2103 lada: Классической ВАЗ-2103 исполняется 45 лет — Корпоративная информация — Новости

Содержание

Отзывы владельцев Lada (ВАЗ) 2103 (Лада 2103) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки

Отзывы владельцев Lada (ВАЗ) 2103 (Лада 2103) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки — Авто Mail.ru —

Коробка передач

Объем двигателя, л

—ВАЗ 2103 1974 года, достался от родного дедушки с пробегом 27000 км! отъездил почти 10 лет при продаже пробег был под 150 т.км родная краска, даже запаска была родная))) Машина ремонтировалась по…

82 комментария

Удивительная, компактная, удобная в обращении машина. Проста в управлении. При сравнении с новыми моделями машин выглядит немного аскетично. Неоднократно совершенные длительные поездки на дальние…

2

Тройка для своего времени (70 — е ) достаточно приемлемый авто как по комфорту, динамике , а особенно по надежности. Внешний вид автомобиля. на мой взгляд самый приятный и заметный на дороге . Эта…

71 комментарий

Надёжный бюджетный вариант.

1

Шесть лет подряд ходил из Челябинска на Тамань, 3,5 тыс. км в один конец. Без поломок…По 700-800 км в сутки… Прост в управлении… Доступен для ремонта самостоятельно… У меня в пользовании от…

64 комментария

Лучшая из семейства ВАЗ, машина о которой я при советском союзе не мог и мечтать я тридцать лет ездил на "горбатом" запорожце и с достоинством могу оценить ее надежность. Это одна из первых…Достался мне от отца по наследству, в ней прошло мое детство и юность, поэтому для меня это самый любимый автомобиль из всех существующих! Мягкая подвеска, приборка, где находится все самое…

4

ВАЗ=2103 мощный,красивый ,надежный.За тридцать шесть лет эксплуатации он меня ни где ни когда не подвел,так же к нему относился и я.Дружба хороша своей взаимностью.Плохо только,что всему приходит…

3

Машина никогда не подводила, правда, иногда имела привычку глохнуть на холостом ходу после долгой езды (после 150-200 км), детали менял по мере износа. Серьёзных поломок никогда не было . C 1975 года…

1

Не было проблем ВООБЩЕ ,примерно,до2000 г,пока не пришлось менять на запчасти нынешнего производства Двигатель до сих пор без ремонта,давление,на прогретом и на оборотах 900-1,5 Коробка заводская,мост.
..На тот период автомобиль прекрасный!! Никогда не подводил в дороге. Приспособлен ко всем климатическим условиям. Экономичный двигатель. При 4-х ступенчатой КПП можно было развить скорость до 145 км/ч…Хорошая машина, только вот староватая и жрёт много! а в общем можно ездить, и по дизайну мне больше нравится чем копейка, за 500 $ и ездит на 4мкп 105км ) Вот оставил и фотку) музыка через модулятор…На своей когда качу я трёхе- Берегитесь чайники и лохи! Ей недавно было 30 лет- Тормозов, подвески-просто нет! Ржавая, плохое рулевое… Состоянье, скажем, боевое! Езжу каждый раз на грани фола…

1

Мой ВАЗ 2103 аж 81 года выпуска! После непродолжительных эксплуатаций автомобилей (по убывающей в категории цены) — с "десятки" и до "семерки" (не имея особого опыта и стажа…

2

Машина -зверь но с характером . Зато иномарки об нее разлетаются на части а ей ничего —- умели делать не то что сейчас. Нравится дурь в экстремальных условиях — вылезет с любой грязи и не моргнет а. ..Добрый вечер Уважаемые. У меня О3 просто Жигули Выпуск 1977 года, досталась мне еще от отца ( царство ему небесное ) Вот и поэтому я не могу ее "выбросить" Она дорога мне как память об отце…У меня в семье моя уже третья тройка будет=) причом все отличные.Имхо, это лучшая машина ,если за ней следить…Я купил свою недавно за 300баков в убитом состоянии… чуток вложил и пришлось конечно…моя первая машинка! машина зверь! не прихотливая! не гнилая краска родная не гниет зараза! было дело летом перегревал двигатель раз 20 или даже полее ломался термостат постояно, так у меня омпресия и…Рабочая лошадка. Не представляет ни какого интереса для угонщиков и прочих скотов. Наблюдал свою машину у друга с пробега 12000км. особых хлопот не доставляет. Правда пришлось переделать электрику…Машина замечательная, а как она махала крыльями просто песня. Для того времени когда ее выпустили прогресс. В 91 году капиталка в ГДР . Машину списали в 1996 году.
Итого 22 года…Помогите людям с выбором — расскажите о своем опыте использования автомобиля.

Написать отзыв

<div data-module=»SlotModel» data-view=»SlotView.345798″ data-id=»345798″ data-qa=»LazyBody.block.cpfModules»></div>

Лада 2103 — Автомобили — Автокадабра

ОАО «АвтоВАЗ» — крупнейший производитель легковых автомобилей в России и Восточной Европе. Его доля в валовом внутреннем продукте нашей страны составляет около 1%.

«АвтоВАЗ» является градообразующим предприятием для почти миллионного Тольятти. Именно поэтому в состав акционерного общества входят подразделения, обеспечивающие питание, транспортные услуги, медицинское обслуживание, отдых, а также оказывающие помощь в воспитании детей.

Строительство завода началось в 1967. Первая очередь, рассчитанная на выпуск 220 тыс. автомашин в год, вступила в строй в 1971.

За основу при выпуске малолитражного автомобиля с пятиместным кузовом ВАЗ-2101 «Жигули» был взят итальянский FIAT-124.

«Копейка» задумывалась, как народный автомобиль, который при сравнительно невысокой цене мог бы насытить огромный советский рынок. Однако сразу же пришлось отказаться от мысли о доступности автомобиля для рядового человека: с каждой новой моделью цена на «Жигули» значительно росла.

Тем не менее процесс усовершенствования «Жигулей», а затем в 80-е годы экспортного варианта «Лада» никогда не останавливался. За советский период существования был освоен выпуск девяти моделей, среди которых самыми популярными стали, кроме первой, шестая и с ведущими передними колесами девятая модели.

Когда в 1976 году на заводе в Тольятти освоили производство модели ВАЗ-2106, которая была переработана для отечественных условий эксплуатации из RAT 124 Speciale образца 1972 года, никто не мог и предположить, что именно она станет самой популярной и массовой продукцией Волжского автозавода.

Вездеход «Нива» (ВАЗ 2121/2123/21213/2131) произвел сенсацию на мировом рынке в конце 1970-х  — начале 1980-х годов.

Тогда этот автомобиль испытывал трудности со сбытом на отечественном рынке. В 1980 автомобилю «ВАЗ-2121» присуждена золотая медаль 53-й Международной ярмарки в Познани.

Представшая публике в конце 1984 года клиновидная «Самара» с трехдверным кузовом хэтчбек стала воистину эпохальным событием не только для Волжского автозавода, но и для отечественных автолюбителей. Модель ВАЗ-2108 Спутник/Lada Samara положила начало массовому выпуску в стране переднеприводных легковых автомобилей.

В 1987 коллектив Волжского автомобильного завода удостоен приза «Золотой Меркурий» за большой вклад в развитие производства и международного сотрудничества. Эта престижная награда была присуждена ВАЗу в третий раз.

1989 Внешнеторговому объединению «АвтоЛАДА» присужден международный приз совета торговых руководителей «Trade Leaders Club» за выход на ведущие позиции в торговле и вклад в развитие национальной экономики африканских стран.

После распада Советского Союза АвтоВАЗ, как и все остальные отечественные промышленные гиганты, вступил в полосу полной перестройки своей деятельности. Кризис оказался затяжным, но к середине 90-х годов АвтоВАЗ сумел переломить ситуацию и постепенно стал наращивать производство.

Микролитражная ВАЗ-11113 «Ока» более десятилетия остается самым дешевым отечественным легковым автомобилем. В свое время ее даже прочили на роль -народного автомобиля и определяли местом ее производства гигантский промышленный комплекс в Елабуге, намереваясь покончить с многолетним автомобильный дефицитом. Но эти проекты так и ocтались неисполнимыми, а столь досаждавшая АвтоBA3y сборка «Оки» была в середине 1990-х окончательно передана на заводы СеАЗ (который вошел в состав АвтоВАЗа) и КамАЗ.

За период 1970 — 2002 годов предприятием выпущено более 21 млн. автомобилей, а существующий на сей день производственный потенциал автомобильного комплекса позволяет выпускать свыше 700 000 автомобилей в год.

ВАЗ-2103

Серийный выпуск «Жигулей» третьей модели начался в 1972 году, за основу автомобиля по аналогии с предшественником ВАЗ-2101 стал итальянский сдан Fiat-124. Причем при подписании договора с итальянцами, было оговорено, что Fiat предоставит кроме техпроекта полную документацию на две комплектации автомобиля — норма и люкс. Фиат в свою очередь предоставил готовые решения — для «нормы» это был Fiat-124 (на основе которой был построен ВАЗ-2101), а для «люкса» Fiat-125. Однако в связи с заморочками в производстве, выбор СССР пал на первый вариант итальянского автомобиля с улучшенным оформлением (Fiat 124 Special), причем не в готовом виде, а на основе его наработок.

Над двумя проектами – «Копейка» на основе базового Fiat 124 и «Тройка» на основе итальянца с улучшенным оформлением Fiat 124 Specialработали специалисты Волжского автозавода можно сказать одновременно. И если ВАЗ-2101 хоть и был измененной копией итальянца, то с ВАЗ-2103 все было иначе, даже не смотря на то, что его прообраз был запущен в серию на 4 года раньше. А тот факт, что автомобили были похожи внешне так это потому, что они строились под взаимным влиянием. В итоге оба автомобиля Fiat 124 Special и ВАЗ-2103 представляли собой различные варианты своего предшественника Fiat 124.

Первые временные экземпляры под индексом ВАЗ-2103В вышли с конвейера автозавода в 1972 году. Индекс «В» как раз таки и означал «временный». Почему именно временный? Да потому, что они были выпущены с точно таким же интерьером, как и предыдущая модель ВАЗ-2101,  с точно такой же панелью приборов и сиденьями. Различия заключались лишь в том, что у «тройки» было не две, а сразу четыре фары.

Полноценное серийное производство автомобилей ВАЗ-2103, без временного индекса началось в 1973 году. За годы производства данной модели, а выпускалась она до 1984 года, автомобиль проявил себя как надежный, экономичный и комфортабельный. За 12 лет было выпущено более 1 миллиона 300 тысяч экземпляров «тройки» различных модификаций, в том числе с кузовами универсал, кабриолет и даже трехосный кабриолет. В 1984 году седан ВАЗ-2103 сняли с производства, передав эстафету более совершенному по меркам тех лет автомобилю ВАЗ-2106.

что там за экспонаты и как их увидеть — журнал За рулем

Музей АВТОВАЗа в Тольятти отметил свое 45-летие!

Материалы по теме

В связи с юбилеем производитель раскрыл некоторые подробности того, как сегодня живет историческое наследие Lada.

Коллекция в музее собрана весьма интересная — тут более 60 автомобилей и несколько тысяч (!) других экспонатов, хотя начиналось все с трех машин и трудовых наград коллектива.

Сейчас помимо первого проданного ВАЗ-2101, автомобилей-миллионников (например, миллионным выпущенным автомобилем в 1973 году стал вишневый ВАЗ-2103, на фото) и просто хорошо отреставрированных классических машин здесь есть поистине уникальные аппараты.

Например, «пятерка» с РПД, внедорожник Нива, десять лет отработавший в Антарктиде, и еще один — на нем экспедиция в Гималаях забралась на высоту 5726 метров. Один из самых популярных экспонатов — «девяносто девятая», на кузове которой нанесены фамилии всех сотрудников завода; эта машина была создана к 25-летию автогиганта.

Отдельная история — концепты: здесь все те яркие машины, которые многие, вероятно, видели только на фото: молодежный Lada Roadster, футуристичный Питер-Турбо, изысканный электрический Рапан. Есть машины, которые на пару десятилетий опередили время, но так и остались в единственном экземпляре — электроверсия Оки или автомобиль на топливных элементах АНТЭЛ.

А вот некоторые наработки по Проекту С использовали позже для Весты — в экспозиции можно посмотреть на несколько вариантов «предка» популярного ныне автомобиля.

Материалы по теме

Много спортивных машин международного значения: ралли-рейдовые Niva T3 и Samara T3, кольцевые Granta и Vesta, а также спортпрототип Lada Revolution и даже его вариант для дорог общего пользования.

Пресс-служба АВТОВАЗа сообщает, что сейчас музей работает в  условиях ограничений, и посещение возможно только по предварительному согласованию с администрацией. Но тем, кто собирается посетить это место в Тольятти, рекомендуют подписаться на аккаунт в Инстаграм @museum.lada, где публикуются фото экспонатов и где объявят о возвращении к обычному графику работы.

Фото: АВТОВАЗ, Instagram/@museum. lada

АвтоВАЗ рассказал о самых интересных машинах из своего музея :: Autonews

Корпоративный музей Волжского автозавода в 2021 году отмечает свой 45-летний юбилей. В начале работы его экспозиция насчитывала всего 3 автомобиля, тогда как сейчас там выставлено более 60 машин и несколько тысяч других экспонатов. Об этом сообщает пресс-служба АвтоВАЗа.

Коллекцию музея открывает вишневый седан ВАЗ-2101, который стал первой проданной машиной АвтоВАЗа. Рядом с «копейкой» стоит автомобиль ВАЗ-2103 1973 года выпуска, ставший миллионной машиной, сошедшей с конвейера Волжского автозавода. Среди наиболее редких экспонатов также есть ВАЗ-2105 с роторно-поршневым двигателем и ВАЗ-2101, на котором было совершено кругосветное путешествие.

Плюс ко всему в музее организована отдельная экспозиция внедорожников Lada Niva. Среди них есть машина, 10 лет отработавшая на полярной станции в Антарктиде, а также автомобиль, который своим ходом достиг рекордной высоты в 5726 м на Эвересте.

В числе концепт-каров и прототипов есть двухместный кабриолет Lada Roadster, футуристичный проект «Питер-Турбо», электрокар «Рапан» и автомобили на топливных элементах Antel. Кроме того, в музее представлены гоночные автомобили АвтоВАЗа, в том числе знаменитый спортивный родстер Lada Revolution.

Наконец, в музее есть коллекция юбилейных и памятных машин. К примеру, на двух автомобилях стоят автографы президента России Владимира Путина. Речь идет об универсале Lada Largus, выпуск которого начался при его участии, а также о Lada Kalina Sport желтого цвета, на которой Путин проехал по трассе «Амур».

За 45 лет музей АвтоВАЗа посетило более полумиллиона человек. Пик посещаемости зарубежных гостей пришелся на лето 2018 года, когда в России проводили Чемпионат мира по футболу. На данный момент музей закрыт в связи с ограничениями на фоне коронавируса.

Autonews.ru теперь можно читать и в Telegram.

Музею ВАЗа исполнилось 45 лет — Журнал «4х4 Club»

Музей «АвтоВАЗа» отметил 45-летний юбилей. Начиная с 1976 года, когда он был основан, собрание разработок и серийных машин завода в Тольятти посетило более миллиона человек.

В заводском музее собрано несколько десятков автомобилей – включая «единичку» ВАЗ-2101, которая первой сошла с конвейера завода в 1970 году. Примечательно, что изначально автомобиль не поступил в заводской музей, а был продан – владелец, сохранивший машину в достойном состоянии, через два десятилетия передал её в заводской музей, взамен получив новую «Ладу».

Первый миллион автомобилей ВАЗ собрал в 1973 году. Миллионный экземпляр — «тройка», самая новая модель на тот момент

Там же представлены юбилейные, миллионные экземпляры выпущенных автомобилей. Первый миллион машин ВАЗ выпустил к 1973 году. Юбилейным экземпляром стала самая новая на тот момент модель – седан ВАЗ-2103.

В заводском музее выставлены и «Нивы», включая внедорожник первого поколения, а также красный ВАЗ-2121 «Нива», который в течение 10 лет успешно эксплуатировался на российской научной станции в Антарктиде. Пробежала машина за эти годы совсем немного – около 10 000 км. На базе пятидверной «Нивы» построен проект Antel на водородных топливных элементах.

Интересна коллекция концептов, в том числе и тех, которые так и не стали серийными. Среди них кабриолет Lada Roadster, «Питер Турбо», электромобиль «Рапан». Сохраняется в заводском музее и семейство машин, созданных в рамках так называемого «Проекта С».

Наработки по этой платформе были использованы для серийной Lada Vesta, производство которой стартовало в 2015 году.

Среди юбилейных и памятных машин – предсерийная «десятка», которую в 1994 году демонстрировали президенту Борису Ельцину, а также жёлтая Lada Kalina Sport, на которой в 2010 году проехал по трассе Чита – Хабаровск Владимир Путин – на тот момент председатель правительства.

В 1991 году была изготовлен музейный седан ВАЗ-21099, на котором разместили фамилии всех работников ВАЗа на тот момент.

в музее АВТОВАЗа за 45 лет собрали тысячи экспонатов

В этом году музей АВТОВАЗа отмечает 45-летие со дня открытия. За это время его посетили более миллиона человек, а начальная экспозиция, состоящая из трех автомобилей и трудовых наград коллектива, разрослась до нескольких тысяч экспонатов. В музее — более 60 автомобилей, многие из которых имеют особую историю. 

Фото: музей ПАО «АвтоВАЗ»

Коллекция исторических автомобилей LADA открывается вишневым ВАЗ-2101 1970 года — это первая проданная машина волжского автогиганта. Прежде чем стать экспонатом заводского музея, автомобиль прослужил владельцу 19 лет и хорошо сохранился. Именно на базе этой машины было создано так называемое классическое семейство автомобилей ВАЗ, которое находилось на конвейере до 2012 года.  

Рядом с легендарной «копейкой» — темно-вишневый ВАЗ-2103, один из первых экспонатов музея, отреставрированный в прошлом году. Этот автомобиль выпустили в 1973-м. Примечателен он тем, что стал первым миллионником (то есть миллионным экземпляром, выпущенным с конвейера завода). 

Вазовская «классика» в музее — это модели 2102, 2106, 2107. Также здесь можно увидеть несколько уникальных автомобилей, например ВАЗ-2105 с роторно-поршневым двигателем и ВАЗ-2101, который совершил кругосветное путешествие. 


Фото: Музей ПАО «АВТОВАЗ»

Отдельное место в музейной линейке ВАЗа занимает LADA Niva. Историки автомобилестроения по достоинству оценили отреставрированный внедорожник первого поколения. Интересна история автомобиля Niva, который более десяти лет отработал в Антарктиде. Есть и пятидверная LADA Niva — та самая, что во время экспедиции в Гималаях покорила своим ходом высоту в 5726 метров. 

Особенная часть экспозиции — концепты и прототипы. Здесь есть дизайнерские проекты, в частности двухместный кабриолет LADA Roadster, футуристичный концепт в биостиле «Питер-Турбо» и электрокар «Рапан». 


Фото: Музей ПАО «АВТОВАЗ»

Гоночные Niva, Samara, Vesta, Granta занимают достойное место в экспозиции музея. В этом году исполняется полвека с момента выхода LADA на международные автомобильные соревнования. Российская марка заявляла себя в различных дисциплинах, в том числе в кольцевых гонках и ралли. 

Демонстрируется здесь и родстер LADA Revolution, ставший основой для одноименного монокласса. 

Примечательна коллекция юбилейных и памятных машин — первые серийные Granta и Largus, несколько автомобилей-миллионников, от LADA Samara до LADA Priora.

 

Фото: Музей ПАО «АВТОВАЗ»

Уникальная машина ВАЗ-21099, выпущенная в 1991 году к 25-летию АВТОВАЗа, является одним из самых популярных экспонатов: на кузов автомобиля нанесены фамилии всех сотрудников автозавода, которые работали в то время.  

В 1994 году Президенту России Борису Ельцину показали предсерийный седан LADA-110. Глава государства тогда протестировал новую машину. Она и стала частью музейных раритетов. 

Есть в музее и два автографа Президента России Владимира Путина — на LADA Largus, производство которого стартовало с его участием, и на желтой LADA Kalina Sport, за рулем которой в должности премьер-министра страны Путин инспектировал новую трассу «Амур». 


Фото: Музей ПАО «АВТОВАЗ»

Сейчас музей временно в связи с пандемией принимает гостей по предварительному согласованию с администрацией. Для всех, кто интересуется историей марки LADA, музей публикует материалы на своей странице в «Инстаграме» (@museum_lada). На этой же странице сообщат о возобновлении работы музея, когда он будет готов открыть двери для всех желающих. 


Фото: музей ПАО «АВТОВАЗ»

Еще больше новостей в наших соцсетях!
Читайте, обсуждайте, подписывайтесь.

Ozark 2103 Гитара-банджо с чехлом

Royal Mail объявляет об изменениях в пунктах специальной доставки и обслуживания клиентов.
В свете недавних рекомендаций правительства относительно COVID-19, обратите внимание на следующее объявление Royal Mail об изменениях в их услугах.

Особые поставки.

В связи с увеличением количества отсутствующих, мы пересмотрели наши установленные по времени гарантии для услуг специальной доставки, гарантированной до 9:00 и 13:00, и внесем следующие изменения.

Для товаров, отправленных со вторника, 31 марта 2020 года, наша гарантийная доставка для специальной доставки гарантирована до 9.00:00 следующего рабочего дня сменится на 12:00 следующего рабочего дня *. Наша гарантированная доставка для специальной доставки, гарантированной до 13:00, изменится на 21:00 следующего рабочего дня *.

Мы постараемся обеспечить быструю обработку и отправку заказов в тот же день, если это вообще возможно.

Заказанные товары, требующие установки в мастерской, будут отправлены в течение 1-2 дней с использованием местной службы доставки на следующий день DPD (на следующий день будет день после того, как они покинут магазин Eagle Music Shop).В день доставки вы получите текстовое сообщение с указанием времени доставки

.

Вы будете немедленно проинформированы, если возникнут проблемы с какой-либо частью вашего заказа или если какой-либо товар отсутствует на складе.

NB: Заказы обрабатываются в субботу, но не отправляются нам до понедельника, поскольку Royal Mail и DPD Local не получают от нас в выходные дни.


Вы можете прочитать нашу полную политику доставки здесь.

Если вы не совсем довольны своей покупкой или заказали не тот товар, Eagle Music с радостью вернет вам деньги за покупку (за исключением почтовых расходов) в течение 28 дней при условии, что товары полностью пригодны для перепродажи (включая оригинальную неповрежденную упаковку ) и не фигурирует в Политике исключения. (Исключения относятся к выбранным товарам).

Обратите внимание на следующие исключения:

DVD и CD не могут быть возвращены, если они не неисправны

Головки банджо не могут быть возвращены после того, как вы попытались установить их на банджо

Гармоники имеют 7-дневную гарантию и могут быть возвращены в течение этого времени в случае обнаружения дефектов

Товары должны быть возвращены Eagle Music вместе с сопроводительным письмом и контактными данными, чтобы вопрос мог быть решен эффективно и быстро.

Вы можете прочитать нашу полную политику возврата здесь.

eIF2α (L57A5) Мышь mAb | Технология сотовой сигнализации

Ограниченное использование

Если иное прямо не согласовано в письменной форме, подписанной законным представителем CST, следующие условия применяются к Продуктам, предоставляемым CST, ее аффилированными лицами или ее дистрибьюторами. Любые условия и положения Клиента, указанные в дополняют или отличаются от содержащихся в настоящем документе, если иное не принято в письменной форме юридически уполномоченным представитель CST, отклоняются и не имеют силы.

Продукты имеют маркировку «Только для исследовательских целей» или аналогичную маркировку и не были одобрены, одобрены или лицензированы. FDA или другой регулирующей иностранной или отечественной организацией для любых целей. Заказчик не должен использовать какой-либо продукт для диагностики. или в терапевтических целях, или иным образом любым способом, который противоречит заявлению на этикетке. Продукты, продаваемые или лицензируемые CST предоставляются Заказчику как конечному пользователю и исключительно для использования в исследованиях и разработках.Любое использование Продукта для диагностики, в профилактических или терапевтических целях, или любая покупка Продукта для перепродажи (отдельно или в качестве компонента) или в других коммерческих целях, требуется отдельная лицензия от CST. Клиент не имеет права (а) продавать, лицензировать, ссужать, жертвовать или иным образом передавать или предоставлять любой Продукт для любой третьей стороны, отдельно или в сочетании с другими материалами, или использовать Продукты для производства любых коммерческие продукты, (б) не копировать, изменять, реконструировать, декомпилировать, дизассемблировать или иным образом пытаться обнаружить лежащие в основе структуру или технологию Продуктов, или использовать Продукты с целью разработки любых продуктов или услуг, которые конкурировать с продуктами или услугами CST, (c) не изменять и не удалять из Продуктов какие-либо товарные знаки, торговые наименования, логотипы, патенты или уведомления об авторских правах или маркировка, (d) использовать Продукты исключительно в соответствии с Условия продажи продуктов CST и любые применимые документации и (e) соблюдать любую лицензию, условия обслуживания или аналогичное соглашение в отношении любых сторонних продуктов или услуги, используемые Клиентом в связи с Продуктами.

Moore Bettah «Sweet Leilani» Custom Tenor (# 2103 Ulu / «The Tree» Mahogany)

АУКЦИОН: New Moore Bettah Custom Tenor

Если вы цените лучшее в гавайской гитаре, то вы, вероятно, знаете мастера Большого острова Чак Мур и Мур Бетта укулеле. Несмотря на то, что мы знаем, что Мур Бетта неизменно невероятна, каждая из них представляет собой уникальное произведение вневременного искусства с потрясающим звучанием и легкостью игры. Это один из лучших, которые мы когда-либо испытывали, по внешнему виду и звуку.

Укулеле обладает множеством вдохновляющих особенностей. Первое, что бросается в глаза, — это бейка мирового класса. Этот абсолютно великолепный вахин — Sweet Leilani. Она была создана с использованием уникального искусства скримшоу. Лейлани в переводе с гавайского означает «небесный цветок», и на ней красивый головной убор с цветочным орнаментом из различных цветных пород дерева и искусственной слоновой кости. Эта тема плюмерии следует за 12-м ладом, создавая потрясающую композицию.

Укулеле Moore Bettah — не самые популярные укулеле, изготовленные на заказ, просто из-за их красоты для глаз.Как показывают Кори и Мика в своих обзорах, звук такой же умопомрачительный. Этот исключительный с декой из дерева улу (хлебное дерево). Плотность древесины улу находится между елью и красным деревом, разделяя одновременно силу и тепло этих популярных пород дерева. Это сочетается с самым потрясающим красным деревом, которое вы только можете себе представить из «Дерева». (Подробнее об этом особом дереве ниже). Сначала послушайте эту невероятную гавайскую гитару.

Аудиозапись не сжимается и не мастерируется. Чтобы услышать наиболее точный тон, используйте качественные динамики или наушники.

Обрамление корпуса, бокового порта, горловины и лицевой панели является эталонным креплением для коа. Это действительно «всплывает», особенно на фоне яркого стеганого красного дерева «Дерево». Что такое «Дерево»?

«Дерево» — знаменитое дерево из красного дерева, вырубленное в джунглях Чикибул в Гондурасе в 1965 году. Оно было огромным, с великолепной спиралевидной корой, и лесорубы знали, что это будет потрясающе, и, хотя это было в сумасшедшей части джунглей, они пошли туда. для этого. Но они не могли этого достать.Он упал в овраг. Другие люди приходили и пытались, и никто не мог получить это 18 лет. Как вы знаете, у него была потрясающая фигура, но он также имеет большую плотность и свойства розового дерева в своем тоне. Из-за этого и из-за своей редкости на долгие годы она стала самой популярной древесиной для изготовления нестандартных гитар. Этого дерева осталось немного, но очевидно, что у Чака есть несколько комплектов укэ, и это дерево действительно делает инструмент красивым по внешнему виду и тону.

Это очень легкая укулеле тенора, изготовленная на заказ, с сильным сбалансированным тоном и невероятным сустейном и интонацией на всем протяжении шеи. Вдобавок ко всему, это лучшее ощущение, которое вы можете себе представить. Чак настроен на мировой уровень, и эта укулеле имеет низкий строй, не гудит вместе со стержнем из углеродного волокна в шее, чтобы гарантировать, что она поддерживает это идеальное ощущение. Иметь такую ​​легкую укулеле с таким чудесным звуком — это особенное дело. Добавьте оригинальное искусство, и вы получите настоящее сокровище.

Чак ​​строит самостоятельно и работает вручную, без компьютерного проектирования, лазерной резки или сторонних поставщиков. Здесь представлено уникальное искусство, называемое скримшоу, которое считается старейшим из всех видов искусства Северной Америки.Так называют гравюры и резные фигурки, сделанные на кости, или теперь Чак использует искусственную слоновую кость без животных. Он делал это последние 30 лет и сказал:

«Для меня это так же естественно, как и рисование. Само травление выполняется с помощью ножа Exacto №11 для начертания линий или отдельных точек. Этот эффект известен художникам как« пуантилизм ». Использование лупы 10 крат и работая с сильным отражающим светом, каждая точка или группа точек рисуется, а затем заливается тонко измельченными художественными маслами.Пигмент немедленно стирается, открывая травление. На поверхности фактически не осталось краски. Если я сделаю ошибку или начну писать слишком глубоко в определенной области, кусок придется отшлифовать и начать заново ».

У Чака недавно возникли серьезные проблемы со здоровьем. Он пролежал в больнице около полутора месяцев в конце прошлого и начале этого года. Но он смог вернуться в мастерскую и закончить этот шедевр. Никто не строит так, как Чак Мур.Он учится в своем собственном классе, и этот инструмент — кульминация многих лет стремления к этому искусству и лютерии. Если вы ищете идеальную гавайскую гитару, мы даем ей наши главные рекомендации.

Включает твердый кожаный чехол Oahu, увлажнитель воздуха Oasis и бесплатную доставку.

Это аукцион, подробная информация представлена ​​ниже.

Farrell Guitar Repair Calgary AB (403) 473-2103 Вик Фаррелл

ПОЛНАЯ НАСТРОЙКА
— от 70 до 100 долларов
Базовая установка включает:
— удаление струн
— цепляние и полирование ладов
— осмотр и очистка настроечных машин
— осмотр и очистка моста
— осмотр и очистка гайки
— осмотр и очистка хвостовая часть
— осмотр и очистка электроники
— восстановление с новыми струнами
— настройка
— установка действия (высота струны)
— регулировка грифа, анкерного стержня
— смазка металлических деталей
— настройка, настройка интонации
— заключительный тест

РЕМОНТ
Лада и корона — 140 $
Может потребоваться более обширный ремонт.Лады могут расшататься или износиться, и, возможно, потребуется их замена. Как правило, выравнивание, перекрашивание и полировка ладов решают большинство проблем с ладом.

Ремонт кузова — 50 долларов и более
Сломанный Reglue или
ослабленных скоб
Ремонт трещин — 60 долларов и более

МОДИФИКАЦИИ
Наиболее распространенные формы модификаций включают установку систем звукоснимателей, которые могут быть такими же простыми, как звукосниматель под седлом к ​​гнезду концевого штифта, или сложным, как сложный звукосниматель с несколькими источниками с бортовой электроникой.

Установка звукоснимателя (акустическая)
85 долл. США и более

Установка звукоснимателя (электрическая)
65 долл. США и более

ДРУГИЕ FRET JOBS
Палисандр или черное дерево

— 300 долларов США (без привязки)
Розовое дерево или черное дерево
— 375 долларов США (с переплетом)
Maple Refinished — 475 долларов США
Maple с Oil Refinish —

СБРОС ШЕИ — $ 500 и выше
Регулировка грифа выполняется в базовой настройке, однако иногда необходимо выполнить сброс грифа гитары.Для электрогитар с болтовым креплением это простая и недорогая процедура. На акустических гитарах гриф должен быть удален и угол соединения «ласточкин хвост» должен быть изменен. Затем гриф должен быть соединен с гитарой.

ДРУГИЕ РЕМОНТЫ ШЕИ

Сломанная шейка или
Передняя бабка
140 долл. США и более
Горловина горячего прессования 140 долл. США и более

РЕМОНТ МОСТА
Установить новое седло

Только трудозатраты
Сделать новое седло
Только трудозатраты
Восстановить поверхность и заменить мост — 140 долларов
Сделать новый мост — 140 долларов и выше

РЕМОНТ PEGHEAD
Клей и отделка до подкраски
140 долл. США и выше
Установка новых станков для настройки
Только трудозатраты 35 долл. США и выше
Установить новую костную гайку
Только трудозатраты 35 долл. США
Сделать новую костную гайку
Только трудозатраты $ 60

FRET Визуализация диатомовых водорослей, экспрессирующих датчик рибозы, локализованный в биокремнезе

Abstract

Предусматривается, что материалы будущего будут включать биоорганизованные, гибридные, трехмерные наносистемы, включающие функциональные белки. Диатомовые водоросли поддаются генетической модификации для локализации рекомбинантных белков в клеточной стенке биокремнезема. Однако полный спектр белковых функций, которые могут быть реализованы в модифицированном пористом биокремнеземе, еще предстоит описать. Наша цель состояла в том, чтобы функционализировать диатомовый биокремнезем с помощью безреагентного сенсора, зависящего от связывания лиганда и конформационных изменений, чтобы управлять возможностями передачи сигналов на основе FRET. Слитый белок, разработанный для придания таких свойств, включал бактериальный периплазматический связывающий рибозу белок (R), фланкированный CyPet (C) и YPet (Y), голубыми и желтыми флуоресцентными белками, которые действуют как пара FRET.Структура и функция рекомбинантного химерного белка CRY была подтверждена экспрессией в E.coli до трансформации диатомовой водоросли Thalassiosira pseudonana . Масс-спектрометрия рекомбинантного CRY показала 97% идентичность с выведенной аминокислотной последовательностью. CRY с N-концевой меткой Sil3 и без нее для локализации биокремнезема обнаруживал характерные рибозозависимые изменения FRET с аналогичными константами диссоциации 123,3 мкМ и 142,8 мкМ, соответственно.Добавление тега Sil3 не изменяет сродство CRY к субстрату рибозы. Последующая трансформация T. pseudonana вектором, кодирующим Sil3-CRY , привела к локализации флуоресценции в биокремнеземе и изменениям FRET как в живых клетках, так и в изолированных панцирях в ответ на рибозу. Эта работа продемонстрировала, что наноархитектура генетически модифицированной клеточной стенки биокремнезема способна поддерживать функциональность относительно сложного слитого белка Sil3-CyPet-RBP-YPet с его потребностью в связывании лиганда и конформационных изменениях для генерации сигнала FRET.

Образец цитирования: Marshall KE, Robinson EW, Hengel SM, Paša-Tolić L, Roesijadi G (2012) FRET-визуализация диатомовых водорослей, экспрессирующих датчик рибозы, локализованный в биокреме. PLoS ONE 7 (3): e33771. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033771

Редактор: Анна Митраки, Университет Крита, Греция

Поступила: 16 ноября 2011 г .; Принята к печати: 21 февраля 2012 г .; Опубликовано: 21 марта 2012 г.

Авторские права: © 2012 Marshall et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Это исследование было частично поддержано Управлением военно-морских исследований, номер награды N0001409IP20071 (http://www.onr.navy.mil/). Исследования с использованием масс-спектроскопии были частично поддержаны американским Законом о реинвестировании и восстановлении от 2009 г. и U. S. Отдел биологических и экологических исследований Министерства энергетики (DOE). Участие студентов было частично профинансировано программой стажировки в лаборатории естественных наук Министерства энергетики США. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: У авторов нет поддержки или финансирования, чтобы сообщить о них.

Введение

Ожидается, что создание трехмерных материалов будущего с многомасштабной архитектурой будет включать биосборку [1].Самосборка посредством биосинтеза в живых организмах может заменить химический синтез гибридных структур с функциональными элементами, иммобилизованными в высокоупорядоченных биоминеральных структурах, подобных тем, которые встречаются в природе. Клеточные стенки биокремнезема диатомовых в течение некоторого времени были признаны иерархически упорядоченными, мезопористыми структурами от микро до нанометров, которые могут служить основой для разработки современных материалов [2]. Попытки конструировать кремнеземные материалы, вдохновленные пониманием биологии диатомовых водорослей, включали 1) конденсацию кремнезема из кремниевой кислоты in vitro с использованием силуффинов или пептидов, полученных из силлафина [3] — [7] и 2) манипулирование живыми клетками для добавлять функциональные элементы путем метаболической вставки [8], [9] или генетической модификации структуры клеточной стенки [10], [11].Последние подходы на основе клеток позволяют сборку в физических и химических условиях окружающей среды, присущих культуре клеток диатомовых водорослей.

Недавние успехи в разработке систем трансформации диатомовых водорослей позволили сконструировать векторы экспрессии, которые могут нацеливать локализацию рекомбинантных белков на клеточную стенку биокремнезема [10]. Зеленый флуоресцентный белок (GFP) и ферменты с мультимерной структурой и / или требующимися кофакторами были успешно иммобилизованы в биокремнеземе Thalassiosira pseudonana , помечая их силаффином Sil3, который нацелен на локализацию в клеточной стенке биокремнезема [10], [10], [10] 12]. Наша цель состояла в том, чтобы проверить способность биокремнезема диатомовых водорослей служить каркасом для сложных химерных слитых белков, требующих крупномасштабных движений, связанных с лиганд-зависимыми конформационными изменениями, чтобы функционировать.

Для этого мы построили датчик рибозы, который использует сигнальную систему, основанную на изменениях в передаче энергии резонанса Фёрстера (FRET) для локализации в биокремнезе диатомовых водорослей. Сенсорная конструкция включала бактериальный периплазматический связывающий рибозу белок (RBP; [13]), фланкированный флуоресцентной парой FRET CyPet и YPet [14] — [16], создавая сенсорную кассету CyPet-RBP-YPet (CRY), для которой требуется рибоза. связывание и конформационное изменение RBP, чтобы управлять изменениями в FRET.Вставка последовательности силлаффина Sil3 перед CRY нацелена на химерный белок для локализации в биокремнеземе диатомовых водорослей. Здесь мы сообщаем об успешной функционализации T. pseudonana с помощью сложного безреагентного сенсора, иммобилизованного в клеточной стенке биокремнезема. Это исследование демонстрирует потенциал диатомовой системы для размещения сложных белков в трехмерном гибридном материале посредством биосборки в условиях окружающей среды.

Результаты

Конструкция и характеристики датчика CRY

Дизайн рекомбинантного сенсора CRY был основан на конструкции FLIPrbs-F15A (мутантная форма F15A; [13]), кодирующей RBP, фланкированную усиленными голубыми и желтыми флуоресцентными белками, ECFP и EYFP, соответственно.Мы заменили пару ECFP-EYFP FRET последовательностями, кодирующими флуоресцентные белки CyPet и YPet [16], и клонировали полученную последовательность CyPet-RBP-YPet в вектор pRSET для бактериальной экспрессии, управляемой промотором T7 . Две последовательности His 6 фланкировали рекомбинантную кассету CyPet-RBP-YPet с образованием белка «His 6 -CyPet-RBP-YPet-His 6 » (CRY) массой приблизительно 87,6 кДа.

Идентификационный номер E.coli -экспрессируемый рекомбинантный белок CRY и его функциональность FRET проверяли с помощью ЖХ-МС / МС и экспериментов по связыванию лиганда, соответственно. Масс-спектрометрия химерной конструкции подтвердила 97% аминокислотной последовательности слитого белка CRY (рис. 1). В части последовательности RBP (L341M) произошла точечная мутация лейцина в метионин, что подчеркивает возможности масс-спектрометрии в обнаружении небольших различий в выведенных и проанализированных аминокислотных последовательностях. Неидентифицированные остатки находились в 21 положении внутри CyPet и в одном положении в части RBP химерного белка.Ион-предшественник для первого наблюдался в нескольких сканированиях МС, однако спектры МС / МС не были достаточно высокого качества, чтобы дать положительную идентификацию с нашими строгими критериями фильтрации. Эти несоответствия не были локализованы в кармане связывания рибозы или в функциональном домене поворота петель RBP [17], и не ожидалось, что они повлияют на общую производительность сенсорной кассеты.

Рисунок 1. Масс-спектрометрия для проверки аминокислотной последовательности выведенного белка CRY.

Пробы белка переваривали протеазами глюкозы и трипсина отдельно и анализировали с использованием ЖХ-МС / МС с высоким разрешением.Масс-спектрометрия подтвердила 97% выведенной рекомбинантной последовательности CRY. Остальные 3% были либо неидентифицированными, либо представляли несоответствие в 1 аминокислоте (*). Синяя заливка = последовательность CyPet; Красная заливка = последовательность RBP; Желтая заливка = последовательность YPet; Серый = линкерные последовательности; Черные линии = его теги 6 и Xpress ™.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033771.g001

Перед экспрессией в диатомовых водорослях мы проверили функциональность FRET рекомбинантных CRY и Sil3-CRY, экспрессируемых E. coli , путем тестирования чувствительности сенсор конструируется для добавления рибозы.Связывание рибозы с рецептором сдвигает амино- и карбоксильные концы RBP дальше друг от друга и увеличивает расстояние между CyPet и YPet, что приводит к снижению FRET (рис. 2). Связывание рибозы с RBP привело бы к уменьшению соотношения относительной интенсивности флуоресценции желтый / голубой (530/485 нм), связанного с уменьшением FRET.

Рис. 2. Модель индуцированного рибозой конформационного изменения CRY и связанного с ним снижения FRET.

Несвязанный: в отсутствие рибозы рибозосвязывающий белок (RBP) находится в открытой конфигурации с C и Y, которые присоединены к амино- и карбоксильным концам RBP, соответственно, в непосредственной близости друг от друга.Когда CRY возбуждается на длине волны 435 нм, излучение C возбуждает Y, что приводит к высокому отношению интенсивностей излучения 530/485. Связано: связывание рибозы (R) с помощью RBP вызывает конформационные изменения в RBP, которые разделяют амино- и карбоксильные концы RBP, тем самым увеличивая расстояние между C и Y. Это увеличение расстояния снижает передачу энергии между двумя флуоресцентными белками, тем самым уменьшая соотношение интенсивности излучения 530/485. Таким образом, увеличение концентрации рибозы приводит к снижению FRET.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033771.g002

В соответствии с этим поведением, снижение эффективности FRET в зависимости от увеличения концентрации рибозы было очевидно из кривых насыщения (рис. 3). Соответствующие константы диссоциации ( K d ) 123,3 мкМ для CRY и 142,8 мкМ для Sil3-CRY существенно не отличались друг от друга или от ранее опубликованных K d 119 мкМ для ECFP-RBP. Конструкция -EYFP, кодируемая FLIPrbs- F15A [13] (p> 0.1 для всех сравнений). Таким образом, замена CyPet и YPet на ECFP и EYFP, соответственно, и добавление тега Sil3 к CRY не показали значительного изменения сродства рецептора к рибозе.

Рисунок 3. Зависимый от рибозы FRET в рекомбинантном CRY и Sil3-CRY, экспрессируемый в E. coli .

Образцы выделенных белков CRY и Sil3-CRY обрабатывали различными концентрациями рибозы в диапазоне от 1 мкМ до 10 мМ. K d для CRY и Sil3-CRY существенно не отличаются друг от друга (см. «Материалы и методы» для получения подробной информации о расчетах и ​​статистическом анализе K d ).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033771.g003

Экспрессия CRY в диатомовых водорослях

Определив, что кассета Sil3-CRY функционирует, как ожидалось in vitro , диатомовые T. pseudonana трансформировали pTpfcp / Sil3-CRY: fcp / nat , вектор экспрессии Sil3-CRY для диатомовых водорослей. бомбардировкой микрочастицами под высоким давлением [11]. В этом векторе кодировались как кассета экспрессии Sil3-CRY , так и ген nat , придающий устойчивость к нурсеотрицину.

ПЦР-амплификация геномной ДНК, выделенной из трансформированных диатомовых водорослей, дала электрофоретические полосы, соответствующие генам CRY и nat , которые отсутствовали у нетрансформированных диатомей дикого типа. ОТ-ПЦР библиотек кДНК первой цепи привела к появлению полос, соответствующих генам CRY и nat в трансформированных образцах, но не в нетрансформированных образцах (данные не показаны). Эти результаты свидетельствуют об успешной трансформации и экспрессии генов у трансформированных диатомовых водорослей.

Мы проверили присутствие рекомбинантного CRY в трансформированных диатомовых водорослях и их изолированных клеточных стенках из биокремнезема с помощью флуоресцентной микроскопии и визуализации проточной цитометрии (рис. 4A и 4B, соответственно). Мы использовали флуоресцентную микроскопию для изображения как трансформированных живых клеток, так и изолированных панцирей. Это выявило отчетливый периметр голубой флуоресценции, согласующийся с локализацией Sil3-CRY в биокремнеземе как в трансформированных клетках, так и в изолированных оболочках биокремнезема (рис. 4А). Эта флуоресценция перекрывалась периметром диатомовых водорослей на изображениях в светлом поле и соответствовала локализации CRY в клеточной стенке биокремнезема.Очевидная совместная локализация CRY в хлоропласте была приписана просачиванию интенсивной красной автофлуоресценции хлорофилла в голубой и желтый каналы. Это наблюдение было рассмотрено с помощью проточной цитометрии.

Рис. 4. Флуоресцентные изображения трансформированных и нетрансформированных живых диатомовых водорослей и изолированного биокремнезема.

(A) Флуоресцентная микроскопия: живые трансформированные клетки и изолированные створки биокремнезема были визуализированы в ярком поле для отображения клеточной структуры и для голубой флуоресценции CyPet и красной автофлуоресценции, чтобы показать их соответствующую локализацию в биокремнеземе и хлоропластах.Отсутствие красной автофлуоресценции в изолированном биокремнеземе подчеркивает отсутствие хлоропластов и, следовательно, отсутствие клеточного материала в клеточной стенке биокремнезема. (B) Визуализация проточной цитометрии: pTpfcp / Sil3-CRY: трансформированные (TR) и нетрансформированные (WT) клетки fcp / nat- визуализировали для светлого поля, голубой флуоресценции CyPet, желтой флуоресценции YPet из FRET и хлоропластной автофлуоресценции. флуоресценция. Голубые, желтые и красные изображения были объединены, чтобы выделить флуоресценцию CyPet и YPet, фланкирующих хлоропласты.В клетках WT обнаруживалась только красная автофлуоресценция хлоропластов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033771.g004

Изображения эпифлуоресценции, полученные с помощью проточной цитометрии, были выбраны для дальнейшего анализа с использованием следующих критериев: 1) были получены изображения только отдельных клеток в фокусе, а не скоплений в поле зрения, 2) изображения были положительными в отношении автофлуоресценции красного хлорофилла, и 3) изображения были положительными в отношении желтой флуоресценции, полученной из FRET.Эти критерии позволили нам просмотреть отдельные живые клетки, обозначенные наличием хлорофилла, и проанализировать интенсивность флуоресценции и структуру внутри клетки. Вытекание автофлуоресценции красного хлоропласта было компенсировано в каналах CyPet и YPet.

Путем отбора каждой популяции, как указано выше, мы проанализировали 21,3% трансформированной популяции и 2,9% нетрансформированной популяции дикого типа для дальнейшего анализа. В трансформированной субпопуляции локализацию голубой и желтой флуоресценции, связанной с CRY, можно было отличить от красной аутофлуоресценции хлорофилла.Преобладали клетки с голубой и желтой флуоресценцией, соседствующие с красной флуоресценцией хлоропласта, а не одновременно в одном и том же клеточном местоположении (объединенное изображение на фиг. 4B TR). Интенсивность голубой и желтой флуоресценции в клетках дикого типа обычно была слабой или неопределяемой (рис. 4B WT).

FRET в живых диатомовых водорослях и изолированных клеточных стенках биокремнезема

Хотя изначально было неясно, будут ли конформационные изменения RBP, необходимые для управления изменениями FRET, ограничиваться доступностью субстрата или стерическими препятствиями, связанными с иммобилизацией Sil3-CRY в нанопористой архитектуре клеточной стенки биокремнезема, изменения FRET, вызванные рибозой, были наблюдается как в живых трансформированных клетках, так и в изолированных клеточных стенках биокремнезема (ответ репрезентативной клетки показан на рис. 5А и 5Б). При уровне насыщения рибозы 300 мМ соотношение FRET (530/485 нм относительные флуоресцентные единицы [RFU]) снизилось в среднем на 0,19 ± 0,01 (1 SE, n = 10) и 0,43 ± 0,04 (1 SE, n = 4) в трансформированных живых клетках и изолированных клеточных стенках биокремнезема соответственно. Это различие между трансформированными клетками и изолированным биокремнезем было очень значимым (p <0,001), как и разница между этими значениями и соответствующими фоновыми изменениями в нетрансформированных контрольных структурах дикого типа (рис.5A и 5B) (p <0,05). Кривая "концентрация-ответ" для внешних концентраций рибозы у живых трансформированных диатомовых водорослей показала ЕС 50 , равное 23,3 мМ (фиг. 6). Сравнение этого значения с субстратным сродством CRY E. coli (рис. 3) и значительно большее снижение FRET в изолированном биокремнеземе по сравнению с живой клеткой предполагает, что клеточный матрикс препятствует доступу рибозы к клеткам. датчик с иммобилизованным кремнеземом.

Рисунок 5.Рибозозависимая визуализация FRET у живых, трансформированных диатомовых водорослей и изолированного биокремнезема.

(A) Для получения изображения флуоресценции CyPet и YPet до и после добавления 300 мМ рибозы использовали покадровую визуализацию живых клеток. Флуоресцентные изображения снимали одновременно в обоих флуоресцентных каналах каждую минуту в течение 40 минут. Рибозу добавляли к клеткам через 20 мин после первоначальной визуализации. Соотношение FRET (соотношение RFU 530/485 нм) уменьшается при добавлении рибозы. (B) Аналогично, покадровую визуализацию клеточных стенок биокремнезема проводили в течение 10 минут с добавлением 300 мМ рибозы через 5 минут.Соотношение FRET уменьшается в ответ на добавление рибозы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033771.g005

Рис. 6. Концентрация-реакция pTpfcp / Sil3-CRY: fcp / nat- трансформированных диатомовых водорослей, подвергшихся воздействию рибозы.

Нормализованные значения ΔFRET (ΔF n ) для отдельных клеток, обработанных рибозой. ЕС 50 , равный 23,3 ± 4,7 мМ (среднее ± стандартное отклонение), соответствует концентрации рибозы, дающей 50% от максимального значения ΔF n .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033771.g006

Обсуждение

Наноразмерная иерархическая организация диатомового кремнезема представляет интерес как модель для синтеза материалов, особенно в контексте силицификации при умеренном pH и температуре окружающей среды [18]. Первоначальные исследования в этой области были сосредоточены на использовании поликатионных пептидов диатомовых водорослей, силлафинов [5], [19], в химическом синтезе гибридных комплексов силафин-кремнезем из кремниевой кислоты.Эта работа была распространена на создание реакторов с иммобилизованными ферментами путем добавления в реакцию таких ферментов, как каталаза, пероксидаза хрена и бутирилхолинэстераза, а также на конъюгацию полиаминов с лизинами для имитации взаимодействия между силафинами и полиаминами при осаждении кремнезема из кремниевой кислоты [ 20] — [22]. В обоих случаях белки нацелены на локализацию в матрице кремнезема.

Разработка системы трансформации диатомовых водорослей открыла возможность генетических манипуляций со структурой биокремнезема посредством экспрессии рекомбинантных химерных белков, которые включают силуффин или, в последнее время, цингулин как часть химерной гибридной конструкции [23].Оба последних белка могут закрепить конструкцию в биокремнеземе и связаны с функциональными белками, которые локализуются в биокремнеземе и сохраняют функцию, когда биокремнезем изолирован от клетки [10], [12]. К протестированным на сегодняшний день белкам относятся белки с мультимерной структурой субъединиц и требованиями к кофакторам [12]. Представляло интерес определить, могут ли сложные химерные слитые белки, которые включают несколько белковых модулей и имеют требования к связыванию лигандов и крупномасштабным движениям, функционировать в рамках пространственных ограничений биокремнезема диатомовых водорослей.

Поскольку не было известно, будет ли тег Sil3 препятствовать связыванию рибозы с помощью RBP, конформационному изменению RBP в ответ на рибозу или пространственным взаимодействиям CyPet и YPet, в первоначальных экспериментах исследовали FRET в очищенном рекомбинантном E. coli, экспрессируемом . CRY и Sil3-CRY. FRET как для CRY, так и для Sil3-CRY функционировали, как ожидалось, демонстрируя сходство K d друг с другом и с конструкцией ECFP-RBP-EYFP, кодируемой FLIPrbs-F15A [13].Мы также продемонстрировали функциональность датчика на живых диатомовых водорослях и изолированном биокремнезе. Наше исследование показало, что сенсорная кассета, полученная в результате слияния четырех белков с меткой, нацеленной на биокремнезем, была локализована на клеточной стенке диатомовых T. pseudonana и могла претерпевать необходимые пространственные перестройки, необходимые для функционирования в качестве сенсора FRET.

Иммобилизация функциональных рекомбинантных белков в biosilica диатомовых водорослей посредством in vivo биосборок теперь продемонстрирована для GFP и HabB [10]; β-глюкуронидаза, глюкозооксидаза, галактозоксидаза и пероксидаза хрена [12]; и CRY (наше текущее исследование).Их точная локализация и плотность в биокремнеземе, которые представляют интерес с прикладной точки зрения, связанной с характеристиками гибридных кремнеземных материалов, еще не сообщены. Судя по наблюдениям, опубликованным на сегодняшний день, они, вероятно, будут связаны с внешней и внутренней поверхностями биокремнезема и / или внутри пор биокремнезема. Минимальные радиусы для этих белков, оцененные по молекулярной массе от 16900 до 272000, варьируются от 1,69 до 4,27 нм [24] и соответствуют требованиям к видимому размеру для включения в поры Тл.pseudonana (средний диаметр пор клапана 18,2 нм [25]). Таким образом, за исключением других факторов, несколько молекул CRY (расчетная молекулярная масса 87 600 и минимальный радиус 2,79 нм) могут быть размещены в архитектуре единой пористой структуры. T. pseudonana с диаметром створки от 3 до 4 мкм [25] — относительно небольшая диатомовая водоросль. Родственные виды Thalassiosira , такие как T. eccentrica , T. punctigera и T. weissflogii , крупнее и имеют значительно большие размеры пор [26], [27].Более того, пористость панциря T. eccentrica на уровне 37% значительна [26]. Эти виды, по-видимому, обладают потенциалом для размещения большего количества иммобилизованного белка и могут быть кандидатами для генетических манипуляций для биотехнологических применений с использованием подходов, разработанных для T. pseudonana .

В связи с достижениями, достигнутыми в настоящее время в технологиях инженерии и генетики диатомовых водорослей, функции диатомей, такие как катализ, хелатирование и биочувствительность, становятся потенциальными приложениями, если желаемые функции могут быть закодированы в виде белков.Иммобилизация белков в поддерживающих матрицах из мезопористого диоксида кремния выгодна для широкого круга применений в медицинской диагностике и терапии, биочувствительности, катализе и взаимодействии / ингибировании субстрата. Лучшее понимание принципов конструкции, лежащих в основе сборки клеточных стенок биокремнезема диатомовыми водорослями, должно способствовать будущей биосборке in vivo генетически модифицированных структур биокремнезема в трансформированных диатомовых водорослях [10], [11] и информировать о биологически-вдохновленной химической сборке. белковых структур с иммобилизованным кремнеземом in vitro [3], [4], [28] — [30].

Материалы и методы

Создание конструкции экспрессии бактерий и диатомовых водорослей

Стандартные методы клонирования использовали для вставки в рамку генов CyPet, периплазматического рибозосвязывающего белка (RBP) и YPet в сайт множественного клонирования, кодируемый в векторе бактериальной экспрессии pRSET . CyPet и YPet составляют пару FRET флуоресцентного белка [16]. Вектор pRSET содержит промотор T7 , управляющий экспрессией CRY .Вектор pRSET разработан для кодирования двух N-концевых меток, полигистидиновой (His 6 ) метки для очистки на Ni-колонке и эпитопа Xpress ™ для обнаружения с помощью антитела Anti-Express ™ и сайта расщепления энтерокиназой выше стартового сайта для CRY. Мы включили дополнительную метку His 6 на С-конце YPet для увеличения сродства к никелю. Флуоресцентные белки были присоединены к RBP посредством вставки полилинкерной последовательности, кодирующей Gly-Gly-Ser.После проверки последовательности экспрессионная последовательность CyPet-RBP-YPet (CRY) была вставлена ​​ниже кДНК, кодирующей Silaffin 3 (Sil3) , выделенной с помощью ОТ-ПЦР из диатомовых водорослей T. pseudonana (штамм CCMP 1335, Национальный центр морских водорослей и микробиоты Провасоли-Гийярда, Вест-Бут-Харбор, Массачусетс). Это привело к созданию двух конструкций для бактериальной экспрессии: pRSET: CRY и pRSET: Sil3-CRY . Сообщается, что конформационные изменения, связанные со связыванием рибозы с RBP, приводят к увеличению пространственного разделения пары FRET флуоресцентного белка и снижению FRET [13].

Геномная последовательность Sil3 была использована в векторе экспрессии диатомей pTpfcp / Sil3nt , нацеленного на биосиликат [10]. Для создания единой системы трансформации вектора для экспрессии CRY , нацеленной на клеточную стенку биокремнезема у диатомовых водорослей, последовательность CRY клонировали в pTpfcp / Sil3nt между геномными последовательностями терминатора Sil3 и fcp . Ген отбора антибиотиков nat был вставлен ниже второго промотора fcp , придающего антибиотикорезистентность нурсеотрицину, в результате чего был получен вектор экспрессии диатомовых водорослей pTpfcp / Sil3-CRY: fcp / nat .

Векторы CyPet и YPet были предоставлены Патриком Догерти, Калифорнийский университет, Санта-Барбара; последовательность RBP была клонирована из FLIPrbs-F15A , предоставленной Wolff Frommer, Научный институт Карнеги, Стэнфордский университет; и pTpfcp / Sil3nt и pTpfcp / nat были предоставлены Николь Поулсен и Нильсом Крегером, Технологический институт Джорджии.

Экспрессия и выделение

E.coli -экспрессированные рекомбинантные белки

TurboCells BL21 (DE3), компетентный E. coli (Genlantis, Inc., Сан-Диего, Калифорния), трансформированный бактериальными экспрессирующими конструкциями, выращивали в течение ночи при 37 ° C. OD Измерения 600 проводили и культуры снова разбавляли до OD 600 0,5. Клетки выращивали при 37 ° C до достижения OD 600 1,0. Затем экспрессию белка индуцировали добавлением IPTG (изопропил B-D-тиогалактозид) в концентрации 100 мкМ; культуры переносили до 26 ° C и выращивали в течение ночи в темноте.Экспрессированный белок выделяли с помощью Ni-аффинной хроматографии (смола His-Bind, Novagen, Inc.). Клетки лизировали ультразвуком, центрифугировали и лизат стерилизовали фильтрованием перед нанесением на колонку. Колонки, связанные с белками, промывали возрастающими концентрациями имидазола в диапазоне от 5 мМ до 500 мМ. Селективные промывки объединяли и концентрировали в системе фильтрации Amicon 50 кДа (EMD MilliPore). Очистку белка контролировали с помощью SDS-PAGE с использованием 10% полиакриламидного геля (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

Масс-спектрометрия

E. coli -экспрессируемого рекомбинантного белка

образцов белка CRY, выделенных, как описано выше, заменяли буфером на 200 мМ бикарбоната аммония, отдельно расщепляли протеазами глюкозы и трипсина и анализировали с помощью ЖХ-МС / МС с высоким разрешением на платформах LTQ Velos Orbitrap (Thermo Scientific, Waltham, MA). Первоначальная идентификация пептидов была произведена с помощью SEQUEST с использованием базы данных E. coli , содержащей последовательность белка CRY.Точечная мутация лейцина в метионин, L341M, была идентифицирована с использованием собственных инструментов секвенирования de novo [31], а также может быть идентифицирована с помощью SEQUEST при использовании последовательности CRY, включая точечную мутацию. Другие пептидные последовательности, идентифицированные с помощью SEQUEST, также были проверены с помощью собственных инструментов секвенирования de novo .

In vitro Анализ FRET в E. coli -экспрессируемых рекомбинантных белков

Кривые титрования субстрата для очищенных рекомбинантных белков были получены на спектрофлуориметре Synergy-HT с длиной волны возбуждения, установленной на 430 нм (возбуждение CyPet), и эмиссией, установленной на 485 нм (эмиссия CyPet) и 530 нм (эмиссия YPet).Выделенные образцы белка разбавляли 20 мМ натрий-фосфатным буфером, pH 7,0, и определяли FRET как соотношение интенсивностей эмиссии 530/485 нм.

Константу диссоциации ( K d ) для каждого белка определяли путем построения графика зависимости насыщения (S) от концентрации [s] рибозы в диапазоне от 1 мкМ до 10 мМ, используя метод, модифицированный из Lager et al [13] . Насыщение рассчитывали как где r — отношение флуоресценции 530/485 нм для данной концентрации рибозы, r min — отношение 530/485 при насыщении, а r max — отношение 530/485 без добавления рибозы.Увеличение S соответствует снижению эффективности FRET. K d каждого рецептора оценивали по следующей зависимости: где n — количество сайтов связывания, а [s] — концентрация рибозы.

Статистические данные были выполнены с использованием программного обеспечения Prism v4 GraphPad, 2003. Наборы данных сравнивались друг с другом и опубликованные значения с использованием нелинейной регрессии с количеством сайтов связывания, ограниченным до n = 1. F-тест использовался для проверки общего K d параметр для CRY и Sil3-CRY. K d каждого из них также тестировали в сравнении с ECFP-RBP-EYFP, закодированным с помощью FLIPrbs-F15A [13].

Культура и трансформация диатомовых водорослей. T. pseudonana (штамм CCMP 1335) выращивали в среде f / 2 (Национальный центр морских водорослей и микробиоты Provasoli-Guillard, Вест-Бут-Харбор, Массачусетс), снабжаемой аэрацией и постоянным освещением при 18–20 ° C. Регулярное барботирование культур CO 2 поддерживало pH между 8 и 8,5, а в культуры еженедельно добавляли 100 мкг / мл пенициллина и стрептомицина.

Трансформацию диатомовых водорослей бомбардировкой микрочастицами с использованием системы доставки частиц PDS-1000 / He (Bio-Rad, Hercules, CA) проводили, как описано ранее [11]. Клетки, устойчивые к норсеотрицину, использовали для анализа локализации флуоресценции и ответа FRET.

Анализ экспрессии гена

Выделение геномной ДНК из T. pseudonana выполняли с использованием модифицированной версии протокола Genomic DNA Isolation Kit (Promega, Madison, WI). Приблизительно 2 × 10 8 клеток диатомей собирали центрифугированием и ресуспендировали в 600 мкл раствора для лизиса ядер. Клетки лизировали взбиванием шариками с последующей инкубацией при 65 ° C в течение 15 мин. Клетки обрабатывали РНКазой А, и белок осаждали с использованием раствора для осаждения белка. ДНК выделяли осаждением изопропанолом с последующей экстракцией фенол-хлороформом для удаления остаточных белков. Образцы ДНК ресуспендировали в ТЕ. Успех трансформации определяли с помощью ПЦР для вставок CRY и nat с последующим электрофорезом в агарозном геле.

Экстракцию

тотальной РНК из T. pseudonana проводили с использованием модифицированной версии набора RNeasy Plant Kit (QIAGEN, Valencia, CA). Образцы лизировали в буфере RLT путем взбивания шариков в течение 3 мин с последующим осаждением этанолом и очисткой колонки в соответствии с протоколом производителя. RT-PCR с использованием праймеров oligo dT (Invitrogen, Carlsbad, CA) выполняли в соответствии с протоколом производителя для обратной транскриптазы SSIII (Invitrogen, Carlsbad, CA) с использованием 1 мкг РНК. Анализ экспрессии генов определяли с помощью ПЦР и электрофореза в агарозном геле.

Изоляция створок

Створки были выделены с использованием процедуры, описанной Poulsen et al. 2007 [10], модифицированный для достижения удовлетворительного анализа FRET. Детергенты и ЭДТА не добавляли в буфер. Клетки обрабатывали ультразвуком, используя пять последовательных импульсов по 30 секунд (звуковой дисмембратор Fisher Scientific, модель 500, амплитуда 10%), и позволяли осесть в микроцентрифуге, вращающейся только со скоростью 0,8 об / мин. Собранные таким образом створки затем визуализировали и анализировали на FRET, как описано ниже для живых клеток.

Флуоресцентная визуализация с локализацией

Клеточную флуоресценцию регистрировали с помощью проточного цитометра высокого разрешения ImageStream X ® (Amnis, Co., Сиэтл, Вашингтон). Приблизительно 10 000 образцов клеток были возбуждены с использованием лазера с длиной волны 405 нм, и было получено по пять изображений на ячейку в каналах голубого, желтого, красного, светлого поля и бокового рассеяния. В лазерную линию вставляли фильтр 66SP, чтобы минимизировать аутофлуоресценцию хлоропластов. Голубые и желтые флуоресцентные изображения были компенсированы проступанием красной флуоресценции.После захвата изображения проточной цитометрии образцы были заблокированы для получения популяций захваченных изображений отдельных клеток, которые были в фокусе и отображали стереотипную красную автофлуоресценцию, указывающую на живые клетки. Яркость и контраст интенсивностей голубой и желтой флуоресценции были отрегулированы одинаково для каждого канала в образцах TR и WT.

Флуоресценцию, локализованную в биокреме

, получали на инвертированном световом микроскопе DM IRB (Leica, Inc.) с использованием камеры SPOT и программного обеспечения для анализа изображений (SPOT, Inc.)). Живые клетки и клеточные стенки биокремнезема, собранные из клеточных культур, визуализировали на наличие голубой и красной флуоресценции. Соответственно были отрегулированы яркость и контраст.

Визуализация и анализ FRET

Клетки исследовали с использованием инвертированного светового микроскопа DM IRB (Leica, Inc. ), и изображения получали с помощью камеры Photometrics CoolSNAP EZ, присоединенной к разделителю изображений DV2 с голубыми и желтыми эмиссионными фильтрами. Изображения клеток подвергали последующей обработке путем псевдоокрашивания каждого изображения соответствующим образом с помощью программного обеспечения MetaMorph® и перекрытия изображений для локализации белков с помощью программного обеспечения Photoshop (Adobe, Inc.). Яркость и контрастность были отрегулированы одинаково для каждого изображения.

Для анализа FRET клетки или створки были иммобилизованы на покрытых коллагеном чашках Петри диаметром 35 мм (MatTek, Ashland, MA), фотообесцвечены в течение пяти минут при 430 нм, чтобы свести к минимуму просачивание красной автофлуоресценции хлоропластов в CyPet. и каналы YPet, затем возбуждаемые на длине волны 430 нм импульсами с интервалом в одну минуту до 40 мин. Изображения для эмиссионных спектров 485 нм и 530 нм обрабатывали с использованием программного обеспечения MetaMorph®. FRET измеряли как отношение RFU при 530 нм и 485 нм с поправкой на фоновую флуоресценцию каждой длины волны в нейтральном месте на планшете. FRET вычислялся на попиксельной основе, а кривые FRET строились путем построения графика отношения 530/485 нм как функции времени.

Для построения кривой «концентрация-ответ» для диатомовых водорослей, подвергшихся действию рибозы, ΔF сначала нормализовали до ΔF max , после корректировки каждого значения на ΔF min , чтобы получить ΔF n :

ЕС 50 для клеточного FRET (концентрация, при которой наблюдается 50% от максимального ΔF n ) определяли путем построения графика зависимости ΔF n от концентрации рибозы [s]:

Благодарности

Николь Поулсен и Нильс Крегер, Технологический институт Джорджии, дали рекомендации по системе трансформации диатомовых водорослей.Бен Альдерете, Amnis Corporation, Сиэтл, Вашингтон, организовал доступ к проточному цитометру ImageStream X ® для визуализации, а д-р Брайан Холл оказал неоценимую поддержку в работе с прибором и анализе данных. Техническую поддержку оказали Елена Билявская, Ханна Миллер и Карли Фэрбенкс, стажеры программы студенческих исследовательских стажировок Министерства энергетики США. Никола Толич и Сэм Пурвин оказали поддержку в обработке данных MS. Доктор Валери Куллинан поддержала статистический анализ.Часть исследований была проведена в Лаборатории молекулярных наук об окружающей среде W. R. Wiley, национальном научном учреждении, спонсируемом Управлением биологических и экологических исследований Министерства энергетики и находящемся в Тихоокеанской северо-западной национальной лаборатории (PNNL).

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: KEM GR. Проведены эксперименты: KEM EWR SMH. Проанализированы данные: KEM EWR SMH LPT GR. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: KEM EWR LPT GR.Написал статью: КЕМ ГР. Рецензировано и отредактировано рукопись: EWR LPT.

Список литературы

  1. 1. Чен Дж., Думамидис Х., Лайонс К. , Мердей Дж., Роко М.С. (2007) Производство в наномасштабе. Отчет семинара Национальной инициативы в области нанотехнологий.
  2. 2. Гордон Р., Паркинсон Дж. (2005) Возможные роли диатомов в нанотехнологиях. Журнал нанонауки и нанотехнологий 5: 35–40.
  3. 3. Чанг Ч., Ван В., Гуцу Т., Гейл Д. К., Цзяо Дж. И др.(2009) Самосборка наноструктурированных диатомовых микрооболочек в узорчатые массивы с помощью многослойного осаждения полиэлектролита и струйной печати. Журнал Американского химического общества 131: 4178.
  4. 4. Кент М.С., Муртон Дж. К., Сатия С., Кузьменко И., Симмонс Б. А. (2009) Образование нанокремнезема на липидных мембранах, индуцированное силлафиновыми пептидами. Отношения структура-свойство в биоминерализованных и биомиметических композитах 1187: 95–100.
  5. 5. Kröger N, Deutzmann R, Sumper M (1999) Поликатионные пептиды из биокремнезема диатомовых водорослей, которые направляют формирование наносферы кремнезема. Наука 286: 1129–1132.
  6. 6. Крегер Н., Сандхаге К.Х. (2010) От биомолекул диатомовых водорослей до биоинспирированного синтеза материалов на основе диоксида кремния и диоксида титана. Миссис Бюллетень 35: 122–126.
  7. 7. Sandhage KH, Bao ZH, Weatherspoon MR, Shian S, Cai Y и др. (2007) Химическое восстановление трехмерных микросборок диоксида кремния в копии микропористого кремния. Природа 446: 172–175.
  8. 8. Rorrer GL, Jeffryes C, Gutu T, Jiao J (2008) Метаболическая вставка наноструктурированного TiO 2 в узорчатую биокремнезем диатомовых Pinnularia sp с помощью двухэтапного процесса культивирования в биореакторе.Acs Nano 2: 2103–2112.
  9. 9. Rorrer GL, Jeffryes C, Gutu T, Jiao J (2008) Двухэтапный фотобиореакторный процесс для метаболического внедрения наноструктурированного германия в микроструктуру кремнезема диатомовых водорослей Pinnularia sp. Материаловедение и инженерия С-биомиметические и супрамолекулярные системы 28: 107–118.
  10. 10. Поульсен Н., Берн С., Испания Дж., Крегер Н. (2007) Иммобилизация фермента кремнеземом посредством генной инженерии диатомовых водорослей Thalassiosira pseudonana .Angewandte Chemie-International Edition 46: 1843–1846.
  11. 11. Poulsen N, Chesley PM, Kröger N (2006) Молекулярно-генетическая манипуляция диатомовой Thalassiosira pseudonana (Bacillariophyceae). Journal of Phycology 42: 1059–1065.
  12. 12. Шеппард В., Шеффель А., Поулсен Н., Крегер Н. (2012) Иммобилизация мультимерных и окислительно-восстановительных ферментов живым диатомовым кремнеземом. Appl Environ Microbiol 78: 211–218.
  13. 13. Lager I, Fehr M, Frommer WB, Lalonde SW (2003) Разработка флуоресцентного наносенсора для рибозы.Febs Letters 553: 85–89.
  14. 14. Кэмпбелл Р. Э., Карлсон Х. Дж. (2009) Биосенсоры на основе генетически закодированных FRET для многопараметрической флуоресцентной визуализации. Текущее мнение в области биотехнологии 20: 19–27.
  15. 15. Ньюман Р. Х., Фосбринк, доктор медицины, Чжан Дж. (2011) Генетически кодируемые флуоресцентные биосенсоры для отслеживания динамики сигналов в живых клетках. Химические обзоры 111: 3614–3666.
  16. 16. Нгуен А.В., Догерти П.С. (2005) Эволюционная оптимизация флуоресцентных белков для внутриклеточного FRET.Природная биотехнология 23: 355–360.
  17. 17. Mowbray SL, Cole LB (1992) Рентгеновская структура периплазматического рибозного рецептора на 1,7 Ангстрема из Escherichia coli . Журнал молекулярной биологии 225: 155–175.
  18. 18. Патвардхан С.В. (2011) Биомиметический и биоинспирированный диоксид кремния: последние разработки и применения. Химические коммуникации 47: 7567–7582.
  19. 19. Крегер Н., Поульсен Н. (2008) Диатомовые водоросли — от биогенеза клеточной стенки до нанотехнологий.Ежегодный обзор генетики 42: 83–107.
  20. 20. Luckarift HR, Johnson GR, Испания JC (2006) Ферментные реакторы с иммобилизованным кремнеземом; применение в исследованиях ингибирования холинэстеразы. Журнал хроматографии B-аналитические технологии в биомедицине и науках о жизни 843: 310–316.
  21. 21. Naik RR, Tomczak MM, Luckarift HR, Spain JC, Stone MO (2004) Улавливание ферментов и наночастиц с использованием биомиметически синтезированного диоксида кремния. Химические коммуникации 1684–1685.
  22. 22. Винеке Р., Бернекер А., Ридель Р., Сампер М., Стейнем С. и др. (2011) Осаждение кремнезема синтетическими силффиновыми пептидами. Органическая и биомолекулярная химия 9: 5482–5486.
  23. 23. Шеффель А., Поульсен Н., Шиан С., Крегер Н. (2011) Микрокольца с нанопаттернами из диатомовых водорослей, которые управляют морфогенезом кремнезема. Слушания Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 108: 3175–3180.
  24. 24. Эриксон HP (2009) Размер и форма белковых молекул на нанометровом уровне, определяемом с помощью седиментации, гель-фильтрации и электронной микроскопии.Биологические процедуры онлайн 32–51.
  25. 25. Hildebrand M, York E, Kelz JI, Davis AK, Frigeri LG и др. (2006) Наноразмерный контроль морфологии и трехмерной структуры кремнезема во время формирования клеточной стенки диатомовых водорослей. Журнал материаловедения 21: 2689–2698.
  26. 26. Losic D, Rosengarten G, Mitchell JG, Voelcker NH (2006) Архитектура пор диатомовых панцирей: потенциальные наноструктурированные мембраны для разделения молекул и частиц. Журнал нанонауки и нанотехнологий 6: 982–989.
  27. 27. Врилинг EG, Beelen TPM, van Santen RA, Gieskes WWC (2000) Наноразмерная однородность архитектуры пор в диатомовом кремнеземе: комбинированное исследование малоуглового и широкоугольного рассеяния рентгеновских лучей. Journal of Phycology 36: 146–159.
  28. 28. Li L, Jiang ZY, Wu H, Feng YN, Li J (2009) Биокремнезем, индуцированный протамином, как эффективный носитель для иммобилизации ферментов с высокой загрузкой и улучшенной стабильностью. Материаловедение и инженерия C-Материалы для биологических приложений 29: 2029–2035.
  29. 29. Марнер В.Д., Шейх А.С., Мюллер С.Дж., Кислинг Д.Д. (2009) Иммобилизация ферментов через аутоинкапсуляцию с помощью силлафина в подложке из биокремнезема. Прогресс биотехнологии 25: 417–423.
  30. 30. Spain JC, Luckarift HR, Naik RR, Stone MO (2004) Иммобилизация ферментов в биомиметической подложке из диоксида кремния. Природная биотехнология 22: 211–213.
  31. 31. Шен Ю.Ф., Толик Н., Хиксон К.К., Пурвин С.О., Андерсон Г.А. и др. (2008) De novo секвенирование уникальных последовательностей тегов для обнаружения посттрансляционных модификаций белков.Аналитическая химия 80: 7742–7754.

Преобразовательный нанозонд на основе FRET в сборе с электрохромным хромофором для чувствительного обнаружения сероводорода in vitro и in vivo

Сероводород (H 2 S) как важная газообразная сигнальная молекула тесно связана с многочисленными биологическими процессами в живых системах. Для дальнейшего изучения физиологической и патологической роли H 2 S по-прежнему актуальны удобные и эффективные методы обнаружения эндогенного H 2 S in vivo .В этом исследовании электрохромный хромофор, дикатионный 1,1,4,4-тетраарилбутадиен (EM1), был новаторски введен в наночастицы с повышающим преобразованием (UCNPs), а нанозонд, PAAO – UCNPs – EM1, был сконструирован для обнаружения H 2 S. Эта наносистема состоит из наночастиц с повышающим преобразованием ядро-оболочка (NaYF 4 : Yb, Tm @ NaYF 4 : Yb, Er), EM1 и полиакриловой кислоты (PAA) -октиламин. EM1 с сильным поглощением в диапазоне от 500 до 850 нм может служить акцептором энергии для подавления апконверсионной люминесценции UCNP посредством процесса резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET).В присутствии H 2 S, EM1 в нанозонде был восстановлен до бесцветного диена (EM2), что привело к линейному усилению излучения люминесценции при 660 нм и 800 нм при возбуждении светом 980 нм, поскольку FRET был выключен. Нанозонд PAAO – UCNPs – EM1PAAO – UCNPs – EM1 продемонстрировал быстрый отклик и высокую чувствительность к H 2 S с LoD 1,21 × 10 −7 M. Более того, он был успешно использован для обнаружения эндогенных и экзогенный H 2 S в живых клетках с высокой селективностью и низкой цитотоксичностью.Кроме того, этот нанозонд может различать нормальные и опухолевые клетки путем преобразования люминесцентного изображения эндогенного H 2 S. Кроме того, нанозонд может значительно контролировать H 2 S в модели голой мыши с опухолью. Таким образом, мы ожидаем, что этот новый нанозонд, собранный с электрохромным хромофором для ответа на H 2 S и для биоизображения этой молекулы, будет иметь многообещающие перспективы в биологических и клинических исследованиях.

Стехиометрия и сеть регуляции комплексов семейства Bcl-2, количественно определенная с помощью анализа FRET живых клеток

  • 2.

    Garcia-Saez AJ (2012) Секреты семейства Bcl-2. Разница в клеточной смерти 19: 1733–1740

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 3.

    Pena-Blanco A, Garcia-Saez AJ (2018) Bax, Bak и не только — митохондриальные характеристики при апоптозе. FEBS J 285: 416–431

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 4.

    Ku B, Liang C, Jung JU, Oh B-H (2011) Доказательства того, что ингибирование активации BAX с помощью BCL-2 связано с его тесным и предпочтительным взаимодействием с доменом Bh4 BAX. Cell Res 21: 627–641

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 5.

    Cartron PF, Gallenne T, Bougras G, Gautier F, Manero F, Vusio P, Meflah K, Vallette FM, Juin P (2004) Первая альфа-спираль Bax играет необходимую роль в индуцированной лигандом активации Bh4- только белки БИД и ПУМА. Mol Cell 16: 807–818

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 6.

    Billen LP, Shamas-Din A, Andrews DW (2008) Заявка: Bax-подобный белок Bh4. Онкоген 27: S93 – S104

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 8.

    Чипук Дж. Э., Молдовяну Т., Лламби Ф., Парсонс М. Дж., Грин Д. Р. (2010) Воссоединение семьи BCL-2. Mol Cell 37: 299–310

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 9.

    Yan J, Zhang H, Xiang J, Zhao Y, Yuan X, Sun B, Lin A (2018) Белок Bh4-only BAD опосредует цитотоксичность TNFα, несмотря на одновременную активацию IKK и NF-κB при септическом шоке. Cell Res 28: 701–718

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 10.

    Hsu YT, Wolter KG, Youle RJ (1997) Перераспределение Bax и Bcl-X (L) от цитозоля к мембране во время апоптоза. Proc Natl Acad Sci USA 94: 3668–3672

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 11.

    Hausmann G, O’Reilly LA, van Driel R, Beaumont JC, Strasser A, Adams JM, Huang DC (2000) Проапоптотический фактор активации протеазы апоптоза 1 (Apaf-1) имеет цитоплазматическую локализацию, отличную от Bcl-2 или Bcl-x (L). J Cell Biol 149: 623–634

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 13.

    Bleicken S, Hantusch A, Das KK, Frickey T, Garcia-Saez AJ (2017) Количественный интерактом мембранной сети Bcl-2 идентифицирует иерархию комплексов для регуляции апоптоза. Нац Коммуна 8:73

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 14.

    Edlich F, Banerjee S, Suzuki M, Cleland MM, Arnoult D, Wang C, Neutzner A, Tjandra N, Youle RJ (2011) Bcl-x (L) ретротранслирует Bax из митохондрий в цитозоль. Ячейка 145: 104–116

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 15.

    Schellenberg B, Wang P, Keeble JA, Rodriguez-Enriquez R, Walker S, Owens TW, Foster F, Tanianis-Hughes J, Brennan K, Streuli CH, Gilmore AP (2013) Бакс существует в динамическом равновесие между цитозолем и митохондриями для контроля апоптотического прайминга.Mol Cell 49: 959–971

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 16.

    Aranovich A, Liu Q, Collins T, Geng F, Dixit S, Leber B, Andrews DW (2012) Различия в механизмах связывания проапоптотических белков Bh4 с Bcl-XL и Bcl-2 количественно определены в Live MCF -7 ячеек. Mol Cell 45: 754–763

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 18.

    Li HL, Zhu H, Xu CJ, Yuan JY (1998) Расщепление BID каспазой 8 опосредует повреждение митохондрий в пути Fas апоптоза. Ячейка 94: 491–501

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 19.

    Chou JJ, Li HL, Salvesen GS, Yuan JY, Wagner G (1999) Структура раствора BID, внутриклеточного усилителя апоптотической передачи сигналов. Ячейка 96: 615–624

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 21.

    Lovell JF, Billen LP, Bindner S, Shamas-Din A, Fradin C, Leber B, Andrews DW (2008) Связывание мембраны с помощью tBid инициирует упорядоченную серию событий, кульминацией которых является проницаемость мембраны с помощью Bax. Ячейка 135: 1074–1084

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 22.

    Billen LP, Kokoski CL, Lovell JF, Leber B, Andrews DW (2008) Bcl-XL ингибирует проницаемость мембраны, конкурируя с Bax. PLoS Biol 6: e147

    PubMed PubMed Central Статья CAS Google ученый

  • 24.

    Сельвин П.Р. (1995) Флуоресцентный резонансный перенос энергии. Метод Enzymol 246: 300–334

    CAS Статья Google ученый

  • 25.

    Dussmann H, Rehm M, Concannon CG, Anguissola S, Wurstle M, Kacmar S, Voller P, Huber HJ, Prehn JHM (2010) Одноклеточная количественная оценка активации Bax и математическое моделирование предполагают образование пор при минимальном накоплении Bax в митохондриях. Разница в клеточной смерти 17: 278–290

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 26.

    Placone J, Hristova K (2012) Прямая оценка влияния мутации ахондроплазии Gly380Arg на димеризацию FGFR3 с использованием FRET с количественной визуализацией.PLoS One 7: e46678

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 27.

    Erickson MG, Liang HY, Mori MX, Yue DT (2003) Двухгибридное картирование FRET выявляет функцию и местоположение преассоциации Ca2 + канала L-типа. Нейрон 39: 97–107

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 28.

    Бен-Джонни М., Юэ Д.Н., Юэ Д.Т. (2016) Определение стехиометрии макромолекулярных комплексов в живых клетках с использованием FRET.Nat Commun 7: 13709

    PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 29.

    Valentijn AJ, Metcalfe AD, Kott J, Streuli CH, Gilmore AP (2003) Пространственные и временные изменения в субклеточной локализации Bax во время аноикиса. J Cell Biol 162: 599–612

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 30.

    Бутц Е.С., Бен-Джонни М., Шен М., Ян П.С., Санг Л.Дж., Биль М., Юэ Д.Т., Уол-Шотт С. (2016) Количественная оценка макромолекулярных взаимодействий в живых клетках с использованием двухгибридных анализов FRET.Nat Protoc 11: 2470–2498

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 32.

    Elder AD, Domin A, Schierle GSK, Lindon C, Pines J, Esposito A, Kaminski CF (2009) Количественный протокол для динамических измерений белковых взаимодействий с помощью флуоресцентного излучения, сенсибилизированного с помощью резонансного переноса энергии Форстера.J R Soc Интерфейс 6: S59 – S81

    CAS Статья Google ученый

  • 33.

    Yu HN, Zhang JW, Li HL, Qu JL, Chen TS (2012) Эмпирический метод количественного резонансного переноса энергии флуоресценции для нескольких акцепторов, основанный на частичном фотообесцвечивании акцепторов. Appl Phys Lett 100: 253701

    Статья CAS Google ученый

  • 34.

    Эриксон М.Г., Алсейхан Б.А., Петерсон Б.З., Юэ Д.Т. (2001) Преассоциация кальмодулина с потенциалозависимыми каналами Ca2 +, выявленными FRET в отдельных живых клетках.Нейрон 31: 973–985

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 35.

    Hoppe A, Christensen K, Swanson JA (2002) Стехиометрия на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии в живых клетках. Biophys J 83: 3652–3664

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 36.

    Zal T, Gascoigne NRJ (2004) Визуализация живых клеток с поправкой на фотообесцвечивание FRET. Biophys J 86: 3923–3939

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 37.

    Чен Х., Пул Х.Л., Кушик С.В., Фогель С.С., Икеда С.Р. (2006) Измерение эффективности FRET и отношения концентрации донора к акцептору в живых клетках. Biophys J 91: L39 – L41

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 38.

    Zhu W, Cowie A, Wasfy GW, Penn LZ, Leber B, Andrews DW (1996) мутанты Bcl-2 с ограниченным субклеточным расположением обнаруживают пространственно различные пути апоптоза в разных типах клеток.EMBO J 15: 4130–4141

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 40.

    Rehm M, Huber HJ, Hellwig CT, Anguissola S, Dussmann H, Prehn JH (2009) Динамика проницаемости внешней митохондриальной мембраны во время апоптоза. Разница в клеточной смерти 16: 613–623

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 41.

    Гринберг М., Сариг Р., Зальцман Ю., Фрумкин Д., Грамматикакис Н., Реувени Е., Гросс А. (2002) tBID гомоолигомеризуется в митохондриальной мембране, вызывая апоптоз.J Biol Chem 277: 12237–12245

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 42.

    Szymczak AL, Workman CJ, Wang Y, Vignali KM, Dilioglou S, Vanin EF, Vignali DAA (2004) Коррекция мультигенного дефицита in vivo с использованием одного ретровируса на основе «саморасщепляющегося» пептида 2A вектор. Nat Biotechnol 22: 589–594

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 43.

    Lopez J, Bessou M, Riley JS, Giampazolias E, Todt F, Rochegue T, Oberst A, Green DR, Edlich F, Ichim G, Tait SWG (2016) Митопрайминг как метод создания зависимости от Bcl-2. Nat Commun 7: 10538

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 44.

    Бхола П.Д., Летай А. (2016) Митохондрии-судьи и исполнители приговоров к смертной казни в камере. Mol Cell 61: 695–704

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 45.

    Letai A, Bassik MC, Walensky L, Sorcinelli MD, Weiler S, Korsmeyer SJ (2002) Отдельные домены Bh4 либо сенсибилизируют, либо активируют митохондриальный апоптоз, служа прототипом лечения рака. Cancer Cell 2: 183–192

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 46.

    Wang K, Yin XM, Chao DT, Milliman CL, Korsmeyer SJ (1996) BID: новый агонист смерти, содержащий только домен Bh4. Джин Дев 10: 2859–2869

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 47.

    Wang Y, Tjandra N (2013) Структурное понимание tBid, Bid, активируемого каспазой-8, и его домена Bh4. J Biol Chem 288: 35840–35851

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 48.

    Лебер Б., Лин Дж. Л., Эндрюс Д. В. (2007) Объединенные вместе: последствия взаимодействия семейства Bcl-2 с мембранами для жизни и смерти. Апоптоз 12: 897–911

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 49.

    Hsu YT, Youle RJ (1998) Bax в тимусе мышей представляет собой растворимый мономерный белок, который проявляет дифференциальные индуцированные детергентом конформации. J Biol Chem 273: 10777–10783

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 50.

    Ding JZ, Mooers BHM, Zhang Z, Kale J, Falcone D, McNichol J, Huang B, Zhang XJC, Xing CG, Andrews DW, Lin JL (2014) После встраивания в мембраны антиапоптотического белка Bcl-XL связывает как область гомологии Bcl-2 3, так и спираль 1 проапоптотического белка Bax, чтобы ингибировать апоптотическую митохондриальную проницаемость.J Biol Chem 289: 11873–11896

    CAS PubMed PubMed Central Статья Google ученый

  • 51.

    Suzuki M, Youle RJ, Tjandra N (2000) Структура Bax: корегуляция образования димеров и внутриклеточная локализация. Ячейка 103: 645–654

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 53.

    Zhang Z, Subramaniam S, Kale J, Liao C, Huang B, Brahmbhatt H, Condon SGF, Lapolla SM, Hays FA, Ding JZ, He F, Zhang XJC, Li JN, Senes A, Andrews DW , Lin JL (2016) Димеризация Bh4 в бороздке инициирует, а димеризация спирали 9 расширяет сборку пор Bax в мембранах. EMBO J 35: 208–236

    CAS PubMed Статья Google ученый

  • 54.

    Puthalakath H, Strasser A (2002) Держать киллеров на привязи: транскрипционный и посттрансляционный контроль проапоптотической активности белков Bh4.

  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *