Natl. Акад. Sci. США 106, 6128–6133.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Роговица, Р. Л., Ниту, Ф., Самсо, М., Томас, Д. Д., и Фруен, Б. Р. (2010). Картирование субъединицы белка, связывающего FK506 рецептора рианодина, с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии. J. Biol. Chem. 285, 19219–19226.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Коутиньо, А., Лура, Л.М.С., Федоров, А., Прието, М. (2008). Выявленная методом FRET защемленная многослойная структура агрегатов лизоцимных и фосфатидилсеринсодержащих мембран. Biophys. J. 95, 4726–4736.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

де Алмейда, Р. Ф. М., Лора, Л.М. С., Федоров А., Прието М. (2005). Липидные рафты имеют разные размеры в зависимости от состава мембраны: исследование резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением. J. Mol. Биол. 346, 1109–1120.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Доманов Ю.А., Молотковский Ю.Г., Горбенко Г.П. (2005). Зависимые от покрытия изменения поперечного расположения цитохрома с в фосфолипидных мембранах, выявленные FRET. Biochim.Биофиз. Acta 1716, 49–58.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фернандес, Ф., Лора, Л. М. С., Чичон, Ф. Дж., Карраскоса, Дж. Л., Федоров А. и Прието, М. (2008). Роль спирали 0 домена N-BAR в формировании кривизны мембраны. Biophys. J. 94, 3065–3073.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фернандес Ф., Лора Л.М.С., Федоров А. и Прието М.(2006). Отсутствие кластеризации фосфатидилинозитол- (4,5) -бисфосфата в жидком фосфатидилхолине. J. Lipid Res. 47, 1521–1525.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фернандес, Ф., Лора, Л. М. С., Кохорст, Р., Спруайт, Р. Б., Хемминга, М. А., Федоров, А., Прието, М. (2004). Количественная оценка белково-липидной селективности с использованием FRET: приложение к основному белку оболочки M13. Biophys. J. 87, 344–352.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фернандес, Ф., Лора, Л. М. С., Прието, М., Кохорст, Р., Спруйт, Р. Б., и Хемминга, М. А. (2003). Зависимость олигомеризации и латеральной сегрегации основного белка оболочки М13 от состава бислоя. Biophys. J. 85, 2430–2441.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Förster, T. (1949). Experimentelle und Theoretische Untersuchung des Zwischenmolekularen übergangs von Elektrinenanregungsenergie. Z. Naturforsch. 4а, 321–327.

