Трудоемкость лада ларгус: Регламент технического обслуживания Лада Ларгус » Лада.Онлайн

Содержание

Руководство по эксплуатации LADA Largus универсал

Руководство по эксплуатации LADA Largus универсал

Отправляя сообщение, я соглашаюсь с политикой обработки персональных данных, выражаю свое согласие и разрешаю АО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований. Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Отправляя сообщение, я соглашаюсь с политикой обработки персональных данных, выражаю свое согласие и разрешаю АО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований.

Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Отправляя сообщение, я соглашаюсь с политикой обработки персональных данных, выражаю свое согласие и разрешаю АО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований.

Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Руководство по эксплуатации LADA LARGUS фургон

Руководство по эксплуатации LADA LARGUS фургон | ГК «ЛадаЦентр»

Отправляя сообщение, я соглашаюсь с политикой обработки персональных данных, выражаю свое согласие и разрешаю АО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований.

Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Отправляя сообщение, я соглашаюсь с политикой обработки персональных данных, выражаю свое согласие и разрешаю АО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований.
Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Отправляя сообщение, я соглашаюсь с политикой обработки персональных данных, выражаю свое согласие и разрешаю АО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований.

Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Эксплуатация и ремонт Lada Largus: фургон для жизни и души

 «На лицо татарин я, да с фамилией хохлятской», – пел когда-то Юрий Шевчук. У Ларгуса душевные переживания по поводу определения собственной национальности, похоже, ещё мучительнее. Не знаю, что он спел бы, если бы умел, но «ладья» на бампере и руле Рено Логана, который у нас по привычке считается «французом», в европейских странах – румынской Dacia, а в Мексике – Ниссаном, сидит вроде бы крепко. И если снаружи Ларгус мог в 2012 году напоминать какую-то новую российскую машину, то внутри это всё тот же Логан. Что в этом хорошего? Это – очень надёжно.  Что плохого? Не слишком престижно.

Для нас Largus – машина свежая, она появилась на рынке в 2012 году. Собрать какую-то статистику по машинам с большим пробегом пока проблематично. Но его родство с Логаном даёт возможность делать определённые прогнозы, при этом вполне оптимистичные. Ну а пока посмотрим, сильно ли отличаются ремонт, обслуживание и общее впечатление от владения Ларгусом и старым добрым Логаном.

О вопросах прописки и эмблем

Как я уже говорил, Ларгус – далеко не Лада во всех смыслах этого слова. В 2006 году на Парижском автосалоне был представлен автомобиль Dacia Logan MCV. Это недорогой, но даже по европейским меркам достаточно удобный универсал. К тому времени мир уже знал седан Dacia Logan и достаточно высоко оценил его надёжность. Конечно, и Dacia Logan MCV был принят тепло. С 1999 года компания Dacia принадлежит Renault-Nissan, который к тому же с 2014 владеет контрольным пакетом акций ОАО «АвтоВАЗ». Неудивительно, что Ларгус собран на платформе B0, той же, что используется во многих продуктах альянса, таких как Рено Логан, Сандеро, Дастер, Ниссан Тиида, Note, Альмера и некоторых других. В отличие от Логана и Сандеро, сошедших с конвейера московского «Автофрамоса» под маркой Рено, Ларгус в России выпускается как Лада. В процессе подготовки серийных Ларгусов в конструкцию Логана MCV были внесены некоторые несущественные изменения, но в общем это всё тот же Логан.

А что же значит это благозвучное слово «Ларгус»? В переводе с латыни «Largus» означает «щедрый» или «обширный». Таким именем создатели хотели подчеркнуть объём Ларгуса, простор, предлагаемый автомобилем пассажирам, а в модификации фургона – и грузу. Вряд ли что из этого вышло, латынь у нас толком никто не знает, но звучит красиво.


Двигатель

Ларгус оснащается двумя типами моторов: восьмиклапанным K7M 410 и шестнадцатиклапанным K4M 490. Оба мотора от Рено, оба по 1,6 литра. Наша машина оснащена восьмиклапанным двигателем, располагающим 84 л.с. Так было раньше, до того как Николай, владелец автомобиля и член неофициального Ларгус-клуба, не поставил новые распредвал и дроссельную заслонку и не «чиповал» прошивку. Подробнее о тюнинге мы поговорим ниже, пока посмотрим на то, что осталось нетронутым. Моторы перекочевали сюда из Логана со многими своими преимуществами и недостатками, но от некоторых всё же удалось избавиться. О тонкостях нам рассказали специалисты автосервиса Санкт-Петербургского филиала
Largusservice
.


Оба мотора существенных нареканий не вызывают, но очень не любят высокий уровень масла. Даже если его количество не превышает норму, но приближается к верхней метке щупа, возможна его течь через сальники коленвала. При этом передний сальник приходится менять вместе со звёздочкой. Дело в том, что при выдавливании масла начинается её износ, и самое интересное, что сальник вытачивает на металлической звёздочке вполне ощутимые круговые борозды. На фотографии они хорошо видны. Мастер поясняет причины этого удивительного явления: звёздочки коленвала ещё со времён появления Логана известны не только своим мягким металлом, но ещё и некоторой нездоровой овальностью. И если со второй проблемой справились, и на Ларгусе овальная звёздочка ещё не попадалась, то вопросы к материалу сохранились в полном объёме. Попытки менять только сальник без замены звёздочки успехом не увенчались. Специалист сервиса предупредил: покупаете новый автомобиль – проверьте уровень масла. Если бензин дилеры берут из-под огромной душащей их жабы, то масла в моторах обычно бывает много. Если его уровень превышает метку – слить надо обязательно. Лучшим уровнем, по мнению специалиста, является отметка точно посередине между минимальным и максимальным значениями.


Желание сэкономить на запчастях и ТО есть в крови у многих владельцев как Ларгуса, так и Логана. Желание выполнимо, но есть вещи, на которых лучше не экономить. Это, во-первых, свечи (скажем честно: не та эта сумма, чтобы на маржу купить ещё один Логан), а во-вторых, датчик ГУРа. Датчик этот уже известен «логановодам», скорее всего, узнают о его склонности «потеть» и иногда течь и владельцы Ларгусов. Менять на аналог его не стоит, лучше приобрести оригинал. Скажу по секрету: его можно вообще выкинуть и вкрутить заглушку. Но – тсс! Вмешиваться в рулевое управление – последнее дело. Мастер не советует жадничать при покупке тросика газа. То, что он имеет свойство расплетаться и периодически застревать, нет смысла скрывать, факт общеизвестен. Но ставить лучше оригинальный, потому что аналоги, как правило, ещё хуже. Обслуживание мотора не ударит по карману владельца Ларгуса, работа не сложная, а расходные материалы вполне доступны. Например, замена ремня с роликом на восьмиклапанной машине обойдётся в 3 400 вместе с работой и займёт не более часа. Теперь два совета тем, что любит ковыряться в машине самостоятельно. Во-первых, топливный фильтр стоит один, на бензонасосе, и отдельно картридж не меняется. Впрочем, на Логанах после 2006 года наблюдается та же история: меняется только блок топливного фильтра в сборе. На Логанах до 2006 года фильтр стоял под днищем, и периодичность его замены составляла 30 тысяч. Потом он «переехал» в бензобак, и Ларгус такую диспозицию элемента полностью повторяет. И напоследок: если вы решили впервые в жизни выкрутить свечи, то обратите внимание, что четвёртая свеча вкручена под углом, а не строго вертикально, как остальные. Закручивайте её строго по резьбе, сначала лучше пальцами. Узнать случайно, что такое «футорка», обычно неприятно.