Фрейзер, М. Л., Райт, Дж. Р., Покорный, А., и Алмейда, П. Ф. Ф. (2007). Исследование образования доменов в смесях сфингомиелин / холестерин / POPC с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии и моделирования Монте-Карло. Biophys. J. 92, 2422–2433.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фунг, Дж. Дж., Деупи, X., Пардо, Л., Яо, X. Дж., Велес-Руис, Г. А., Деври, Б. Т., Сунахара, Р. К., и Кобилка, Б.К. (2009). Регулируемая лигандом олигомеризация бета (2) -адренорецепторов в модельном липидном бислое. EMBO J. 28, 3315–3328.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Гамбхир А., Хангьяс-Михалине Г., Зайцева И., Кафисо Д. С., Ван Дж., Мюррей Д., Пентяла С. Н., Смит С. О. и Маклафлин С. (2004). Электростатическая секвестрация PIP2 на фосфолипидных мембранах основными / ароматическими областями белков. Biophys. J. 86, 2188–2207.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Госвами, Д., Гоуришанкар, К., Билграми, С., Гош, С., Рагхупати, Р., Чадда, Р., Вишвакарма, Р., Рао, М., и мэр, С. (2008). Нанокластеры GPI-заякоренных белков формируются кортикальной активностью, управляемой актином. Ячейка 135, 1085–1097.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Гутьеррес-Мерино, К. (1981). Количественное определение переноса энергии Ферстера для двумерных систем.I. Боковое разделение фаз в однослойных везикулах, образованных бинарными смесями фосфолипидов. Biophys. Chem. 14, 247–257.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Гутьеррес-Мерино, К., Мунконге, Ф., Мата, А. М., Ист, Дж. М., Левинсон, Б. Л., Напье, Р. М., и Ли, А. Г. (1987). Положение сайта связывания АТФ на (Ca ²⁺ + Mg ²⁺) -АТФазе. Biochim. Биофиз. Acta 897, 207–216.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Хардинг П.J., Attrill, H., Boehringer, J., Ross, S., Wadhams, G.H., Smith, E., Armitage, J.P., and Watts, A. (2009). Конститутивная димеризация рецептора, сопряженного с G-белком, рецептора нейротензина 1, реконструированного в фосфолипидные бислои. Biophys. J. 96, 964–973.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Харикумар, К. Г., Хаппс, Р. М., и Миллер, Л. Дж. (2008). Димеризация в отсутствие олигомеризации высшего порядка рецептора секретина, связанного с G-белком. Biochim. Биофиз. Acta 1778, 2555–2563.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Heberle, F. A., Wu, J., Goh, S. L., Petruzielo, R. S., and Feigenson, G. W. (2010). Сравнение трех смесей тройных липидных бислоев: FRET и ESR выявляют нанодомены. Biophys. J. 99, 3309–3318.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Херрерос, Дж., Нг, Т., и Скьяво, Г.(2001). Липидные рафты действуют как специализированные домены для связывания столбнячного токсина и интернализации в нейроны. Мол. Биол. Cell 12, 2947–2960.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст

Хофман, Э. Г., Руонала, М. О., Бадер, А. Н., ван ден Хеувель, Д., Воортман, Дж., Руверс, Р. К., Верклей, А. Дж., Герритсен, Х. К., и ван Берген ан Хенегувен, П. М. П. (2008). EGF вызывает слияние различных липидных рафтов. J. Cell. Sci. 121, 2519–2528.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Джеймс, Дж. Р., Оливейра, М. И., Кармо, А. М., Ябони, А., и Дэвис, С. Дж. (2006). Строгая экспериментальная основа для обнаружения олигомеризации белков с использованием биолюминесцентного резонансного переноса энергии. Нат. Методы 3, 1001–1006.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Джонсон, Д. А., и Нусс, Дж. М. (1994). Чувствительный к гистрионикотоксину сайт связывания этидия расположен за пределами трансмембранного домена никотинового ацетилхолинового рецептора: исследование флуоресценции. Биохимия 33, 9070–9077.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Кенуорти, А. К., и Эдидин, М. (1998). Распределение гликозилфосфатидилинозитол-заякоренного белка на апикальной поверхности клеток MDCK, исследованных с разрешением <100 Å с использованием визуализации переноса энергии резонанса флуоресценции. J. Cell Biol. 142, 69–84.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Кусба, Ю., Ли, Л., Грычинский, И., Пищек, Г., Джонсон, М., и Лакович, Дж. Р. (2002). Коэффициенты боковой диффузии в мембранах, измеренные с помощью резонансной передачи энергии и нового алгоритма диффузии в двух измерениях. Biophys. J. 82, 1358–1372.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Лакович, Дж. Р. (2006). Принципы флуоресцентной спектроскопии , 3-е изд. Нью-Йорк: Спрингер.

Ледер, Р.О., Хелгерсон, С. Л., и Томас, Д. Д. (1989). Поперечное расположение хромофора сетчатки в пурпурной мембране за счет передачи энергии, усиленной диффузией. J. Mol. Биол. 209, 683–701.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Леви В., Росси Дж. П. Ф. К., Кастелло П. Р. и Флеча Ф. Л. Г. (2003). Количественный анализ мембранных белок-амфифильных взаимодействий с использованием резонансного переноса энергии. Анал. Biochem. 317, 171–179.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Леви В., Росси Дж. П. Ф. К., Эшарт М. М., Кастелло П. Р. и Флеша Ф. Л. Г. (2000). Термическая стабильность кальциевого насоса плазматической мембраны. Количественный анализ его зависимости от липидно-белковых взаимодействий. J. Membr. Биол. 173, 215–225.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Ли, М., Редди, Л.Г., Беннет, Р., Сильва, Н.Д. мл., Джонс, Л. Р., и Томас, Д. Д. (1999). Метод переноса энергии флуоресценции для анализа олигомерной структуры белка: приложение к фосфоламбану. Biophys. J. 76, 2587–2599.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., Коутиньо, А., Сильва, А., Федоров, А., Прието, М. (2006). Структурные эффекты основного пептида на организацию мембран дипальмитоилфосфатидилхолин / дипальмитоилфосфатидилсерин: исследование флуоресцентного резонансного переноса энергии. J. Phys. Chem. B 110, 8130–8141.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Лора, Л. М. С., Федоров, А., Прието, М. (1996). Резонансный перенос энергии в модельной системе мембран: приложение к гелевой и жидкокристаллической фазам. Biophys. J. 71, 1823–1836.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Лора, Л. М. С., Федоров, А., Прието, М. (2000a).Разделение мембранных зондов в двухкомпонентной липидной системе гель / жидкость: исследование резонансного переноса энергии флуоресценции. Biochim. Биофиз. Acta 1467, 101–112.

CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., Федоров, А., Прието, М. (2000b). Неоднородность распределения мембранного зонда: исследование резонансной передачи энергии. J. Phys. Chem. B 104, 6920–6931.

CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., Фернандес, Ф., и Прието, М. (2010a). Микрогетерогенность мембраны: резонансная характеристика переноса энергии Фёрстера в латеральных доменах мембраны. Eur. Биофиз. J. 39, 589–607.

CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., Прието, М., и Фернандес, Ф. (2010b). Количественная оценка белково-липидной селективности с помощью FRET. Eur. Биофиз. J. 39, 565–578.

CrossRef Полный текст

Лора, Л.М.С., и Прието, М. (2000). Резонансный перенос энергии в гетерогенных плоских и двухслойных системах: теория и моделирование. J. Phys. Chem. B 104, 6911–6919.

CrossRef Полный текст

Марш Д. и Хорват Л. И. (1998). Структура, динамика и состав липид-белковой границы. Перспективы спин-этикетирования. Biochim. Биофиз. Acta 1376, 267–296.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст

Мельцер, Р. Х., Лурц, М. М., Венсель, Т. Г., и Педерсен, С. Е. (2006). Электростатика никотинового ацетилхолинового рецепторного канала определяется усиленной диффузией передачей энергии люминесценции. Biophys. J. 91, 1315–1324.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Мерсье, Дж. Ф., Салахпур, А., Анже, С., Брейт, А., и Бувье, М. (2002). Количественная оценка гомо- и гетеродимеризации бета-1- и бета-2-адренорецепторов по резонансному переносу энергии биолюминесценции. J. Biol. Chem. 277, 44925–44931.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Мейер, Б.Х., Сегура, Ж.-М., Мартинес, К. Л., Ховиус, Р., Джордж, Н., Джонссон, К., и Фогель, Х. (2006). Визуализация FRET показывает, что функциональные рецепторы нейрокинина-1 являются мономерными и находятся в микродоменах мембран живых клеток. Proc. Natl. Акад. Sci. США 103, 2138–2143.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Моррис, С. Дж., Судхоф, Т. К., и Хейнс, Д. Х. (1982). Резонансный перенос энергии, стимулируемый кальцием, между флуоресцентно меченными белками во время агрегации мембран хромаффинных гранул. Biochim. Биофиз. Acta 693, 425–436.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Нараянасвами, В., и МакНэми, М. Г. (1993). Белок-липидные взаимодействия и функция никотинового ацетилхолинового рецептора Torpedo californica . 2. Текучесть мембраны и лиганд-опосредованное изменение доступности остатков цистеина гамма-субъединицы для холестерина. Биохимия 32, 12420–12427.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Нельсон, Л.Д., Чейнтия, С., Лондон, Э. (2010). Ассоциация перфринголизина O с упорядоченными липидными доменами: влияние на сродство трансмембранного белка к рафту. Biophys. J. 99, 3255–3263.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Номикос, М., Малгрю-Несбитт, А., Паллави, П., Михалин, Г., Зайцева, И., Суонн, К., Лай, Ф.А., Мюррей, Д., и Маклафлин, С. (2007) . Связывание фосфоинозитид-специфической фосфолипазы C-ξ (PLC-ξ) с фосфолипидными мембранами. J. Biol. Chem. 282, 16644–16653.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Падилья-Парра, С., Одуж, Н., Коппи-Мойзан, М., и Трамье, М. (2008). Количественный FRET-анализ с помощью быстрого сбора данных FLIM во временной области с высоким пространственным разрешением в живых клетках. Biophys. J. 95, 2976–2988.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Пап, Э. Х. У., Бастианс, П.И. Х., Борст, Дж. У., ван ден Берг, П. А. У., ван Хук, А., Снук, Г. Т., Виртц, К. В. А. и Виссер, А. Дж. У. Г. (1993). Количественное определение взаимодействия протеинкиназы C с диацилглицерином и фосфоинозитидами с помощью детектирования резонансной передачи энергии с временным разрешением. Биохимия 32, 13310–13317.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Picas, L., Suárez-Germà, C., Montero, M. T., Vázquez-Ibar, J. L., Hernández-Borrell, J., Прието, М., и Лора, Л.М.С. (2010). Селективность липидов лактозопермеазы с использованием резонансного переноса энергии Ферстера. Biochim. Биофиз. Acta 1798, 1707–1713.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Поведа, Дж. А., Энсинар, Дж. А., Фернандес, А. М., Матео, К. Р., Феррагут, Дж. А., и Гонсалес-Рос, Дж. М. (2002). Сегрегация доменов, богатых фосфатидной кислотой, в восстановленных мембранах рецепторов ацетилхолина. Биохимия 41, 12253–12262.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Шарма П., Варма Р., Сарасидж Р. К., Ира, Гуссет К., Кришнамурти Г., Рао М. и мэр С. (2004). Наноразмерная организация множественных GPI-заякоренных белков в мембранах живых клеток. Cell 116, 577–589.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Сильвиус, Дж. Р. (2003). Передача энергии флуоресценции выявляет образование микродоменов при физиологических температурах в липидных смесях, моделирующих внешний листок плазматической мембраны. Biophys. J. 85, 1034–1045.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Стейнберг И. З., Качальски Э. (1968). Теоретический анализ роли диффузии в химических реакциях, тушении флуоресценции и безызлучательном переносе энергии. J. Chem. Phys. 48, 2404–2410.

CrossRef Полный текст

Страйер, Л. (1978). Перенос энергии флуоресценции как спектроскопическая линейка. Annu. Rev. Biochem. 47, 829–846.

CrossRef Полный текст

Валенсуэла, К. Ф., Вайн, П., Игерабид, Дж., И Джонсон, Д. А. (1994). Поперечное расстояние между мембраной и сайтами связывания агонистов на рецепторе ацетилхолина Torpedo: исследование флуоресценции. Biophys. J. 66, 674–682.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

ван ден Богаарт, Г., Холт, М.Г., Бунт, Г., Ридель, Д., Воутерс, Ф. С., и Ян, Р. (2010). Для слияния мембран достаточно одного комплекса SNARE. Нат. Struct. Мол. Биол. 17, 358–364.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Van Der Meer, B. W., Coker, G. III, and Chen, S.-Y. С. (1994). Резонансный перенос энергии: теория и данные . Нью-Йорк: ВЧ.

Витч В. и Страйер Л. (1977). Димерная природа трансмембранного канала грамицидина А: исследования проводимости и передачи энергии флуоресценции гибридных каналов. J. Mol. Биол. 113, 89–102.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Фон Арним, CAF, Kinoshita, A., Peltan, ID, Tangredi, MM, Herl, L., Lee, BM, Spoelgen, R., Hshieh, TT, Ranganathan, S., Battey, FD, Liu, CX, Бакскаи, Б.Дж., Север, С., Иризарри, М.К., Стрикленд, Д.К., и Хайман, Б.Т. (2005). Белок, связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности (LRP), представляет собой новый субстрат бета-секретазы (BACE1). Дж.Биол. Chem. 280, 17777–17785.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Егнесваран, С., Вуд, Г. М., Эсмон, К. Т., и Джонсон, А. Э. (1997). Белок S изменяет расположение активного центра активированного протеина C над поверхностью мембраны. Исследование топографии с флуоресцентным резонансным переносом энергии. J. Biol. Chem. 272, 25013–25021.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Йеу, Э.К. Л. и Клейтон А. Х. А. (2007). Подсчет состояний олигомеризации мембранных белков в живых клетках методами гомо-FRET-спектроскопии и микроскопии: теория и применение. Biophys. J. 92, 3098–3104.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

Ю, М., Ли, Э., Уимли, В. К., и Христова, К. (2005). Фёрстеровский резонансный перенос энергии в липосомах: измерения димеризации трансмембранной спирали в естественной двухслойной среде. Анал. Biochem. 340, 154–164.

Pubmed Аннотация | Pubmed Полный текст | CrossRef Полный текст

«Мне сейчас страшно»: мигранты из США исключены из беспокойства о стимулирующей помощи

В последние дни многие американцы видели, как на их банковские счета поступали стимулирующие чеки, но некоторые, в том числе многие мигранты, живущие в Соединенных Штатах нелегально, лишены возможности получать помощь.

В Нью-Йорке группы защиты иммигрантов, такие как New York Immigrant Coalition (NYIC) и Make the Road, настаивают на том, чтобы штат принял 3 доллара.5 млрд. Фонд, чтобы помочь им.

«Уличные торговцы — это люди, которые предоставляют услуги каждый день … но все же они не имеют права на стимулы», — сказала Тереза Танджан, менеджер по работе с членами NYIC.

«Эти люди полностью исключены … поэтому мы пытаемся найти способ поддержать их», — сказал Танджан.

Рейна, которая отказалась назвать свою фамилию, сказала, что не получала никаких стимулов и не знала, как она справится.

Человек показывает, какая еда у него в сумке в ресторане St.Clements Food Pantry во время пандемии коронавируса (COVID-19) в районе Манхэттена города Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США, 11 декабря 2020 г. REUTERS / Carlo Allegri

Подробнее

«У меня есть работа на каждые восемь дней, работая, зарабатывая 80 долларов. И я не могу жить на 80 долларов », — сказала она. «Мне сейчас страшно. Я должен арендовать квартиру за два месяца».

Она сказала, что жила в районе Нью-Йорка более двух десятилетий после пересечения границы с Мексикой и работает уборщицей.

На митинге в четверг в защиту прав уборщиц Рейна, которая живет со своими двумя маленькими детьми, заявила, что ей удавалось найти постоянные места для уборки пять дней в неделю до прошлогодней изоляции. Но с тех пор количество рабочих мест сократилось до одной.

Активист Make the Road Рейна рассказала, как некоторые из ее товарищей-уборщиков выдержали пандемию только для того, чтобы заразиться коронавирусом на работе.

«Все это утомляет меня, когда я ищу деньги», — сказала она. «Что я собираюсь делать?»

Наши стандарты: принципы доверия Thomson Reuters.

Одноместный? Без детей? Не волнуйтесь: как спланировать уход в более поздние годы

«Рынок услуг по требованию будет лучшим другом для пожилых сирот», — сказала Мэри Ферлонг, консультант Кремниевой долины компаний, обслуживающих пожилых людей.

Например, служба вызова пассажиров Lyft работает с системами здравоохранения и пенсионными сообществами, чтобы обеспечить поездки к неэкстренным медицинским пунктам и другим направлениям. А поскольку финансовая состоятельность часто снижается с возрастом, бездетные одиночки могут зарегистрироваться в такой службе, как EverSafe, которая отслеживает необычные траты счетов и предупреждает клиента или надежного защитника о возможном мошенничестве.

Домашние технологии, такие как напоминания о лекарствах, также могут помочь людям дольше жить в безопасности в одиночестве, считают эксперты. Помимо системы домашнего мониторинга EyeOn, г-жа Певелер использует устройство Amazon Alexa.

«Если я читаю рецепт, я могу сказать ей, что добавить в список покупок», — сказала г-жа Певелер, которой после мини-мазков труднее запоминать некоторые детали. И ради забавы, она может сказать Алексе, что «издала кошачьи звуки, и одна из моих кошек сойдет с ума».

По мнению экспертов по старению, для тех, кто стареет один, расширение социальных сетей имеет важное значение.Два года назад Кэрол Марак, которой за 60 и живет одна в Далласе, основала группу Elder Orphan в Facebook.

«Мне нужно было место, где можно было бы чувствовать себя менее одиноким и общаться с другими людьми, находящимися в такой же ситуации», — сказала г-жа Марак, которая также является представителем SeniorCare.com, сайта, который предоставляет информацию о местных вариантах ухода. По ее словам, ее членами являются около 6500 бездетных одиноких людей, в основном женщины.

Г-жа Марак сказала, что ее поразило количество членов, которые беспокоились о том, что они «изолированы и отключены от общества».«Она сказала, что изо всех сил пыталась создать свои собственные социальные связи. Она переехала из загородного дома в здание кондоминиума в центре города, где заводит новых друзей. И она организовала бранчи для участников из Далласа на своей странице в Facebook.

Будучи преисполненной решимости оставаться здоровой как можно дольше, г-жа Марак сказала, что она ходит шесть миль в день и ест в основном веганские блюда. «Мне нужно оставаться сильнее, потому что я полностью отвечаю за себя», — сказала она.

Аккорд для гитары F # m для начинающих — Легко играть аккорд F # m

КАК ИГРАТЬ

На этой странице вы узнаете о трех способах игры на гитаре F # m (произносится как F диез минор).

Давайте начнем с самого сложного и перейдем к самому простому. Классический, учебный способ играть в F # m выглядит так:

У вас есть барре, в котором вы помещаете первый палец на все струны на втором ладу, а затем вторым и третьим пальцами ладаете на четвертой и пятой струнах на четвертом ладу.

Эти штанги могут быть действительно сложными, особенно для новичков.

Прочтите ниже два способа упростить игру на этом аккорде или обязательно ознакомьтесь с нашим полным руководством по барре-аккордам:

Более легкий, меньший ствол

Во-первых, чем меньше размер баррелей, тем легче играть.

У вас шесть струн, но это не значит, что вам нужно играть на них все время.

Вместо того, чтобы коснуться пальцем всех струн, вы можете просто покрыть первые три, например:

Вам может показаться, что это легче играть, и вы можете использовать этот аккорд, чтобы почувствовать себя более комфортно, разучивая такты, и заставляя их звучать великолепно.

Самая простая версия аккорда F # m

Но если вы только начинаете и хотите как можно проще сыграть минорный аккорд фа-диез — возможно, у вас есть песня, в которой используется этот аккорд, которую вы действительно хотите сыграть, вот она:

Эта версия имеет все те же ноты , что и две другие, и будет звучать нормально.

И, когда вы будете готовы, вы всегда можете перейти к другой версии.

Собираем все вместе

Если вы заметили, все три версии — это просто разные части одного аккорда.

Посмотрите:

Первая, самая сложная версия использует все шесть струн вашей гитары. Вторая, более легкая версия просто играет на четырех верхних струнах. И третья, самая простая версия (вообще без барре) использует только три высших струны.

Посмотрите, какая версия лучше всего подходит для вас, и продолжайте качаться!

СЛЕДУЮЩИЕ ШАГИ

ТЕОРИЯ

Что такое минорные аккорды?

НАЧИНАЮЩИЙ

Освойте первые 9 аккордов

НАЧИНАЮЩИЙ

Простые настройки для начинающих

СМОТРИ ТАКЖЕ

Аккордов, часто сопровождающих F # m в тональности ля мажор:

Более важные аккорды в тональности F # Minor:

Улучшите свою игру с помощью этих руководств для начинающих:

ВЕСЫ ДЛЯ ГИТАР

3 гаммы Essential для начинающих

БАРРЕХОРД

Полное руководство по барр-аккордам для новичков

Марка	Модель	Объем двигателя л.	Год выпуска
LADA	LARGUS	1,6	2012-
RENAULT	DUSTER	1,2	2010-
RENAULT	DUSTER	1,5	2010-
RENAULT	DUSTER	1,6	2010-
RENAULT	DUSTER	2,0	2010-
RENAULT	LOGAN I	1,0	2004-2015
RENAULT	LOGAN I	1,2	2004-2015
RENAULT	LOGAN I	1,4	2004-2015
RENAULT	LOGAN I	1,5	2004-2015
RENAULT	LOGAN I	1,6	2004-2015
RENAULT	LOGAN II	0,9	2012-
RENAULT	LOGAN II	1,0	2012-
RENAULT	LOGAN II	1,2	2012-
RENAULT	LOGAN II	1,5	2012-
RENAULT	LOGAN II	1,6	2012-
RENAULT	SANDERO I	1,0	2007-2014
RENAULT	SANDERO I	1,2	2007-2014
RENAULT	SANDERO I	1,4	2007-2014
RENAULT	SANDERO I	1,5	2007-2014
RENAULT	SANDERO I	1,6	2007-2014
RENAULT	SANDERO II	0,9	2012-
RENAULT	SANDERO II	1,2	2012-
RENAULT	SANDERO II	1,5	2012-
RENAULT	SANDERO II	1,6	2012-
DACIA	DUSTER	1,2	2010-
DACIA	DUSTER	1,5	2010-
DACIA	DUSTER	1,6	2010-
DACIA	DUSTER	2,0	2010-
DACIA	LOGAN I	1,0	2004-2013
DACIA	LOGAN I	1,2	2004-2013
DACIA	LOGAN I	1,4	2004-2013
DACIA	LOGAN I	1,5	2004-2013
DACIA	LOGAN I	1,6	2004-2013
DACIA	LOGAN II	0,9	2012-
DACIA	LOGAN II	1,0	2012-
DACIA	LOGAN II	1,2	2012-
DACIA	LOGAN II	1,5	2012-
DACIA	LOGAN II	1,6	2012-
DACIA	SANDERO I	1,0	2007-2013
DACIA	SANDERO I	1,2	2007-2013
DACIA	SANDERO I	1,4	2007-2013
DACIA	SANDERO I	1,5	2007-2013
DACIA	SANDERO I	1,6	2007-2013
DACIA	SANDERO II	0,9	2012-
DACIA	SANDERO II	1,2	2012-
DACIA	SANDERO II	1,5	2012-
DACIA	SANDERO II	1,6	2012-

ЛАДА ПРОГРЕСС — официальный дилер LADA в г. Владимир

Появилось первое фото новой Lada Niva — Российская газета

Шарнир рычага балки задней подвески для а/м LADA LARGUS, RENAULT LOGAN, SANDERO «СЭВИ-ЭКСПЕРТ»

Фирменные разработки:

Выгоды автолюбителя:

ООО «Лада Дом» | Главная

Фольклорный ансамбль «Млада» — Белгородский государственный институт искусств и культуры

О коллективе

Официальнй диллер ЛАДА в Москве. LADA по выгодной цене

Специальные предложения

Кредит по государственной программе «Семейный автомобиль»

Кредит по государственной программе «Первый автомобиль»

ООО «Лада М», Москва (ИНН 7726593201, ОГРН 1087746477422)

Сравнение производительности mScarlet-I, mRuby3 и mCherry как акцепторов FRET для mNeonGreen

Abstract

Введение

Материалы и методы

Культивирование клеток и трансфекция

Плазмиды и клонирование

Spectral FRET

Флуоресцентная микроскопия для визуализации на весь срок службы (FLIM)

Конфокальная микроскопия

Иммуноблоттинг

Статистика

Результаты

Физические свойства и спектр белков в этом исследовании

тандемные конструкции mNeonGreen-RFP показывают низкую производительность mRuby3

mNeonGreen — подходящий донор для двухфотонного FLIM

Измерения FLIM-FRET подтверждают плохую работу mRuby3

Конфокальная визуализация демонстрирует более низкую, чем ожидалось, красную флуоресценцию для конструкции mNeonGreen-mRuby3

mRuby3 демонстрирует поведение, аналогичное в нескольких конфигурациях, и поведение, подобное медленно созревающему варианту mScarlet

Экспрессия mNeonGreen-mRuby3 в течение более длительных периодов времени улучшает его производительность

Обсуждение

Заключение

Вспомогательная информация

S1 Рис. Построение сканирования излучения, используемого для спектрального FRET.

S2 Рис. Характеристики EGFP при визуализации с помощью 2-Photon FLIM.

S4 Рис. Иммуноблот тандемных конструкций NG-Stop и NG-Red FP.

S5 Рис. Характеристики mRuby3 в качестве акцептора FRET для GFP, например зелено-желтого FP mClover3.

S6 Рис.Пример кривых затухания из временного ряда NG-mRuby3.

S1 Стол. Аминокислотные последовательности конструкций, использованных в этой рукописи.

Благодарности

Ссылки

A FRET биосенсор выявляет пространственно-временную активацию и функции авроракиназы A в живых клетках

Характеристики сенсора

Прямое нанесение растворимого Glu

Иммобилизация

Онлайн-применение иммобилизованного сенсора Glu

Границы | FRET в биофизике мембран: обзор

Введение

Феноменологические применения FRET в мембранах

Внутримолекулярный FRET: «спектроскопическая линейка»

Равномерное распределение флуорофоров в мембранах

Неравномерное распределение флуорофоров содержит топологическую информацию

Численное и упрощенное аналитическое рассмотрение FRET в неоднородных системах

Формализмы для взаимодействия липид-белок или белок-белок

FRET с улучшенной диффузией

Homo-FRET против гетеро-FRET

FRET под микроскопом

Заключение

Заявление о конфликте интересов

Благодарности

Список литературы

«Мне сейчас страшно»: мигранты из США исключены из беспокойства о стимулирующей помощи

Одноместный? Без детей? Не волнуйтесь: как спланировать уход в более поздние годы

Аккорд для гитары F # m для начинающих — Легко играть аккорд F # m

КАК ИГРАТЬ

Более легкий, меньший ствол

Самая простая версия аккорда F # m

Собираем все вместе

СЛЕДУЮЩИЕ ШАГИ

СМОТРИ ТАКЖЕ

УЗНАТЬ БОЛЬШЕ о CHORDBANK

Добавить комментарий Отменить ответ