Также бережно стоит относиться к радиатору кондиционера: его конструкция, к сожалению, не всегда позволяет пережить даже мойку под высоким давлением, о камешках с дороги речь не идёт вовсе. Специалисты советуют в обязательном порядке поставить защитную сетку на решётку радиатора либо другим доступным способом обезопасить этот довольно нежный элемент. Осмотр двигателя закончим в задорном ля-мажоре: помпа на Ларгусах смело «ходит» до 120 тысяч, а не до 60, как было с этими моторами на Логанах.

Трансмиссия

Вот тут кое-что новое появилось. На нашем Ларгусе нет пыльника-сальника КПП, который любил протекать на Логанах. Собственно, приводы тут тоже свои, этим Ларгус отличается от очень похожей на него машины. Владелец автомобиля заметил, что его товарищи встречались с проблемой низкого ресурса пыльников ШРУСов. Механики возразили, мол, нет такой проблемы. На всякий случай проверили на нашем экземпляре: все пыльники целые и выглядят новыми. Это хорошо, чаша весов склонилась в пользу специалистов СТО. Но на пыльники всё же посматривать надо: как на любом другом автомобиле, попадание грязи и воды в шарнир выводит узел из строя достаточно быстро. Коробка в целом надёжная, но есть небольшое недостаток: пятая передача короткая, что заставляет ехать по трассе на более высоких оборотах. На надёжность агрегата такая конструктивная особенность не влияет, но у некоторых владельцев Ларгусов не выдерживают нервы, и шестерни пятой передачи ими меняются на другие, с более удобными передаточными числами, благо что такая возможность есть.

Ходовая часть

На задних амортизаторах любой желающий может прочитать: Renault. Лишь немного подвеска отличается от «логановской»: у них разная длина рычагов задней балки. Эта балка доставляла много неприятностей владельцам первых Ларгусов – её неправильная установка вызывала преждевременный износ резины. Сейчас этого дефекта нет.


Что осталось прежним – это запрессованная в рычаг шаровая опора. К сожалению, её замена до сих пор возможна только в сборе с рычагом. И если раньше за «колхозный» метод ремонта с перепрессовкой брались охотно, то сейчас этот метод на СТО не одобряют: конструкция хоть и осталась неразборной, но обрела некоторые незначительные изменения, которые существенно снижают надёжность такого способа. Но тут мастера проявляют великодушие по отношению к аналогам: запчасть можно найти дешевле оригинальной, но к выбору надо подойти серьёзно, качество бывает очень разным. Наш Ларгус – фургон, и это значит, что используется в основном для перевозки грузов. Владелец говорит, что грузы в основном не тяжёлые, но габаритные. Специалист СТО сразу подмечает: непреодолимая тяга некоторых владельцев Ларгуса забить машину кирпичами под завязку приводит к быстрому выходу из строя сайлентблоков. Перегрузки они не любят, и срок их службы очень сильно зависит от того, как часто машина ездит с перегрузом.


Пока машина стоит на подъёмнике, отметим одну деталь, не относящуюся к ходовой. Это неразборный глушитель, менять который можно только с помощью болгарки. Такая конструкция свойственна многим бюджетным автомобилям, и Ларгус не исключение.


Кузов и салон

Конечно, и как семиместный автомобиль, и как фургон Ларгус в России востребован, даже очень востребован. И в этом огромная заслуга не только хорошо показавшей себя на Логанах платформе B0, но и кузова. С учётом различной сборки этих машин и печально наблюдать одни и те же недостатки. Во-первых, любит ржаветь рамка лобового стекла, особенно сверху. На нашей машине этого нет. Специалисты говорят, что будет. Как и ржавчина на стыках сварки порогов. Зато на кромках проёма задних дверей следы уже заметны. Рановато для двухлетней машины, и не погоревать по этому поводу нельзя. Пластик, который используется для наружной отделки, тоже слаб и печален, как котёнок под проливным дождём. Участок над выхлопной трубой уже загибается и плавится под воздействием выхлопных газов. Накладки декоративной решётки радиатора, заходящие в моторный отсек, деформируются под воздействием тепла мотора. Но этого хотя бы не видно.


Салон обычного Ларгуса ничем кардинально не отличается от салона Логана. Но, как я уже говорил, наша машина подверглась тюнингу, и сейчас пришло самое время поговорить о том, что с ней не так. Вернее, наоборот: что у неё как раз так, как надо.


Доводка Ларгуса, и к чему это привело

Говорить обо всём, что испытал на своей шкуре Ларгус, очень долго. Поэтому перечислю то, чего коснулась деятельная рука владельца, а потом остановимся на некоторых моментах подробнее и, конечно, проедем немного за рулём. Итак, было сделано, куплено, установлено: замена штатных форсунок на веерные, упор капота, дефлекторы окон, тепло-шумоизоляция капота, рейлинги и бокс на крыше, защита заднего и переднего бамперов, установка задних оригинальных брызговиков, решетка-сетка бампера, салонный фильтр, фаркоп, установка дефлектора лобового стекла, дополнительная розетка прикуривателя, панель приборов FERRUM GF690, обшивка стенок фургона, подлокотник, дополнительный карман на заднюю дверь, чипование… Я вас немного пожалел, поэтому перечислил только около половины того, что испытал на себе Ларгус. Конечно, ксеноновый свет, диодные фонари, расширители арок и куча ковриков, очечников и прочих мелочей. Если я начну рассказывать обо всём, то у вас есть риск сойти с ума, а у меня – потерять работу, поэтому остановимся на главном, на том, что будет сразу заметным при поездке в этом автомобиле.


Посадка в Ларгусе удобна: она высокая, обеспечивает прекрасный обзор для этого класса автомобилей. И ещё до включения зажигания сталкиваемся с двумя интересными элементами. Во-первых, панели дверей тут стоят от Рено Дастер! Да, как ни странно, они сюда подходят один в один, без всяких переделок. А смотрятся, конечно, солиднее. А с учётом шумо-звукоизоляции и сама дверь стала тяжелее, что привело к появлению солидного звука закрытия двери. Правда, сил надо много, чтобы её захлопнуть, зато звук закрытия безупречен. Богатый звук, приятный. А главное, после него с улицы почти никаких звуков не доносится, и это плюс «шумки».


Во-вторых, панель приборов тут стоит FERRUM GF690, а не штатная от Логана. Не знаю, как вам, а мне не слишком нравится оранжевый цвет подсветки французской панели. Хотя, конечно, дело вкуса. Наша панель не только гораздо симпатичнее, она ещё и функциональнее: бортовой компьютер считывает многие показания с «мозгов», и получается у него всё неплохо. С температурой забортного воздуха он немного не смог определиться, но это уже вопрос установщикам, никто не знает, куда они поставили датчик. Бог с ней, с температурой, градусник на скорость не влияет. Влияет двигатель, и мы его как раз запускаем. На холостых оборотах явно что-то не то: они прыгают от 930 до 980 оборотов в минуту. Чувствуется вибрация, и это не очень приятно. Но всё это лишь одна сторона медали. Имя этой медали – тюнинг ДВС, который заключается в замене распредвала, чиповании, замене дроссельной заслонки. После регулировки на стенде мотор выдал 113 л.с. вместо 84, и это результат неплохой. Если смириться с немного неровной работой на холостых оборотах, то можно даже получать удовольствие. Но – поддав газку и заставив его крутиться чуть бодрее. Педали мне показались излишне мягкими, но привыкнуть легко. С переключением передач сначала тоже не всё получилось. Ходы небольшие, но нечёткие, к такому переключению надо привыкнуть. Но на ходу машина хороша! Конечно, её динамика далека от динамики ракеты, но для фургона вполне достойно. Мотор оживает и даже немного провоцирует. Но мы скорость не превышаем (или хотя бы не признаёмся в этом публично) и не поддаёмся желанию «топнуть» ещё быстрее. Хотя машина это может. Конечно, обычный Ларгус с восьмиклапанным мотором заметно медленнее. Кстати, был опыт точно такого же тюнинга на шестнадцатиклапанном моторе. С него удалось снять 128 (против 105 стоковых) «лошадей» с лучшим поднятием крутящего момента и без неприятных явлений на холостых оборотах. Честно говоря, я не понимаю, зачем всё это Ларгусу, но признаю: едет он хорошо. На ходу появляется одно маленькое пожелание: вместо задней балки хотелось бы «многорычажку», но… Не много ли мы просим от фургона?


Из того, что сделано, отмечу очень неплохой свет ксенона. Владелец Ларгуса позаботился не только о себе, но и о других участниках движения, поэтому придал особое значение правильной регулировке и непосредственно выбору светотехники. До этого была попытка поставить диоды, но, хоть световой пучок и получался мощным, правильно его настроить не удалось, фокусировка оказалась очень посредственной.

Вместо заключения

Отвлечёмся теперь от нашей конкретно машины и замолвим пару слов о Ларгусе в общем. Машина получилась успешной, и высокий спрос на неё – тому подтверждение. Она хороша как семейный автомобиль и как коммерческий фургон. Конечно, Ларгус не безупречен, но своих денег он стоит. В планах у ОАО «АвтоВАЗ» ещё много интересных задумок, в том числе и по оснащению его отечественным мотором, которого, как удалось выяснить, ждут. Скорее всего, с нашим агрегатом машина получится шустрее, что привлечёт к ней новых потенциальных покупателей. Ну а как покажет себя новый мотор в процессе эксплуатации, мы узнаем со временем.


Читайте также:


LADA Largus — Википедия. Что такое LADA Largus


Материал из Википедии — свободной энциклопедии

Данные в этой статье приведены по состоянию на 2012 год.

Вы можете помочь, обновив информацию в статье.

LADA Largus

Общие данные

Годы пр-ва 2012 — настоящее время
Иные обозначения Dacia Logan MCV
Renault Logan MCV

K7M

Производитель:Renault
Марка:K7M
Тип:бензиновый
Объём:1598 см3
Максимальная мощность:60 кВт (82 л. с.), при 5500  об/мин
Максимальный крутящий момент:124 Н·м, при 3000 об/мин
Конфигурация:рядный, 4-цилиндр.
Цилиндров:4
Клапанов:8
Макс. скорость:156 км/ч
Разгон до 100 км/ч:14,5 с
Расход топлива при смешанном цикле:9,3 л/100 км
Расход топлива при городском цикле:12,3 л/100 км
Расход топлива на трассе:7,5 л/100 км
Экологические нормы:Евро 4
Диаметр цилиндра:79,5 мм
Ход поршня:80,5 мм
Степень сжатия:9,5
Система питания:распределённый впрыск топлива с электронным управлением
Рекомендованное топливо:АИ-95

ВАЗ-11189

Производитель:ВАЗ
Марка:ВАЗ-11189
Тип:бензиновый
Объём:1596 см3
Максимальная мощность:64 кВт (87 л. с.), при 5100  об/мин
Максимальный крутящий момент:140 Н·м, при 3800 об/мин
Конфигурация:рядный, 4-цилиндр.
Цилиндров:4
Клапанов:8
Макс. скорость:156 км/ч
Разгон до 100 км/ч:14,5 с
Расход топлива при смешанном цикле:8,2 л/100 км
Расход топлива при городском цикле:10,6 л/100 км
Расход топлива на трассе:6,7 л/100 км
Экологические нормы:Евро 5
Диаметр цилиндра:82 мм
Ход поршня:75,6 мм
Степень сжатия:10,3
Система питания:распределённый впрыск топлива с электронным управлением
Рекомендованное топливо:АИ-95

K4M

Производитель:Renault
Марка:K4M
Тип:бензиновый
Объём:1598 см3
Максимальная мощность:75 кВт (102 л. с.), при 5750  об/мин
Максимальный крутящий момент:148 Н·м, при 3750 об/мин
Конфигурация:рядный, 4-цилиндр.
Цилиндров:4
Клапанов:16
Макс. скорость:165 км/ч
Разгон до 100 км/ч:13,1 с
Расход топлива при смешанном цикле:7,9 л/100 км
Расход топлива при городском цикле:10,1 л/100 км
Расход топлива на трассе:6,7 л/100 км
Экологические нормы:Евро 4
Диаметр цилиндра:79,5 мм
Ход поршня:80,5 мм
Степень сжатия:9,8
Система питания:распределённый впрыск топлива с электронным управлением
Рекомендованное топливо:АИ-95

ВАЗ-21129

Производитель:ВАЗ
Марка:ВАЗ-21129
Тип:бензиновый
Объём:1596 см3
Максимальная мощность:78 кВт (106 л. с.), при 5800  об/мин
Максимальный крутящий момент:148 Н·м, при 4200 об/мин
Конфигурация:рядный, 4-цилиндр.
Цилиндров:4
Клапанов:16
Макс. скорость:165 км/ч
Разгон до 100 км/ч:14,0 с
Расход топлива при смешанном цикле:7,9 л/100 км
Расход топлива при городском цикле:10,4 л/100 км
Расход топлива на трассе:6,4 л/100 км
Экологические нормы:Евро 5
Система питания:распределённый впрыск топлива с электронным управлением
Рекомендованное топливо:АИ-95

Характеристики

Массово-габаритные

Клиренс 18 см(Снар.)15 см(полная нагрузка)
Колея задняя 1466 мм
Колея передняя 1469 мм
Масса 1260-1330 кг (снаряженная)

На рынке

Другое

Объём бака 50 л

LADA Largus (лат. largus) — автомобиль малого класса, представляющий собой адаптированный под российский рынок автомобиль Dacia Logan MCV первого поколения 2006 года, выпускаемый в Румынии[1]. Совместный проект Renault и «АвтоВАЗ» на платформе В0 переименована в global access platform.

Первый автомобиль LADA Largus сошёл с конвейера «АвтоВАЗ» 17 июня 2011 года. Причём первые собранные автомобили предназначались для заводских испытаний. Серийное производство Largus началось 4 апреля 2012 года на новой линии B0, первом совместном проекте «АвтоВАЗа» и альянса Renault-Nissan. Линия рассчитана на выпуск 70 тыс. LADA Largus, 70 тыс. Nissan Almera и 140 тыс. машин марки Renault, инвестиции в её создани

Lada Largus Фургон | CENTER-LADA

1.6 л. 5МКП (87 л.с) FWD

Standard

Передний привод

МКПП

87 л.с

345 099 р.

  • Безопасность
  • Подушка безопасности водителя
  • Иммобилайзер
  • Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
  • Защита двигателя и подкапотного пространства
  • Экстерьер
  • Лёгкая тонировка стекол
  • 15» стальные диски
  • Запасное полноразмерное стальное колесо 15»
  • Комфорт
  • Розетка 12V
  • Регулируемая по высоте рулевая колонка
  • Интерьер
  • Интерьер Carbon черный
  • Воздушный фильтр салона
  • Аудио
  • Аудиоподготовка

Classic

Передний привод

МКПП

87 л.с

403 099 р.

  • Безопасность
  • Подушка безопасности водителя
  • Иммобилайзер
  • Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
  • Защита двигателя и подкапотного пространства
  • Гидроусилитель рулевого управления
  • Центральный замок с дистанционным управлением
  • Электростеклоподъемники передних дверей
  • Экстерьер
  • Лёгкая тонировка стекол
  • 15» стальные диски
  • Запасное полноразмерное стальное колесо 15»
  • Молдинги боковых дверей
  • Комфорт
  • Розетка 12V
  • Регулируемая по высоте рулевая колонка
  • Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
  • Подогрев передних сидений
  • Кондиционер
  • Интерьер
  • Воздушный фильтр салона
  • Интерьер (по выбору) Carbon черный/Tropic серый
  • Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
  • Защитный ковер пола грузового отсека (полиэтилен высокой плотности)
  • Аудио
  • Аудиоподготовка

1.6 л. 5МКП (106 л.с) FWD

Comfort

Передний привод

МКПП

106 л.с

441 099 р.

  • Безопасность
  • Подушка безопасности водителя
  • Иммобилайзер
  • Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
  • Защита двигателя и подкапотного пространства
  • Гидроусилитель рулевого управления
  • Центральный замок с дистанционным управлением
  • Электростеклоподъемники передних дверей
  • Подушка безопасности переднего пассажира
  • Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
  • Экстерьер
  • Лёгкая тонировка стекол
  • 15» стальные диски
  • Запасное полноразмерное стальное колесо 15»
  • Молдинги боковых дверей
  • Противотуманные фары
  • Комфорт
  • Розетка 12V
  • Регулируемая по высоте рулевая колонка
  • Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
  • Подогрев передних сидений
  • Кондиционер
  • Аудиосистема (FM, MP3, AUX, USB, Bluetooth, Hands free), 2 динамика
  • Интерьер
  • Воздушный фильтр салона
  • Интерьер (по выбору) Carbon черный/Tropic серый
  • Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
  • Защитный ковер пола грузового отсека (полиэтилен высокой плотности)
  • Интерьер черный

Расход топлива Лада Ларгус на 100 км

Содержание статьи

Начиная с 2011 года совместное предприятие «АвтоВАЗ» и Renault, начали производить автомобиль Lada Largus. Авто имело несколько разновидностей кузова, среди них фургон, для перевозки грузов, пассажирский вариант и два вида универсала, на 5 и 7 посадочных мест соответственно. Расход топлива у различных модификаций Лада Ларгус может отличаться в зависимости от типа кузова или разновидностей установленного двигателя.

Лада Ларгус 1.6 и 84 л.с.

Самый маломощный мотор К7М имеет 84 лошадиные силы и объем топливного отсека в 1.6 л, его сборка осуществляется на мощностях расположенных в Румынии и автомобиль с таким двигателем способен развивать максимальную скорость в 155 км/ч. Данный 8-и клапанный силовой агрегат считается самым маломощным, и его базовая норма расхода составляет:

  • Городская черта – 12.3.
  • Смешанный цикл – 7.5.
  • Трасса – 7.2.

Если сравнивать потребление машины с мотором К7М, то наименьший расход топлива на 100 км имеет универсал, в среднем экономия бензина составляет около 500 гр. Данные по пассажирскому и грузовому варианту кузова практически идентичны.

Отзывы владельцев

  • Арсен, Киров. Приобрел Лада Ларгус для работы в такси, эта машинка оказалась весьма универсальной и совсем не прожорливой. В основном беру заказы по перевозке грузов, но даже когда работы по грузоперевозке не хватает, могу взять пассажиров и с учетом того что средний расход топлива по городу 11 литров, не уйду в минус.
  • Андрей, Кострома. У меня большая семья, поэтому я очень обрадовался появлению отечественного универсала на 7 посадочных мест, тем более что подвеска и рулевое у Lada Largus такая же как на Renault Logan, другими словами не убиваемые. Расход топлива на 84-х сильном Ларгусе тоже достаточно не высок, что позволяет экономить деньги семейного бюджета.
  • Вадим, Уссурийск. Приобрел подержанный автомобиль Лада Ларгус 2014 года выпуска, и на удивление нормы затрат топлива не слишком отличались от тех, которые были заявлены производителем несмотря на солидный пробег. Исходя из моих вычислений, могу сказать, что по городу эта рабочая лошадка редко потребляет больше 12 литров топлива, Замеры на трассе дали результат в 7.5-8 литров бензина, в зависимости от состояния дороги.
  • Василий, Нижневартовск. Забрал у друга по сходной цене Lada Largus на 8-и клапанном двигателе, так как знал, что за машиной хорошо ухаживали, и она не была в авариях. Что касается норм расхода горючего, то могу сказать для такой крупной машины, да еще собранной на нашем заводе, они вполне приемлемы. С учетом нашего жесткого климата при поездках на работу и с работы в городской черте я заливаю топлива из расчета 13 литров на сотку, и это при условии 20-и минутного прогрева 2 раза в день.

Лада Ларгус 1.6 и 90 л.с.

Авто комплектуется агрегатом ВАЗ-11189 отечественного производства, эта Лада Ларгус имеет схожие технические характеристики с 84-х сильным мотором. Данные по этой модели Ларгус расход будет несколько отличаться:

  • Городская черта – 12.4.
  • Смешанный цикл – 7.7.
  • Трасса – 7.0.

Как видно, в свободном движении не смотря на большее количество лошадиных сил, расход топлива Лада Ларгус на 100 км свободной трассы даже ниже чем у 84-х сильной версии.

Отзывы владельцев

  • Кирилл, Астрахань. У меня есть столярная мастерская, и я делаю кухонную мебель на заказ, поэтому мой выбор остановился на Lada Largus оборудованной под фургон, он не занимает много места в гараже и довольно вместительный, в разобранном виде вмещается практически любой предмет интерьера. Затраты на бензин приемлемые, конечно это не седан с мотором 1.6 литров, который кушает по 8 литров в городе, но для таких габаритов 12-13 л это не так уж и много.
  • Сергей, Армавир. Жаль, раньше не было отечественных аналогов с такой вместительностью как у Lada Largus. Я приобрел авто 2011 года, только сошедшее с конвеера, и ни о чем не жалею, детали всегда есть в наличии в любом магазине, хотя поломки случаются не часто, если своевременно делать обслуживание основных узлов. Жаль, что наши инженеры еще не научились делать более экономичные моторы, ведь как 8, так и 16 клапанов у Ларгус кушают около 13 литро, при движении по городу.
  • Евгений, Наро-Фоминск. Эта машинка станет отличным выбором для тех, кто любит с комфортом выезжать на природу, так как места для всего необходимого целый вагон. К тому же подвеска словно создана для бездорожья, а вот нормы расхода горючего у Лада Ларгус высоковаты. По пересеченной местности и частой езде на высоких оборотах затраты могут составить до 15 литров на сто км пути.
  • Григорий, Иваново. При выборе машины я опирался на удобство в обслуживании и цене расходных материалов, конечно в этом плане у отечественных автомобилей нет конкурентов, все просто установить и легко найти. Единственным неприятным моментом остается реальный расход у Lada Largus, после ста тысяч пробега он увеличился и стал бить по карману, в данный момент, что бы быть спокойным я заливаю бензина в расчете 14-15 л на сотню км дороги.

Лада Ларгус 1.6 и 105 л.с.

Авто с более мощными движками имеют под капотом 105 л.с. с 16-ю клапанами, это обеспечивает более уверенный набор скорости и небольшой запас мощности способный выручить в критических ситуациях. Мотор К4М производился на заводе Renault Espana, сейчас его изготовление наладили в концерне «АвтоВАЗ». Последние модернизации под стандарты EURO-5 привели к снижению мощности до 102 л.с., крутящий момент тоже уменьшился до 145 Нм. Расход топлива на Лада Ларгус с мотором К4М можно сравнить по данным завода производителя с другими силовыми агрегатами:

  • Городская черта – 11.8.
  • Смешанный цикл – 8.4.
  • Трасса – 6.7.

По этим данным можно судить о том что двигатель К4М получился более современным и его КПД выше чем на двух других моторах, которыми комплектуется Lada Largus, однако судить о реальных цифрах можно исходя из отзывов владельцев этой машины.

Отзывы о расходе Lada Largus 16. 105 л.с.

  • Владимир, Калининград. При покупке у меня стоял выбор между недорогой отечественной, но новой машиной или немецким аналогом с пробегом по Европе, но в последний момент остановился на Лада Ларгус и пусть норма расхода топлива и выше чем у европейского аналога, но в обслуживании она намного дешевле. Еще одним плюсом является качественная подвеска, ведь последние модели даже раскрученных брендов не всегда могут похвастаться надежностью этого важного узла. Если оценивать реальные затраты топлива, то данные примерно следующие: город 12-13 литров, трасса до 8 литров, по хорошей дороге.
  • Роман, Екатеринбург. Купил абсолютно новое авто Лада Ларгус Кросс 2018 года выпуска, и новым двигателем К4М. Очень доволен покупкой, даже в наборе скорости этот мул, не уступает многим седанам, что говорить о снижении показателей затрат топлива, которого удалось добиться переняв европейский опыт в изготовлении силовых агрегатов. Я езжу в основном по городу, и мой карман не так быстро пустеет, как я ожидал, для движения в плотном трафике я заправляю из расчета 12 л. на 100 км дороги.
  • Виктор, Новошахтинск. Отличная машинка, если есть представление, как можно использовать все ее плюсы. Благодаря вместительному багажному отделению можно разместить все мои рыбацкие снасти, ну а в просторный салон комфортно усаживаются мои упитанные друзья. Отдельно хочется сказать о подвеске, она весьма надежная, не слышал раньше, что бы она подводила. Особенно это отличие видно по сравнению с Грантой и Калиной 2. Что касаемо потребления горючего, то могу сказать, что расход бензина приемлемый, конечно на высоких оборотах кушает машинка много, но на трассе все меняется в лучшую сторону. По привычке я лью в бак бензина из расчета 10-11 литров на сотню километров.
  • Виталий, Ейск. Угораздило меня купить подержанный Lada Largus, сказать что я сильно намучался, это ничего не сказать. Прежний владелец изрядно ее потрепал, двигатель был полностью убитый, норма потребления топлива не укладывалась не в какие рамки, к тому же движок ел масло, выхлопные газы имели ярко выраженный черный окрас. При пересчете количество залитого бензина в рубли сумма выходила пугающая. На сотню километров по городу выстреливало более 15 литров, это как у старого мотора 24-ой Волги. Хотя надо было внимательнее смотреть при покупке, сам виноват.

Как снизить расход топлива

Потребление горючего на любой машине зависит от ряда субъективных и объективных факторов, начиная от загруженности маршрута движения, количества светофоров на пути и временем года, заканчивая стилем вождения. Вождение в агрессивном стиле приведет к повышению норм затраты бензина, и даже на новом автомобиле могут возникнуть перекосы относительно данных по паспорту Лада Ларгус.

Важно! Любое необоснованное увеличение оборотов это верный путь на пути к повышенному расходу бензина.

Главными факторами повышенного потребления можно считать:

  1. Низкое качество заливаемого бензина, на многих заправках увеличивают октановое число при помощи присадок, но машина от этого едет не сильно лучше, а вот выхлоп газов увеличивается, что приводит к высоким показателям затрат.
  2. Все электрооборудование, включенное во время движения, берет на себя часть вырабатываемой энергии, что тоже может стать фактором увеличения расхода бензина у машины любой марки автомобиля.
  3. В зимнее время года много горючего тратится на прогревание холодного двигателя, что естественно увеличивает трату бензина.
  4. Выработанные детали двигателя, это один из основных факторов повышенного расхода топлива, что бы избежать такой ситуации надо следить за состоянием авто и обращать внимание на цвет выхлопных газов (при изношенных клапанах в топливо попадает масло и выхлопные газы становятся черного цвета и приобретают характерный запах).

Основным советом можно считать своевременное выявление проблем, а для этого следует внимательно наблюдать за изменениями в ТТХ авто. Для устранения одной из частых причин повышенного расхода бензина у Лада Ларгус можно просто заменить или почистить топливный фильтр.

Микроскопия с флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET) — вводные понятия

вводные понятия

Точное расположение и характер взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследования часто затруднены. ограниченное разрешение инструментов, используемых для исследования этих явлений. Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченые молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определяемого критерием Рэлея, примерно 200 нанометров (0.2 мкм). Однако для понимания физических взаимодействий между белками-партнерами, участвующими в типичном биомолекулярном процессе, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с дифракционным ограничением. Метод резонансной передачи энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) в применении к оптической микроскопии позволяет определять сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. Рисунок 1), расстояние, достаточно близкое для происходить молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на большей длине волны. Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах.Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. При использовании этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, по-видимому, совпадают, и эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.Флуоресцентный резонансный перенос энергии — это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора возбужденного состояния ко второму хромофору в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен приблизительно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает в себя флуорофор донора в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему хромофору акцептора без излучения за счет дальнодействующих диполь-дипольных взаимодействий. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться энергообмену со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту.В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся с одинаковой частотой. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансная передача энергии нечувствительна к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление резонансной передачи энергии флуоресценции не опосредуется испусканием фотонов, и, кроме того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии акцепторной флуоресценции. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора.Следовательно, измерения FRET могут использоваться как эффективная молекулярная линейка для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, прикрепленными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рисунке 1. В нативной конформации (рисунок 1 (a)) два флуорофоров разделены расстоянием приблизительно 12 нанометров — это слишком далеко для передачи энергии внутримолекулярного резонанса между флуорохромами.Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (Рисунок 1 (b)), два флуорохрома сближаются гораздо ближе и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET. На рисунке возбуждение донорного флуорохрома показано синим свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая акцепторная эмиссия (Рисунок 1 (b)) представлена ​​зеленым свечением, окружающим второй гетероциклический флуорохром справа. -ручная сторона белка.Измерения передачи энергии часто используются для оценки расстояний между сайтами макромолекулы и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В этом типе экспериментов степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя резонансный перенос энергии флуоресценции часто использовался для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций белков и липидов, основным препятствием для реализации методов FRET-микроскопии в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белков с помощью соответствующие флуорофоры.Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в самых разных типах клеток стали критическим ключом к разработке маркеров как для экспрессии генов, так и для структурной локализации белка в живых клетках. Было разработано несколько вариантов мутаций этого белка, различающихся по спектру, включая флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Спектры возбуждения и излучения для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длинам волн, чтобы быть совместимыми с подходом FRET.Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и мутантных флуоресцентных белков. Если два белка, один из которых помечен BFP (донор), а другой — GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса при максимальной длине волны поглощения будет наблюдаться повышенная интенсивность на максимуме эмиссии акцептора (510 нанометров). (380 нм) донора. Неспособность белков образовать комплекс не приводит к эмиссии акцепторной флуоресценции (GFP).

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, оптики микроскопов и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках. В дополнение к исследованию взаимодействий белковых партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может иметь место, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения соседнему хромофору, акцептору. В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора, и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь.Теория, предложенная Теодором Фёрстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Фёрстер также разработал формальное уравнение, определяющее связь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансная передача энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновения и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается повышенное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3).Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый на длинах волн с центром вблизи максимума излучения акцептора. Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между испусканием донора и поглощением акцептора при резонансном переносе энергии флуоресценции.Абсорбционные и эмиссионные переходы изображены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация — волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы изображены пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3).Получающееся в результате сенсибилизированное флуоресцентное излучение имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, необходимо выполнить несколько критериев. В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения донорных и акцепторных молекул, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Фёрстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между донорными и акцепторными молекулами уменьшается в шестой степени от расстояния, разделяющего их.Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор примерно 10 нанометров. На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий.В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансного переноса энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти. Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) переноса энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.Согласно теории Фёрстера, подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

K T = (1 / τ D ) • [R 0 / r] 6

, где R (0) — критическое расстояние по Фёрстеру, , τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры. Критическое расстояние Фёрстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора.Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору за счет резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается за счет комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Фёрстера — это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии.Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц. Значение R (0) (в нанометрах) может быть вычислено из следующего выражения:

R 0 = 2.11 × 10 -2 • [ κ 2 • J (λ) • η -4 • Q D ] 1/6

, в котором κ — в квадрате — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между диполями перехода донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области спектров излучения донора и акцепторного поглощения (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет собой показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R 0 • [(1 / E T ) — 1] 1/6

и E (T) оценивается как:

E T = 1 — (τ DA / τ D )

где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептор.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих широко применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рис. 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве флуоресцентного резонанса. пара передачи энергии. Спектры поглощения обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры эмиссии представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. В результате получается высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, Дж (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлены серии экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Фёрстера для
обычных пар донор-акцептор RET
2.1 219
Донор Акцептор Расстояние Фёрстера
(нанометры)
IAEDANS (1) DDPM (2) 2,5 — 2,9
BFP 3,3219
65
BFP 3,3219
6149 Дансил
FITC 3,3 — 4,1
Дансил Октадецилродамин P 4,3 9166
9166

7 — 4,9

CF (3) Техас красный 5,1
Флуоресцеин Тетраметилродамин Тетраметилродамин

5

Cy5 > 5,0
GFP YFP 5,5 — 5,7
FLY000 (419)
(419) 5.7
Родамин 6G Малахитовый зеленый 6,1
FITC Eosin Thiosemicarbazide

Eosin Thiosemicarbazide Cy5 7.2
Cy5 Cy5.5 > 8.0
1 иодафацетилен 5-0005-0005- -сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s- indacene
Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства, Поскольку теория Ферстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная по-прежнему вызывает споры.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора путем вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может варьироваться от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за отношения корня шестой степени к расстоянию Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит к изменению рассчитанного расстояния только на 26 процентов, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение о том, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для вариации κ в квадрате. Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность в коэффициенте ориентации. Ограничение возможных значений κ в квадрате таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, если вообще возможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансной передачи энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием резонансной спектроскопии переноса энергии и рентгеновской дифракции в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предлагается теорией Фёрстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Больше неопределенности существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связи, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной флуоресцентной поляризации донора и акцептора, а это условие маловероятно.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близкими расстояниями донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ в квадрате) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) задается уравнением:

κ 2 = (cos θ T — 3cos θ D cos θ A ) 2

= (sin θ D sin θ A cos Φ — 2cos θ D cos θ A ) 2

где θ (T) — угол между диполем эмиссионного перехода донора и диполем абсорбционного перехода акцептора, θ (D) и θ (A ) — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донором и акцептором приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояние донор-акцептор близко к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей. Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни распада флуорофора.Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии с помощью механизма Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результирующему эффекту. Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансная передача энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости.Сложность в теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора. Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрических форм и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (-ов) визуализации, но практически любой прямой или инвертированный микроскоп можно дооснастить для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оснащен охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), связанной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимумом сквозного спектрального шума. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или устранить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, что снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, близкими к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар флуорофора донора и акцептора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникнут в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способная наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогеновой лампой на столбе для исследования и записи. ячейки, использующие стандартное светлое поле, фазово-контрастное или дифференциально-интерференционное ( DIC ) освещение.Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста могут использоваться в сочетании с флуоресценцией для выявления пространственного расположения флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа прикреплена стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье для получения широкоугольной флуоресценции и получения изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с помощью мультиспектрального микроскопа, показанного на рисунке 7, с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и аксиальной ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.С проиллюстрированной конфигурацией микроскопа совместимы различные программы обработки изображений.

Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

  • Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
  • Фотообесцвечивание необходимо исключить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
  • Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
  • Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
  • Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
  • Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
  • Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.
  • Донор должен иметь низкую поляризационную анизотропию, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации ( κ -квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, излучение которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
  • При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результатов измерений резонансной передачи энергии.
  • Поскольку резонансный перенос энергии флуоресценции требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или амино-конец) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что донорные и акцепторные молекулы расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
  • Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставило значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образцов, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора может рассматриваться как показатель резонансного переноса энергии, обычно используется отношение двух значений: I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объёме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между молекулярными парами, вызывает изменение соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскопе путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и детектирования повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным гашением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется установившимся режимом флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия эмиссии между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит эмиссия акцептора. На практике может быть сложно определить пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны в пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепи событий, могут быть помечены слиянием с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное снижение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение эмиссии донора (рисунок 8 (a)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль эмиссии акцептора (рисунок 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад из донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, несколько очень специфичны к оптическому микроскопу.Основная цель микроскопических исследований — получить изображения с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может повлиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные доказательства, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии сокращает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и, следовательно, наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны и влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях метод фотообесцвечивания доноров менее сложен, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения эмиссии донора измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимума спектральной информации, использует комбинацию трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, а полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух существенных проблем, которые необходимо преодолеть для достижения количественных результатов в экспериментах по флуоресцентному резонансному переносу энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра эмиссии акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал эмиссии донора (нежелательные длины волн) проходит через фильтр эмиссии.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая испускания донора (зеленый) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентраций донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением, которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Этот метод позволяет количественно определять расстояние разделения донора и акцептора и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение затухания интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение для среднего времени жизни, при регистрации как интенсивность в установившемся состоянии, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривой затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) задается уравнением:

I (t) = I 0 exp ( -t / τ)

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; Рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Это происходит отчасти потому, что время жизни флуоресценции не зависит от местной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресцентных ламп, классифицируются как во временной области ( в импульсном режиме , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 ( б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции получается путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную от импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется из фазового сдвига и глубины демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной области для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, а профиль экспоненциального затухания измеряется как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы обнаружения с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны к выполнению, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего света может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований с помощью измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от методики измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями флуоресцентного резонансного переноса энергии являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки с помощью множества биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве флуорофора внутреннего донора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, и расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни донора в возбужденном состоянии, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии посредством измерений в установившемся режиме. как обсуждалось выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явления, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Несколько биологических приложений, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Хотя для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Тем не менее, несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на более низких расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Центр медицинских наук Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Джозеф Р. Лакович — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers и Michael W.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильного магнитного поля, 1800 г. Ист. Пол Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Стадии родов и чего ожидать

В большинстве случаев шейка матки небольшая, плотно прилегающая. закрытая дыра. Он предотвращает попадание чего-либо в матку и выход из нее, что помогает защитить ребенка.

Во время родов интенсивные сокращения матки помогают ребенку опускаться и в конечном итоге из таза во влагалище.Эти сокращения оказывают давление на шейку матки и заставляют ее медленно расширяться. По мере развития схваток схватки становятся сильнее, ближе друг к другу и становятся более регулярными.


Большинство медицинских справочников делят роды на три этапа:

  • Первый этап : ранние, активные и переходные. Начинаются схватки, шейка матки расширяется, и ребенок опускается в таз. Первый этап считается завершенным, когда шейка матки расширилась до 10 сантиметров (см).
  • Вторая стадия: Тело начинает выталкивать ребенка.На этом этапе женщины часто испытывают сильное желание толкаться. Этот этап заканчивается рождением малыша.
  • Третья стадия: Сокращения выталкивают плаценту. Этот этап заканчивается выходом плаценты, обычно в течение нескольких минут после рождения ребенка.

Однако многим роженицам может казаться, что они переживают гораздо больше стадий, чем это.

Первый этап: ранние роды

На ранних стадиях родов шейка матки расширяется до следующих размеров:

  • 1 см, примерно размером с черио
  • 2 см, размером от маленького до среднего виноград
  • 3 см, размер четверти

На поздних сроках беременности шейка матки могла уже расшириться на несколько сантиметров до того, как у женщины возникнут какие-либо симптомы родов.

Некоторые женщины, особенно рожающие впервые, не могут определить, начались ли роды. Это связано с тем, что схватки при ранних родах часто бывают мягкими и нерегулярными, постепенно усиливаясь по мере того, как роды прогрессируют и шейка матки расширяется.

Это увеличение интенсивности может занять всего несколько часов или несколько дней. Знание того, действительно ли это труд, может помочь людям подготовиться.

Во время настоящих родов схватки человека:

  • происходят не только с одной стороны тела
  • начинаются в верхней части матки, и кажется, что они давят вниз
  • становятся более интенсивными и регулярными со временем
  • не останавливайтесь, отдыхая или принимая теплый душ

Некоторым женщинам на этом этапе может быть полезно отдохнуть или перекусить, чтобы у них было достаточно энергии для предстоящих более утомительных этапов.

Первый этап: активные роды

Во время активного периода родов шейка матки расширяется до следующих размеров:

  • 4 см, размер небольшого печенья, такого как Oreo
  • 5 см, размер мандарин
  • 6 см, размером с авокадо или верхушкой баночки с газировкой
  • 7 см, размером с помидор

Во время активных родов схватки становятся более интенсивными и регулярными. Многие женщины считают, что основной характеристикой активных родов является то, что схватки являются скорее болезненными, чем дискомфортными.

На этом этапе родов некоторые женщины могут выбрать лекарство, например, эпидуральную анестезию, чтобы справиться с болью. Другие предпочитают справляться с болью естественным путем. Смена позы, движения и сохранение гидратации могут помочь с болью при активных родах.

Первая стадия: переходная фаза

Во время переходной фазы родов шейка матки расширяется до следующих размеров:

  • 8 см, размер яблока
  • 9 см, размер пончика
  • 10 см, размером с большой бублик

Для многих женщин переходный период — самый сложный этап.Однако он также самый короткий. Некоторые люди начинают чувствовать побуждение к толчкам во время переходной стадии. Также часто бывает чувство подавленности, безнадежности или неспособности справиться с болью. Некоторых женщин рвет.

Некоторые женщины считают, что стратегии выживания, которые хорошо сработали на ранних стадиях родов, больше не работают. Переход обычно бывает коротким и является признаком того, что ребенок скоро родится. Могут помочь движения, смена положения и упражнения на визуализацию.

Шейка матки продолжает расширяться во время перехода, и переход заканчивается, когда шейка матки полностью раскрывается.

Вторая стадия: полное раскрытие и толкание

Когда шейка матки достигает 10 см, пора выталкивать ребенка. Схватки продолжаются, но также вызывают сильное желание толкнуть. Это побуждение может быть похоже на сильную потребность в дефекации.

Этот этап может длиться от нескольких минут до нескольких часов. У тех, кто рожает впервые, он часто бывает дольше.

Исторически врачи говорили женщинам, что они должны двигаться по расписанию, считать до 10 и оставаться на спине.Сегодня советуют совсем другие, и исследования показывают, что для женщин безопасно толкаться в соответствии с сигналами своего тела и до тех пор, пока они чувствуют себя комфортно.

Толчки из положения стоя или на корточках также могут помочь ускорить процесс. Разрешение людям перемещаться с разных позиций дает медицинскому персоналу лучший доступ к женщине и ребенку, если им по какой-либо причине потребуется помощь при родах.

Во время родов женщина может чувствовать сильное жжение и растяжение, поскольку ее влагалище и промежность растягиваются, чтобы приспособиться к ребенку.Это ощущение обычно длится всего несколько минут, хотя у некоторых женщин во время этого процесса появляются слезы.

Третья стадия: после родов

Через несколько минут после родов у женщины могут наблюдаться более слабые схватки. Через пару схваток тело должно изгнать плаценту.

Если организм не полностью изгоняет плаценту, врач или акушерка могут помочь родить ее. Иногда женщине делают инъекцию синтетического окситоцина, чтобы ускорить роды и предотвратить чрезмерное кровотечение.

Вскоре после родов шейка матки начинает сокращаться до прежних размеров. Этот процесс может занять от нескольких дней до нескольких недель.

По мере того, как матка и шейка матки сжимаются, многие женщины ощущают сокращения. У большинства женщин кровотечение идет в течение нескольких недель после родов.

Измерения интенсивности флуоресценции | BMG LABTECH

Характеристика возбуждающего (поглощающего) света, имеющего более низкую длину волны, чем испускаемый свет, открывает возможность использования интенсивности флуоресценции в аналитических целях.Флуорофоры можно обнаружить, возбуждая их на определенной длине волны и измеряя интенсивность их излучения на более высокой длине волны. Интенсивность флуоресценции линейно коррелирует с концентрацией возбужденного флуорофора и, следовательно, подходит для количественного анализа.


Интенсивность флуоресценции широко используется в биологических науках: в микроскопии для локализации и количественного определения биомолекул, в проточной цитометрии для анализа клеток и в анализах на микропланшетах для количественной оценки молекул, ферментативной активности и даже взаимодействия между молекулами.На этой странице рассказывается об использовании интенсивности флуоресценции в анализах на микропланшетах, о том, как она определяется, что следует учитывать при измерениях интенсивности флуоресценции и какие анализы обычно используются.

Флуорофоры

Флуорофор (также флуорохром) — это флуоресцентное соединение, которое может излучать свет при возбуждении светом. Известны тысячи молекул, обладающих флуоресцентными характеристиками. 2 Они различаются:

Многие флуорофоры представляют собой химические соединения с небольшими молекулярными размерами, которые могут быть легко связаны с другими молекулами.Флуоресцентные белки, такие как зеленые или красные флуоресцентные белки (GFP или RFP), больше по размеру и могут экспрессироваться клетками. Они используются для маркировки белков для исследований экспрессии, для эндогенно экспрессируемых биосенсоров или просто в качестве маркеров количественной оценки клеток.

  • Длины волн возбуждения и излучения

Характеристики возбуждения и излучения флуорофора отображаются в виде спектров: в системе координат нанометры показаны на оси x, а интенсивность — на оси y.Кривые нормированы на 100% и позволяют быстро определить максимальные длины волн возбуждения и излучения, а также стоксов сдвиг. Эта информация важна для выбора правильного флуорофора для анализа. Он должен быть совместим с системой обнаружения, потенциальной автофлуоресценцией и другими флуорофорами, если в эксперименте используется несколько.

Квантовый выход — это мера того, насколько эффективно возбужденная молекула преобразует поглощенные фотоны в испускаемый свет.В сочетании со степенью поглощения света (коэффициентом экстинкции) квантовый выход дает представление о яркости флуорофора.

  • FRET пары состоят из двух флуорофоров

FRET (резонансный перенос энергии Фёрстера) описывает передачу энергии от донорного флуорофора к акцепторному флуорофору. Передача происходит, когда акцептор возбуждается излучением света, исходящим от донора, и происходит только в том случае, если оба флуорофора находятся поблизости.FRET часто используется для исследований молекулярного связывания или в биосенсорах. Последние меняют свою конформацию, когда аналит связывается и сводит два флуорофоров вместе. Для того, чтобы FRET имел место, пара флуорофоров должна иметь перекрытие между спектром излучения донора и спектром возбуждения акцептора. 3

Labor Hoarding финансовое определение Labor Hoarding

* Джулия Джуппони и Камилла Ландис, Лондонская школа экономики, «Субсидирование накопления рабочей силы в период рецессии: влияние краткосрочной работы на занятость и благосостояние» (2014 г.), «Генеалогия концепции накопления рабочей силы», Центр истории политической жизни. Рабочий доклад по экономике, Университет штата Мичиган, США.Ярким примером потенциальной роли трений на рынке труда является традиционная теория накопления трудовых ресурсов. Менее ценится феномен роста доли трудовых доходов задолго до пика экономической активности и по причинам, не связанным с накоплением рабочей силы. В ретроспективе Биддл (2014) прослеживает интеллектуальную мысль о циклическом поведении производительности до ее ранних основ и объясняет, как накопление рабочей силы стало ведущим объяснением. Восемь эссе международных авторов исследуют такие темы, как формирование общественного экономического дискурса в послевоенной Америке институционализм после 1945 г., генеалогия концепции накопления трудовых ресурсов и что рассказывать аспирантам по макроэкономике о Кейнсе.Мы называем это «накоплением труда». Это, как я полагаю, происходило в 2007-2008 годах: «Вы платите им только тогда, когда они вам нужны». Это знаменует собой отход от того, что экономисты называли «накоплением рабочей силы»: компании обычно сохраняли большую часть своих сотрудников во время рецессии, надеясь пережить спад. Они связывают это с тем, что называется «накоплением рабочей силы». Накопление рабочей силы относится к тенденции к менее интенсивно использовать работников во время спада, чем во время бума. Это отражает стремление фирм сгладить занятость и количество оплачиваемых часов на одного работника, несмотря на колебания объема производства, чтобы избежать затрат на корректировку рабочей силы.Например, то, что кажется снижением производительности во время рецессии, может вместо этого объясняться снижением степени использования определенных ресурсов (например, накопления рабочей силы или избыточных мощностей). Этот прогноз также появляется в моделях, которые допускают накопление рабочей силы. и переменные коэффициенты использования капитала (Burnside, Eichenbaum, and Rebelo, 1993 и Burnside, Eichenbaum, 1996).

Загрузки бесплатно для Windows

Rufus

Создавайте загрузочные USB-накопители из ISO с любой операционной системой по вашему выбору, с различными опциями, в том числе для улучшения совместимости со старыми версиями BIOS

TeamViewer

Удаленно управляйте любым ПК по всему миру, проводите демонстрации, легко передавайте файлы, проводите встречи и презентации с несколькими пользователями

CyberLink PowerDirector

Редактируйте видео, используя три различных режима, специальные эффекты, переходы и создавайте диски, используя встроенные параметры записи, которые предоставляет это приложение

SUMo

Поддерживайте все установленные программные приложения в актуальном состоянии с помощью этого простого приложения, которое автоматически сканирует компьютер и обнаруживает доступные обновления

Wise Folder Hider

Легко скрывайте важные или личные файлы, папки или даже весь USB-накопитель всего несколькими щелчками мыши, сохраняя их в безопасности с помощью пароля

Driver Booster PRO

Обновите все драйверы и игру Это интуитивно понятное приложение обеспечит бесперебойную работу вашего компьютера и отсутствие проблем с ним.

Rufus

Создание загрузочных USB-накопителей из ISO с любой операционной системой по вашему выбору, с различными опциями, в том числе для повышения совместимости со старыми версиями BIOS

TeamViewer

Удаленно управляйте любым ПК по всему миру, проводите демонстрации, легко передавайте файлы, проводите встречи и презентации с несколькими пользователями

CyberLink PowerDirector

Редактируйте видео с помощью трех различных режимов, спецэффектов, переходов и создавайте диски с помощью встроенной функции записи параметры, которые предоставляет это приложение

SUMo

Поддерживайте все установленные программные приложения в актуальном состоянии с помощью этого простого приложения, которое автоматически сканирует компьютер и обнаруживает доступные обновления

Wise Folder Hider

Легко скрывайте важные или личные файлы, папки или даже весь USB-накопитель всего несколькими щелчками мыши, сохраняя они в безопасности с паролем

Driver Booster PRO

Обновите все ваши драйверы и игровые компоненты, чтобы обеспечить бесперебойную работу вашего компьютера и отсутствие проблем с этим интуитивно понятным приложением

Rufus

Создавайте загрузочные USB-накопители из ISO-образов с помощью операционной системы. система по вашему выбору, с различными опциями, в том числе для повышения совместимости со старыми версиями BIOS

TeamViewer

Удаленное управление любым ПК по всему миру, проведение демонстраций, простая передача файлов, организация встреч и презентаций с несколькими пользователями

CyberLink PowerDirector

Редактирование видео использование трех различных режимов, специальных эффектов, переходов и создание дисков с помощью встроенных параметров записи, которые предоставляет это приложение

SUMo

Поддерживайте все установленные программные приложения в актуальном состоянии с помощью этого простого приложения, которое автоматически сканирует компьютер и обнаруживает доступные обновления

Wise Folder Hider

Easi Скройте важные или личные файлы, папки или даже весь USB-накопитель всего несколькими щелчками мыши, сохраняя их в безопасности с помощью пароля

Driver Booster PRO

Обновите все ваши драйверы и игровые компоненты, чтобы ваш компьютер работал бесперебойно и стабильно без проблем, с этим интуитивно понятным приложением

О нас | Интенсивность данных

Вход для клиентов
  • Решения
    • Наши решения
    • Управление данными и базами данных
    • Управление корпоративными приложениями
    • Решения для управления разрастанием облака
    • Лицензионные решения Oracle
    • Инженерные системы
    • Методология миграции Safe-Switch
      • Оценка трансформации Oracle TCO
      • Oracle Workloads в Azure
      • Oracle Workloads в OCI
      • Мастерская Oracle Discovery
  • Сервисы
    • Наши услуги
    • Профессиональные услуги
      • Услуги по оценке
      • Услуги дизайна
      • Услуги по внедрению
      • Миграционные услуги
      • Службы интеграции
      • Услуги по обновлению
    • Управляемые службы
      • Модели поддержки Opti-Shore
      • Модели услуг и услуги управления
      • Приложения, базы данных и промежуточное программное обеспечение
        • Функциональные услуги
      • Облачные и инфраструктурные услуги
  • Технологии
    • Наши технологии
    • Приложения
.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *