10 лада машина: Купить LADA (ВАЗ) 2110 с пробегом: продажа автомобилей Лада 2110 б/у

Содержание

10 необычных моделей Lada, которые не пошли в серию :: Autonews

Недавно в сети рассекретили внешность обновленной Lada Niva. Шпионские изображения прототипа нового внедорожника, который стал очень похож на Toyota RAV4, появились в социальных сетях. Сам АвтоВАЗ отказался как-либо комментировать утекшие в фотографии, однако источник Autonews.ru, знакомый с ходом работы над проектом, подтвердил подлинность запечатленной машины. При это он отметил, что это пока еще не окончательно утвержденный вариант внешности, который получит автомобиль. И пока в сети не утихают споры о дизайне новой «Нивы», мы решили вспомнить самые знаковые концепты и прототипы АвтоВАЗа, которые, увы, так и не стали серийными.

Проект Х

Экспериментальные модели ВАЗа всегда отличались невероятными техническими решениями. Чего только стоила роторная «копейка» или полностью электрическая версия универсала 2102. Однако с точки зрения дизайна автомобили отечественного автогиганат мало чем удивляли. Так было до тех пор, пока в середине 1980-х не был создан концепт, загадочно названный буквой «Х».

Малоизвестный проект представлял собой размышления на тему автомобиля 2000 года. В качестве такого вазовцы видели семейный семиместный однообъемник сравнительно компактного размера с аэродинамичным кузовом и оригинальным ветровым стеклом. Причем помимо пятидверного автомобиля к выпуску планировался и укороченный трехдверный вариант. А строить эти машины планировали на базе серийного ВАЗ-2108 с его агрегатами. Был создан лишь один макет в натуральную величину и две модели в масштабе 1:5. Проект был отложен, а к началу 1990-х заводу уже было не до экспериментов. 

Рапан

К концу 1990-х годов, когда положение завода все еще было сложным, но уже не столь катастрофичным, на АвтоВАЗе вновь вернулись к постройке экспериментальных машин и прототипов.

В тот период мода на биодизайн с его округлыми формами уже начала сходить на нет, но вазовский концепт «Рапан» все равно произвел фурор на Парижском автосалоне 1998 года.

Сложносочиненные линии кузова, большая площадь остекления и сдвижные двери по-настоящему удивляли. Внутри у автомобиля был совершенно ровный пол, а кресла поворачивались вокруг оси. Удивлял и руль с фиксированной центральной частью и встроенными приборами. Но главное, что «Рапан» был электрокаром! Агрегаты и батарея были заимствованы у экспериментальной электрической модификации «Оки». Но заводчанам такая проработка не помогла. На тот момент предприятие так и не нашло инвесторов на осуществление смелого проекта. А прототип, созданный в единственном экземпляре, так и остался в музее завода.

Родстер

В период, когда на ВАЗе создавался этот стильный концепт, свет увидели Audi TT первого поколения, Porsche Boxter и еще несколько знаковых спортивных моделей эпохи миллениума. Поэтому неудивительно, что тольяттинский дизайнер Николай Нужный, стажировавшийся в итальянском ателье Sbarro, для нового прототипа Lada выбрал именно кузов родстер. Машина удивляла и тем, что была сделана в эпоху серьезных финансовых проблем автогиганта и будто создавалась наперекор всем невзгодам.

В основу автомобиля легло укороченное шасси «Калины», а двигатель под капотом стоял с увеличенным рабочим объемом — двухлитровый. По словам разработчиков, максимальная скорость достигала 200 км/ч, а первую «сотню» спортивная Lada разменивала за 9 секунд. Родстера был оснащен складной крышей, которая управлялась электроприводом и в сложенном виде не отнимала полезный объем багажника. Несмотря на детальную проработку кузова и салона, машина так и осталась в единственном экземпляре.

Новая классика

ВАЗовская классика стала одним из рекордсменов по длительности конвейерной жизни не только в нашей стране, но и в мире. Однако этот срок мог оказаться не предельным. На АвтоВАЗе вынашивали план продления конвейерной жизнь классического семейства. Именно с этой целью был создан проект ВАЗ-2151, также известный под именем Lada Classic. Машина представлял собой концептуальный универсал на шасси ВАЗ-2105 с более современным и трансформируемым салоном. У автомобиля был громадный 500-литровый багажник и складные задние сиденья, а классическое шасси модернизировали с использованием реечного рулевого механизма, передней подвески МакФерсон и мотора объемом 1,7 л от «Нивы». Позже появилась еще одна вариация на ту же тему — проект седана ВАЗ-2107М с именем Classic-2. Но в обоих случаях дело ограничилось лишь выставочными экземплярами, классическая платформа была признана неперспективной для дальнейшего развития.

Ока-2

Микролитражка «Ока», появившаяся еще в далеком 1987 году, к началу нулевых считалась безнадежной устаревшей и непригодной для дальнейшей модернизации.

Поэтому на АвтоВАЗе всерьез работали над созданием второго поколения автомобиля. Первый прототип новой «Оки» вазовцы представляли еще в конце 1990-х, но тогда дальше сомнительного дизайнерского макета дело не пошло. Вариант 2003 года имел более товарный вид и обладал куда большими шансами попасть на конвейер. Новый хэтчбек с заводским индексом ВАЗ-1121 получился больше оригинальной «Оки» и строился уже на агрегатах «восьмерки» с четырехцилиндровыми моторами и неплохим набором оборудования. Прототипы были очень близки к серийным машинам, но в 2004 г. году после смерти главного идеолога проекта гендиректора ВАЗа Виктора Полякова от производства отказались в пользу семейства «Калина».

Проект С

Проект C был самой важной и долгоиграющей разработкой АвтоВАЗа в начале двухтысячных. В 2005 году после прихода на завод менеджеров из «Ростехнологий» в Тольятти решили создать абсолютно новую платформу для целого семейства автомобилей, включая седан, хэтчбек, универсал, кроссовер и даже спорткар.

Однако первым показали седан «Силуэт» (ВАЗ-2116), который не только шагнул в D-класс, где продукция АвтоВАЗа никогда не выступала ранее, но и продемонстрировал новый дизайнерский стиль марки, саму платформу с иным шасси и двигателями объемом 1,8 л (116 и 122 л.с.), а также новую коробку передач. Впрочем, войти в новый класс с собственной разработкой АвтоВАЗу так и не было суждено. Через несколько лет проект перспективной платформы был окончательно свернут из-за разразившегося экономического кризиса и нового формата партнерства с альянсом Renault-Nissan.

Lada C-concept и C-Cross

Эти два прототипа, по сути, были продолжением проекта С, который так и не стал серийным. И, пожалуй, C-concept был одним из самых ярких концепт-каров, созданных на АвтоВАЗе до прихода Стива Маттина. Спортивная трехдверка, увидевшая свет в 2007 году, по дизайну превзошла даже самых передовых европейский машин этого класса. И это не голословное утверждение, а реакция публики на Женевском автосалоне, где был представлен автомобиль. Машина была построена на новой платформе, созданной в рамках проекта С и получила перспективный 2,0-литровый мотор, сочетающийся с механикой. По расчетам разработчиков разгон до «сотни» должен был укладываться в 8 с, а «максималка» переваливала за 210 км/ч.

Год спустя после дебюта C-concept в Москве представили прототип городского кроссовера Lada C-Cross с индексом ВАЗ-2119, который также базировался на новом шасси и демонстрировал яркий спортивный стиль. Но ни одна из машин в рамках проекта С так и не стала серийной, поскольку работа над платформой была свернута. Впрочем, некоторые наработки проекта С впоследствии были использованы в работе над семейством Lada Vesta.

Слава в соцсетях: новой «Ладе» придумывали имя всем миром («Известия»)

«АвтоВАЗ» подвел итоги конкурса на название новой модели Lada, причем в каждой соцсети выбрали свой вариант. Как теперь назовут новинку и от чего это зависит. Кто придумывал название для «восьмерки» и как расшифровывается «Нива». В особенностях российского нейминга разбирались «Известия».

«АвтоВАЗ» выбрал победителя в каждой соцсети. «ВКонтакте» лучшим признали вариант Onega, в Faceebook – имя Slava, в Instagram – Alta, а в «Одноклассниках» – Lika. Это не первый раз, когда Волжский автозавод идет в народ.

Фиалка, я Сокол!

Имя для ВАЗ-2101 придумывали всем Союзом, читатели журнала «За рулем» прислали 50 тыс. вариантов на конкурс – «Сокол», «Фиалка», «Катюша», «Руслан», «Атаман», «Аргамак» и так далее. Встречались и странные имена – «Директивец», «Новорожец».

Было множество предложений назвать автомобиль «Лада», но в итоге на заводе склонились к варианту «Жигули», предложенным вазовским испытателем Алексеем Черным. И зря не послушали народное мнение – имя оказалось вычурным, а для некоторых зарубежных рынков еще и неблагозвучным.

«Можно себе представить, что получится, если выйдут в свет «Жигули»: «Наш завод приобрел пять «Жигулей»!» Или: «Я собираюсь купить «Жигулю»!» Или: «С невыразимым чувством радости сел я за руль своей «Жигули» (А может быть, «Жигулихи»), – писал возмущенный читатель журнала «За рулем».

В итоге для экспортных рынков ВАЗ-2101 переименовали в нейтральную Lada, а в народе машину прозвали «Единичкой», а позже «Копейкой».

Спутник, который не взлетел

Имя для первого переднеприводного автомобиля ВАЗ-2108 утвердил сам главный конструктор «АвтоВАЗа» Георгий Мирзоев.

«Дизайнеры дали на конструкторскую разработку графику с названием «Спутник». Мы разработали чертеж орнамента двери задка, принес я его на подпись к Мирзоеву и говорю ему: «Георгий Константинович, ведь название «Спутник» еще не утверждено». На что последовал ответ: «Пусть привыкают». И чертеж был подписан», – вспоминал конструктор Георгий Троицкий (цитируется по книге «Высокой мысли пламень»).

Современный на тот момент автомобиль, разработанный совместно с Porsche, вполне заслуживал такого названия.

«Для нашей страны это такой же повод для гордости, как первый спутник», – пишет Владимир Мельников из «Авторевю».

Однако имя «Спутник» не прижилось и в народе машину прозвали «восьмеркой» или «зубилом» – за странный «клюв» на решетке радиатора. Следующая модель – пятидверный хетчбэк-2109 получила новое название «Самара», которое затем распространили на всё семейство машин. Впрочем, параллельно машины продолжали неофициально именовать по индексу модели – «восьмеркой», «девяткой», а седан – «девяносто девятой».

В итоге следующее поколение вазовских машин осталось без дополнительного имени и называлось просто «десятым» семейством по индексу головной модели – седана 2110.

Нива и крокодил

Прототип внедорожника будущей «Нивы» испытатели прозвали «Крокодилом Геной» – за приземистый кузов зеленого цвета. Тем более что на заводе проходил испытания другой прототип «Чебурашка» – переднеприводная микролитражка.

Название «Нива» вообще появилось как аббревиатура из первых букв имен детей конструкторов Петра Прусова и Владимира Соловьева – Наташа, Ирина, Вадим, Андрей. Вазовцам даже пришлось обращаться за разрешением на завод «Ростсельмаш», который уже выпускал под именем «Нива» комбайн, но хлопоты того стоили. Название отлично подходило легковому внедорожнику и намекало на сельские просторы, основной регион его обитания. И оказалось очень успешным – «Нива» была единственной моделью Волжского автозавода, которую не именовали по индексу.

Концерн General Motors, заключая с «АвтоВАЗом» соглашение о совместном производстве внедорожника, приобрел и права на бренд «Нива». Таким образом, новая модель называлась Chevrolet Niva, а старую переименовали в Lada 4×4. Только в прошлом году «АвтоВАЗу» с выкупом американской доли в совместном предприятии удалось вернуть права на ставший легендарным бренд.

Надежда умирает первой

А вот минивэн «Надежда» –полноприводный однообъемник на базе «Нивы», в буквальном смысле не оправдал надежд. Силуэт машины стал развитием футуристических концептов ВАЗа, прозванных «бананами». Концепция полноприводного минивэна вообще была необычной для 1990-х, однако подвело исполнение.

Автомобиль готовили в крайней спешке и вместо первоначально задуманных узких фар наградили его четырьмя круглыми. За пучеглазость машину прозвали в народе «Надежда Константиновка», но рестайлинг ничего не изменил. Качество сборки хромало и перевешивало все связанные с практичностью машины плюсы. Кроме того, себестоимость минивэна оказалась очень высокой и в 2006-м ВАЗ свернул его производство, выпустив чуть больше 8 тыс. штук.

Изменить приоритет

 

В конце 2003 года все автомобили Волжского завода были переименованы из «ВАЗов» в «Лады». Появилось и новое имя – «Калина». Его придумал дизайнер машины Евгений Лобанов. Название звучало несколько наивно, но сочеталось с мягкими линиями кузова. С этого момента «АвтоВАЗ» снова почувствовал вкус к неймингу и поручил агентству BBDO Instinct придумать имя для рестайлинговой «десятки».

«Мало кто знает, что в 250 отобранных наименований для составления шорт-листа изначально не входило имя Priora. Но там был вариант Prioritet. Мне он показался неплохим, но длинноватым для написания на крышке багажника. Да и в сочетании с Lada Proiritet выглядел немного несбалансированным. Поэтому при составлении своего варианта шорт-листа я изменил Prioritet на Priora и направил коллегам из BBDO с соответствующими комментариями, – вспоминает бывший начальник управления по маркетингу «АвтоВАЗа» Александр Бредихин. Он отстоял свой вариант и Priora неожиданно для всех победила в фокус-группах.

 «Приора» создала стандарт для успешного имени «Лады» – слово с латинскими корнями из двух трех слогов и с окончанием на букву «а». Исключение из правил – модели, созданные на платформах Renault-Nissan, Xray и Largus.

Кроме того, название Priora без разночтений писалось латинским шрифтом, на который в к тому времени перешел ВАЗ.

Гранта, Веста и…

Неудивительно, что в очередном конкурсе «Народной машине – народное название» победил вариант Granta, предложенный Павлом Захаровым из Красноярска. Имя Vesta, за которое проголосовали несколько сотен участников конкурса, агентство BrandLab позже использует для следующей модели «АвтоВАЗа».

Как назовут новую модель Lada – «Слава», «Альта», «Лика» или «Онега». В пресс-службе «АвтоВАЗа» рассказали «Известиям», что передадут шорт-лист новых продуктовой группе, но будут ли они использоваться или нет, пока неизвестно.Кроме того, в мае российский автопроизводитель зарегистрировал в базе «Роспатента» три новых названия для своих моделей – Tensa, Forta и Kayna.

Может не понравится «Опелю»

Из выбранных в соцсетях имен разве что «Слава» вызовет вопросы, считает главный редактор «За рулем» Максим Кадаков. И действительно, непонятно, какая слава закрепится за новой моделью.

«Очень неплохо в таких случаях подходят географические названия. У людей меньше возможностей их коверкать. Например, Волга, Ока. Лада может быть «Онегой», – сказал Кадаков. По его словам, сейчас для названий автомобилей хорошо подходят и придуманные слова.

«Любое название нужно прокачивать через международные базы. Были случаи, когда что-то пришлось менять. Самый классический – с моделью Ижевского автозавода ИЖ «Орбита», который пришлось переименовывать в «Оду», потому что имя оказалось занятым, – рассказал «Известиям» автоэксперт Игорь Моржаретто.

Иногда проблемы случаются даже с отдаленно похожими названиями, как это было, например, с брендом Aurus. Так что имя Onega может не понравиться «Опелю», у которого есть в запасе Omega, а Alta – Suzuki с его Alto.

Максим Кадаков вспомнил недавнюю историю, когда Chery не дали зарегистрировать в России бренд Exeed, так как у Kia уже была модель Xceed. Пришлось писать название новой марки слитно: CheryExeed. Так что выбор имени для новой «Лады» теперь в руках юристов и маркетологов, считает Кадаков.

НУ И «ЛАДА». 10 самых удивительных машин «АвтоВАЗа», которые не пошли в тираж | Другой город

28 сентября в России отмечается день машиностроителя. Самые близкие и понятные для нас машиностроители работают на «АвтоВАЗе». По случаю праздника «Другой город» расскажет об их самых смелых фантазиях.

Текст: Андрей Кочетков

За почти полвека своего существования на «АвтоВАЗе» было разработано немало прототипов, концепт-каров и просто не дошедших до серийного производства автомобилей.  Некоторые из них сейчас можно увидеть в Техническом музее «АвтоВАЗа» в Тольятти. Часть же теперь существует только на фотографиях. Когда любуешься некоторыми из них, становится жалко, что они не пошли в серию. И их не удастся поподробнее рассмотреть где-нибудь в пробке на Московском шоссе. Некоторые модели вызывают умиление. После созерцания части из них хочется забыться в чаде кутежа на Дне. Некоторые идеи были довольно прямолинейно были позаимствованы у зарубежных коллег. Некоторые же были плодами собственной тольяттинской фантазии.Одним словом, эта не самая известная часть разработок «АвтоВАЗа» смотрится столь же противоречиво и неоднозначно, как и модельный ряд, ушедший в серию.

Представителей которого можно встретить на дорогах почти всей планеты. В честь Дня машиностроителя мы отобрали 10 самых любопытных разработок «АвтоВАЗа», которые случайно никогда не попадутся вам на глаза.

ВАЗ-Э1101

Этот милый карлик, Тирион Ланнистер из «Игры престолов» от автопрома появился на свет в конце 1972 года. В эпоху когда «тройка» была последней инновационной разработкой «ВАЗа», пущенной в серию. А производство советской тетралогии мультфильмов про Чебурашку ещё не перевалило за экватор.

Собственно, именем нового на тот момент мультгероя и прозвали альтернативную экспериментальную версию «копейки» на заводе. Компактную переднеприводную машину начали придумывать ещё в 1968 году. Как собственную разработку, являющуюся альтернативой близнецам «Fiat», серийное производство которых длилось на «ВАЗе» ещё четыре десятилетия. «Другая копейка», изготовленная с нуля полукустарными методами, так навсегда и осталась прототипом. Она не смогла конкурировать с фиатовскими разработками и не ушла на конвейер. Например, милый карлик пускал газы в салон.

Тем не менее, именно с «Чебурашки» начался долгий тернистый путь «АвтоВАЗа» по разработке собственных моделей машин, не заимствованных из-за бугра.

ВАЗ-2122 «Река»

Самый известный советский джип «Нива» на данный момент считается в мире чуть ли не главным достижением отечественного автопрома. Недаром вот уже почти три десятилетия он производится и продаётся заводом. Слово «Нива» уже пора считать синонимом «стабильности». И, похоже, отечественный джип ещё спляшет джигу на наших могилах.

Не удивительно, что существует несколько вариаций на тему советского внедорожника. Некоторые из них достаточно экзотические. ВАЗ-2122, получивший прозвище «Река», первая и последняя на данный момент амфибия, созданная в Тольятти. Автомобиль, передвигающийся за счёт вращения собственных колёс как по суше, так и по воде, серийно никогда не производился.

А жаль… Косяки «Рек», бороздящих волжские дали с фоном из Жигулёвских гор, будоражат воображение.

ВАЗ-1801 «Пони»

Как и многие советские технические разработки, ВАЗ-1801 — фантазия на тему продукции капиталистического мира. В 1969 году на «ВАЗ» попал британский Mini Moke, на котором по территории завода с ветерком гонял главный конструктор.

Спустя примерно 10 лет на заводе было разработана собственное подобие британца. Это был электромобиль с двумя аккумуляторами, заряда которых хватало на 110-120 километров. Дизайном внешнего вида модели, получившей кодовое название «Пони», занимался создатель экстерьера «Оки».

Советский электромобиль должен был быть запущен к московской Олимпиаде. Но довести его до ума к сроку не успели. А потом он был забыт, предварительно засветившись на нескольких автомобильных выставках. Что немудрено… Зачем в СССР был нужен гольф-кар? Стране в тот момент больше желала автомобилей, на которых удобно было возить тыкву с дачи.

ВАЗ-21073

Одна из модификаций «семёрки», созданная в год 400-летия Куйбышева. Безумная фантазия на тему дизайна «Volvo». На самом же деле это попытка скрестить «семёрку» и детали грядущей «восьмёрки». Это сейчас слова «семёрка» и «восьмёрка» больше ассоциируются с калифорнийскими Windows и iOS. А тогда это было больше про наше, волжское…

ВАЗ-21073, по большому счёту, был конструкторским баловством. Потому как лучшие силы завода в тот момент уже были брошены на серийный запуск Лады «Спутник».

LADA RAPAN

Это чудо пришло на землю будто бы из сна перебравшего Люка Бессона. Автомобиль назван в честь хищного моллюска, привезённого с Дальнего Востока в Чёрное море и сожравшего там на данный момент практически всю мелкую фауну. «Rapan» — электрокар, показанный в 1998 году после долгих 12 лет разработок. Автомобиль, приборы управления которого спрятаны в руль, был встречен с большим любопытством на автосалоне в Париже. Но это был как раз случай «про увидеть Париж и умереть».

«АвтоВАЗ» хотел привлечь РАО «ЕЭС России» для того, чтобы холдинг оснастил существующие обычные заправки устройствами для подзарядки «Рапанов». Но в епархии Анатолии Чубайса идея восторга не вызвала. И единственный в мире «Rapan» теперь стоит в холле управления «АвтоВАЗа», а по дорогам мира ездят электромобили «Tesla» из Силиконовой Долины.

LADA ОКА-2

Маленькая машина нового поколения отечественного производства, которой так не хватает на наших перегруженных дорогах, даже производилась на «АвтоВАЗе». Но сделали «Оку-2″ в середине нулевых всего в количестве 10 штук. И что-то пошло не так…

Новой «Окой» интересовались «КамАЗ» и «СеАЗ». Юрий Лужков хотел запустить её производство на простаивающих мощностях «ЗИЛа». Но все эти планы превратились в тлен. И сейчас «Ока-2″ подобно «Ё-мобилю» стала красивой, но печальной страницей истории нашей автомобильной промышленности.

ВАЗ-2120 «Надежда»

Первый минивэн отечественного производства делали на экспериментальном производстве «Автоваза» с 1998 по 2006 годы. «Надежд» успели сделать целых 8 000. Но особых веры и любви к ним отечественные потребители не испытывали. Их называли морально устаревшими и неоправданно дорогими.

Цитата «производит впечатление автомобиля, собранного из запчастей от разных моделей» говорит о «Надежде» практически всё.

Впрочем, у «двадцаток» имеются и свои фанаты. Как и у всего, что сделано на базе «Нивы».

LADA CARAT

Ещё один концепт-кар — фантазия на тему «Оки». Показан в 2002 году и превращён в экспонат Технического музея «АвтоВАЗа».

ЛАДА-2151

Концепт, также показанный в Москве на автосалоне в 2002 году. Такие машины по задумкам их создателей должны были придти на смену вазовской «классики».

Сначала машину планировать назвать «Стрежень». Но это имя было зарублено из-за неудобной для продвижения на мировом рынке русской буквы «Ж». В итоге 51-ю «Ладу» назвали «Неоклассика». Но «экологическую нишу» «Неоклассики» в модельной линейке завода заняли «Калины». А 51-я так и осталась просто довольно удачной фантазией заводских дизайнеров и конструкторов.

LADA C

Совместный проект волжан с канадской «Magna International». То, что вы видите на фотографии — это «Калина 4х4″. Как бы это дико не звучало.

В 2006 году тольяттинцы с фирмой из Онтарио решили запустить а производство сразу 10 новых моделей. В 2009 году канадцев выкурил из Тольятти Альянс Renault Nissan. А всё, что было придумано в ходе разработки серии Lada C, вроде как, планируют вложить в Lada Vesta. Но такую «Калину 4х4″ мы на улицах городов не увидим. Можно перестать бояться.

Изгибы «лады наружу» выше 10-го лада

А-ха-ха-ха, первое, что случилось, я пошел искать линейку, которую ПРОСТО КУПИЛ, и не могу ее найти. Затем, просмотрев несколько статей о настройке гитары, некоторые из которых вызывают смех, я решил поработать местным техническим специалистом. 79 долларов при условии, что они повторно используют мои струны (которые я только что надел). 99 долларов в противном случае. 20 долларов за струны? эй! Но я придаю своему свободному времени явную ценность, а затем много раз, сталкиваясь с какой-нибудь сложной необычной задачей, я прикидываю, во сколько это мне будет стоить.В этих условиях он должен был стоить около 500 долларов, так что 79 долларов — ничто. Я думаю, это будет хорошая гитара. Одна вещь, которая интересна в исполнении этого «Tele» (никогда раньше не играл на нем), — это то, что звук напоминает мне «старомодный рок-н-ролл». Для меня это середина 60-х.

Щелкните, чтобы развернуть …

Честно говоря, эти цены кажутся очень завышенными. Мастер поблизости может сделать честную настройку за ≈25 евро (и вы приносите свои собственные струны, так что никакой дополнительной платы там нет).

У меня нет опыта работы с Peavey, но выполнить базовую настройку на телескопе очень просто.Под этим я подразумеваю регулировку рельефа, действия, интонации, мелкий ремонт (например, замену седел, подавление статического электричества…), регулировку высоты гайки, регулировку высоты звукоснимателя, выравнивание грифа, чистку горшков или шум переключателей. Все это я научился делать сам с нуля. И, честно говоря, я обычно делаю такую ​​же хорошую работу, как и мой техник (а он тот, кому я доверяю) — не потому, что я более опытен, а потому, что я трачу больше времени и внимания и хорошо знаю свои предпочтения.

Я дошел до того, что обращаюсь к техническим специалистам только для тех вещей, для которых у меня нет оборудования или навыков, например, изменение проводки или звукоснимателей (и я думаю, что с некоторым терпением я мог бы это сделать) , резьба или полная замена гайки. Это означает, что я больше не хожу в технику, за исключением очень редких случаев.

Вам понадобится очень мало инструментов и очень мало времени, чтобы приобрести мой очень скромный уровень навыков, но, судя по тому, что я могу прочитать, это может решить множество проблем.

Что касается вашей проблемы, вы получили все необходимые советы: это облегчение, или действие, или резьба (или, что еще хуже … неровная или искривленная шея, но давайте пока не будем это учитывать …). Определить, какой именно, довольно легко. Посмотрите, есть ли у вас высокие лады в этом районе (может быть, 10 минут измерения и заметок).Даже если уровень ладов действительно желателен, как говорили другие, маленькие недостатки должны вызывать раздражение … У меня есть гитары с несколькими высокими точками в их резьбе, и я могу гнуть как шарм. Затем еще раз проверьте облегчение. Если все в порядке, попробуйте немного поднять активность и посмотреть, как у вас дела.

10 шагов к мастерству игры на грифе

Вы когда-нибудь чувствовали себя немного не в своей тарелке или просто терялись в определенных частях грифа гитары? Вы точно не одиноки.

Подумайте вот о чем: стандартно настроенная 6-струнная гитара с 22-ладовой панелью имеет диапазон чуть меньше четырех октав и содержит пять средних до, в то время как полноразмерная фортепианная клавиатура охватывает более семи октав, но имеет только один средний C. Что с этим?!?

Это просто природа инструмента. По своей конструкции клавиатура относит любую заданную высоту звука к одной клавише, в то время как гитарный гриф предлагает от одной до пяти различных положений струн и ладов для одной и той же ноты.

Эти многократные повторения одной и той же высоты звука предоставляют гитаристам множество вариантов того, где сыграть ту или иную ноту, но они также вызывают значительную путаницу у новичков или музыкантов, которые часто чувствуют себя потерянными выше 5-го лада, особенно на внутренних четырех струнах.

Запоминание адреса (т. Е. Местоположения) каждой записи на грифе может занять годы, но есть способы ускорить этот процесс. Хотите знать, как найти и удержать ориентацию в любом месте грифа? Во-первых, ты должен. ..

1. Знайте свои основы

Давайте начнем с обзора некоторых элементарных музыкальных знаний. Основными единицами измерения в западной музыке являются полутон или полутон, что на гитаре переводится на расстояние в один лад, и целый шаг, или целый тон, который покрывает два лада.

Музыкальный алфавит состоит из семи естественных нот: A, B, C, D, E, F и G. Все эти смежные ноты разнесены на целый шаг, за двумя исключениями: B-to-C и E-to-F — полушаги.Имея все это в виду, пришло время…

(Изображение предоставлено в будущем)

2. Карта территории

Сравните гриф гитары с клавиатурой пианино, родиной теории музыки, и вы обнаружите, что в то время как Клавиатура разделяет естественные и случайные ноты (диез и бемоль — подробнее об этом через минуту) на аккуратные белые и черные клавиши, которые лежат вдоль горизонтальной плоскости и повторяют каждую октаву, гитара не предлагает такой простой способ распознавания нот.

Многие традиционные методы для начинающих охватывают ноты до 3-го или 5-го ладов, но выше этого мы, по сути, предоставлены нашим собственным устройствам. Размещенные на полной сетке грифа, или матрице, естественные ноты проявляются, как показано на РИСУНОК РИСУНОК 1 .

Конечно, это много заметок, которые нужно запомнить, но первое, что нужно помнить, это то, что если вы не измените настройки, адрес каждой заметки будет постоянным. Они никуда не денутся. А что насчет всех этих пустых мест?

3. Целенаправленное добавление случайных сигналов

Остальные пять тонов в пределах любой октавы (с шагом 12 полутонов) аннотируются с помощью случайных или резких и плоских символов.Диез (#) поднимает ноту на полтона, а бемоль (b) понижает ее на полтона.

Энгармонические ноты возникают, когда две разные случайности используются для обозначения одной и той же высоты звука, то есть A # = Bb, C # = Db, D # = Eb, F # = Gb и G # = Ab. Сетка, проиллюстрированная на РИСУНОК 2 , заполняет дыры в РИСУНОК 1 всеми недостающими случайностями, завершая «общую картину».

Думайте об этом как о своей вселенной. А теперь давайте начнем разбирать этот гигантский кластер и выясним, что же здесь происходит на самом деле.

(Изображение предоставлено: Future)

4. Повторите себя

РИСУНОК 3 показывает пять средних до гитары на пяти разных струнах. (Факт: стандартная гитарная нотация звучит на октаву ниже, чем написано.) Обратите внимание на то, что ноты на любой паре соседних струн равноудалены (на расстоянии пяти ладов друг от друга), за исключением второй и третьей струн, где расстояние уменьшается на один лад.

Как только вы поймете, что эта взаимосвязь сохраняется независимо от того, с какой ноты вы начинаете, вы можете найти унисоны на более высоких или низких строках, используя ту же формулу, за исключением крайних низких и высоких регистров, где ноты появляются только один раз.

(Лик дня: выберите любую высоту звука, которая появляется четыре раза, и сыграйте ее последовательно на четырех соседних струнах. Повторите много раз в любом направлении как можно быстрее. ) Затем мы добавляем несколько октав и …

5. Введите The Matrix

Любая нота может быть найдена в различных октавах в шести местах между открытой позицией и 12-м ладом. Поскольку гриф повторяется на октаву выше, начиная с 13-го лада, так что делайте любые ноты и формы, которые вы применяете к нему.

В РИСУНОК 4 мы определяем на матрице все C ниже 12-го лада и соединяем их, чтобы сформировать шеститочечный шаблон, который можно перемещать в любое положение на грифе.Подобно созвездию, эта «Большая Медведица» сохраняет свою форму, перемещаясь по разным позициям в матрице нот.

По мере того, как «ковш» движется к гайке, любые точки формы, исчезающие ниже открытого положения, снова появляются на октаву выше, ниже 12-го лада. И наоборот, любые точки, которые возвышаются над 12-м ладом, снова появляются, начиная с 1-го лада. Давайте двигаться и…

6. Путешествие по космосу

Видите, как корни в РИСУНОК 5 появляются на пятой и третьей струнах? Это потому, что мы сдвинули весь корневой шаблон на одну ссылку вниз и добавили недостающую на одну октаву выше.

Это отображает все шесть А между открытой и двенадцатой позициями и создает визуальную вариацию в нашей «Большой Медведице», но все, что мы на самом деле делаем, это запускаем тот же шаблон с другой точки отсчета.

РИСУНОК 6 перемещает шаблон вниз по другой ссылке, чтобы открыть шесть G, и РИСУНОК 7 и 8 продолжают процесс с E и D соответственно, пока мы не вернемся к точке C. на сетке из 12 ладов, чтобы сразу найти все шесть мест для любой ноты, а затем повторить это, начиная на 12 ладов выше, чтобы охватить весь диапазон гитары.Зачем использовать C, A, G, E и D в качестве ориентиров? Рад, что ты спросил!

(Изображение предоставлено: Future)

7. Откройте для себя заново свои корни

Наша «Большая Медведица» также предоставляет подвижный шаблон всех корневых местоположений и соединений для пяти основных форм мажорных струн с открытой струной — C, A, G , E и D. (Что это за заклинание?)

Они определяются и называются по их нижнему возможному положению грифа, и каждая форма использует различную конфигурацию корневых нот, что подтверждается освежающими память сетками аккордов в РИСУНОК 9 .

Корни этих форм аккордов всегда и без исключения расположены следующим образом:

Форма «C» = корни пятой и второй струн.

Форма «А» = корни на пятой и третьей струнах.

Форма «G» = корни на шестой, третьей и первой струнах.

Форма «E» = корни на шестой, четвертой и первой струнах.

Форма «D» = корни на четвертой и второй струнах.

(Я упоминал всегда и без исключения?) Выровняйте их всех по сетке и…

8.Соединение точек

РИСУНОК 10 показывает, как формы C, A, G, E и D соединяются, образуя пять различных голосов аккордов C между 1-м и 13-м ладами. Это объединяет гриф и показывает, как каждая форма соединяется через одну или две корневые ноты.

Спой сейчас со мной: «Форма« C »связана с формой« A », форма« A »связана с формой« G », форма« G »связана с формой« E », форма« Форма E соединена с формой D, форма D соединена с формой C и так далее.Теперь посмотрим глубже и…

9. Сдвинуть взгляд

Используя разные графические символы для каждого тона аккорда, как в РИСУНОК 11 , легко увидеть, как эти пять соединяющихся форм C-аккорд возникают в открытом положении с круговые корни C , ромбовидные Es и квадратные G происходят одновременно.

Потренируйтесь разбивать каждый тон аккорда на отдельный дискретный «диппер» — для Cmaj7 играйте все основные тона (Cs), затем все тройки (Es), все 5 (Gs) и все семерки (B) — для создания уникальных арпеджио.

10. Новое определение карты

Наконец, давайте еще раз взглянем на рисунки 1 и 2 с более осознанной точки зрения. РИСУНОК 12 организует 12-ладовый шаблон естественных нот в пять различных основных гамм C , каждый из которых придерживается основных позиций соответствующей формы аккорда.

Весь шаблон может быть сдвинут вверх или вниз для транспонирования всего грифа на любую тональность — на полшага вверх для C # / Db, на целый шаг вверх для D, на полтора шага вверх для D # / Eb и так далее.

Конечно, это все виртуальные точки и маркеры положения, поэтому мы должны научиться визуализировать эти шаблоны по запросу. «Большая Медведица», пять основных форм аккордов и пять основных моделей звукоряда (которые также содержат все семь режимов) обеспечивают универсальную точку отсчета, исходящую из любой ноты в любой позиции.

Запомните их, и вы больше никогда не почувствуете себя потерянным!

(Изображение предоставлено: Future)

Джесси Гресс — автор книги The Guitar Cookbook.

Настраиваемая микросекундная динамика аллостерического переключателя регулирует активность машины дезагрегации AAA +

Сверхбыстрая динамика M-домена ClpB

Мы разработали серию двойных цистеиновых мутантов, которые позволили бы нам исследовать конформационные изменения M-домена, используя smFRET спектроскопия 27,40,41 . Сначала мы расположили один зонд на так называемом мотиве 1 М-домена (на остатке 428), а второй зонд на NBD2 (остаток 771) (рис. 1а). Мы пометили эту конструкцию донорными и акцепторными флуоресцентными красителями.Чтобы гарантировать, что мы измерили эффективность FRET от одного протомера каждого гексамерного комплекса, мы собрали гексамеры ClpB, используя соотношение немеченых и дважды меченых субъединиц 100: 1 (см. Методы и дополнительные рисунки 1–5 для очистки, сборки ClpB, маркировка и другие контрольные эксперименты).

Рис. 1

Конформационная динамика M-домена, измеренная с помощью smFRET. — Гексамерная модель ClpB, реконструированная из мономерной структуры Thermus thermophilus (PDB: 1QVR) 26,53 .Один мономер выделен, а N-концевой домен — золотым, два нуклеотидсвязывающих домена, NBD1 и NBD2, — синим и зеленым, соответственно, и М-домен — лососевым цветом. Красная стрелка указывает на позиции присоединения донорных и акцепторных красителей (S428 и S771 соответственно). b Гистограмма эффективности FRET для дважды меченого ClpB (S428C-S771C). Белая линия и черная стрелка указывают ожидаемую ширину на основе дробового шума. Синяя линия — результат моделирования «перекраски» (см. Методы).Стрелки над гистограммой показывают положения трех состояний, полученные в результате анализа H 2 MM. c , d Две траектории одиночных молекул, разделенные на интервалы 60 мкс. Верхняя панель в каждом разделе показывает сигналы донора и акцептора (зеленый и красный соответственно), а нижняя панель показывает эффективность FRET, полученную из сигналов оранжевым цветом, а фиолетовая линия представляет присвоение состояний, полученное в результате анализа H 2 MM. e Результаты анализа H 2 MM измерения smFRET ClpB (S428C-S771C) в присутствии АТФ.См. Также дополнительный рисунок 8. Скорости взаимных преобразований между состояниями показаны над и под каждой стрелкой. Заселенность каждого состояния представлена ​​размером круга (состояние 1–43 ± 1%, состояние 2–42 ± 1% и состояние 3–15 ± 1%). Эффективность FRET показана внутри кружков. f , g Гистограммы эффективности FRET из экспериментов с двумя дополнительными донорно-акцепторными парами: 428–359 ( f ) и 483–359 ( g ). На вставке на каждой панели показана структура мономера с отмеченными донорными и акцепторными сайтами (зеленым и красным соответственно).Красная и оранжевая линии в ( f ) и ( g ), соответственно, являются результатами моделирования «перекраски» (см. Также дополнительный рис. 9). h Гистограммы эффективности FRET варианта ClpB с цистеинами на двух концах M домена, S428C-N487C (см. Структуру на вставке, положения цистеина показаны зеленым и красным). Гистограммы были измерены в присутствии 2 мМ АТФ (красный) и в отсутствие АТФ (зеленый). Ошибки представляют собой стандартные ошибки среднего. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных

Конформационная динамика меченых молекул измерялась в растворе в присутствии 2 мМ АТФ.В этих условиях гексамеры ClpB были хорошо собраны (см. Раздел дополнительной информации «Проверка структурной целостности гексамеров ClpB» и дополнительный рисунок 3 для обсуждения стабильности наших гексамеров). Свободно диффундирующие молекулы ClpB испускали вспышки фотонов, проходя через сфокусированный лазерный луч. Время прихода и цвет каждого фотона регистрировались в донорном и акцепторном каналах. Гистограмма эффективности FRET была построена для молекул, которые содержали как донорные, так и акцепторные красители (см. Дополнительный рисунок 6 для фильтрации молекул), и показала основную популяцию при эффективности FRET, равной 0.65 ± 0,01, и небольшая популяция при эффективности FRET 0,23 ± 0,01. Важно отметить, что главный пик оказался намного шире, чем ожидалось, на основании дробового шума (Fig. 1b), что указывает на две или более конформации в условиях быстрой динамики обмена 41,42 . Проверка объединенных траекторий фотонов (рис. 1c, d и дополнительный рис. 7), которая показала флуктуации эффективности FRET, подкрепила это наблюдение.

Для извлечения информации о быстрой динамике области M мы обратились к H 2 MM, мощному алгоритму скрытой модели Маркова, разработанному недавно в нашей лаборатории 21,41 .Мы обнаружили, что минимальное количество состояний, необходимое для соответствия траекториям одиночных молекул, равно трем: две основные популяции при эффективности FRET 0,8 ± 0,01 (состояние 1) и 0,47 ± 0,01 (состояние 2), а также второстепенная популяция при эффективности FRET 0,15 ± 0,01 (состояние 3). Относительные заселенности этих состояний составляли 0,43 ± 0,01, 0,42 ± 0,01 и 0,15 ± 0,01 соответственно. Интересно, что мы обнаружили, что эти три состояния обмениваются последовательным образом (дополнительный рисунок 8) с высокой скоростью перехода между состояниями 1 и 2, k 12 = 5300 ± 150 с -1 и k 21 = 5700 ± 100 с −1 , и более медленные скорости перехода между состояниями 2 и 3, k 23 = 800 ± 50 с −1 и k 32 = 2300 ± 100 с −1 (рис. 1b – e, дополнительная таблица 1). Мы проверили анализ ММ H 2 , используя четыре различных метода, включая стохастическое перекрашивание данных 21,43 (рис. 1b, дополнительный рис. 9A), анализ сегментации 21 , анализ распределения времени задержки и перекрестный анализ. корреляционный анализ (дополнительные рисунки 10A, E, I и дополнительные таблицы 2). Признаком правильного моделирования данных было то, что для всех мутантов и условий, которые мы использовали (независимые измерения), мы получили практически одинаковые значения FRET для трех состояний (см. Файл исходных данных).Мы также явно проверили, что модель с дискретными состояниями является лучшим способом описания данных, как описано в разделе «Дополнительная информация» «Проверка пригодности модели с тремя состояниями». Мы повторили эксперимент в присутствии медленно гидролизуемого нуклеотида ATPγS вместо ATP с очень похожими результатами (дополнительный рис. 11). Этот результат указывает на то, что гидролиз нуклеотидов не влияет напрямую на динамику M-домена, что соизмеримо с тем фактом, что скорость конформационных изменений M-домена была намного выше, чем скорость гидролиза АТФ (3. 2 ± 0,1 мин -1 , дополнительный рисунок 11 и дополнительный рисунок 4A).

Чтобы дополнительно охарактеризовать динамику M-домена, мы создали две дополнительные пары FRET: пару S428C-S359C для исследования конформационных изменений мотива 1 (рис. 1f) и пару Q483C-S359C для исследования мотива 2 (рис. 1g). . Гистограммы FRET обоих мутантов также показали большой широкий пик и второстепенный пик (рис. 1f, g, дополнительный рис. 9B, C), а анализ H 2 MM показал, что они также лучше всего описываются с помощью модели с тремя состояниями. .Скорости перехода между двумя популяциями в главном пике были аналогичны тем, которые наблюдались с парой FRET S428C – S771C (дополнительная таблица 1). Чтобы исключить возможность того, что наблюдаемая быстрая динамика обусловлена ​​конформационными изменениями внутри M-домена, такими как разворачивание мотива 2 26,35,37 , мы пометили сам M-домен одним красителем на мотиве 1 (S428C) и второй по мотиву 2 (N487C). Гистограмма FRET этого варианта показывала единственный узкий пик как в присутствии 2 мМ АТФ, так и в его отсутствие (рис. 1ч). Этот результат очень ясно демонстрирует, что M-домен движется как твердое тело.

Приведенные выше находки подтверждают, что M домен очень динамичен и преобразуется между двумя основными состояниями и третьим второстепенным состоянием намного быстрее, чем ClpB гидролизует АТФ или дезагрегирует белки (дополнительный рис. 4A и дополнительный рис. 5D). Это может объяснить, почему многие структурные исследования, основанные на криоэлектронной микроскопии (Cryo-EM), не смогли разрешить полную структуру M-домена, которая отсутствовала или только частично наблюдалась на картах электронной плотности из-за его высокой подвижности 36,44, 45 .В этом исследовании мы сосредоточены на анализе двух основных динамических состояний области M, состояний 1 и 2, и их связи с различными возмущениями, воздействующими на ClpB. Третье и второстепенное состояние области M будет обсуждаться в следующей публикации. Мы начнем здесь с создания структурной модели для состояний 1 и 2 на основе значений эффективности FRET, полученных с помощью трех пар FRET.

Структурная модель для конформаций M-домена

Чтобы получить структурную информацию для двух основных состояний M-домена, мы использовали три набора эффективности FRET, полученные в экспериментах smFRET с тремя парами FRET (дополнительная таблица 3), объединенными с подходом геометрической триангуляции.Триангуляция на основе нескольких пар FRET была применена для получения структурных моделей белковых комплексов 46,47,48,49,50,51,52 . Здесь мы разработали несколько иную схему анализа из этих работ. Начиная с гексамерной структурной модели TT ClpB 53 , которая основана на кристаллической структуре субъединицы 26 , мы создали множественные конформации M-домена, вращая его как твердое тело вокруг точки соединения с NBD1 (остаток 396).Первоначально был сгенерирован набор из ~ 16000 конформаций, а затем мы исключили все конформации, которые вызывали стерическое столкновение внутри одного и того же протомера и соседних протомеров (см. Методы), в результате чего у нас осталось только ~ 5% от всего набора (рис. 2а). ). Затем мы рассчитали значения эффективности FRET для трех местоположений пар FRET (S428C-S771C, S359C-S428C и Q483C-S359C) в каждой из допустимых конформаций, принимая во внимание конформации красителя и линкера (см. Методы и дополнительные примечания), и использовали их для вычисления значения «хи-квадрат» для каждой конформации.Были рассчитаны два набора значений хи-квадрат, один для состояния 1 и один для состояния 2. Затем мы выбрали группу из десяти структур с наименьшими значениями хи-квадрат (рис. 2b, c, дополнительная таблица 3). Эта процедура генерировала структурные модели М-домена в каждом из состояний (рис. 2б, в).

Рис. 2

Получение структурной модели конформаций M-домена. a Рисунок, на котором показаны все разрешенные конформации домена M (показаны радужным цветом), наложенные на структуру гексамера (серый цвет), которая смоделирована на основе кристаллической структуры мономера ClpB 53 . b , c Конформация M-домена в состоянии 2 (( b ), показано зеленым) и состоянии 1 (( c ), показано синим). Показаны 10 конформаций с наименьшими значениями хи-квадрат, полученными в результате наших расчетов (см. Методы). Предсказанные значения эффективности FRET, соответствующие каждой структуре, были рассчитаны с учетом линкеров красителей 49,50 . См. Дополнительную таблицу 3 для дальнейшего анализа лучших структур и методов для процедуры расчета.Исходные данные представлены в виде файла исходных данных

Поразительно, конформация домена M в состоянии 2 аналогична конформации домена, наблюдаемого в кристаллической структуре ClpB 26 (рис. 2b, дополнительная таблица 3), и в недавнем исследовании крио-ЭМ 27 . Ось M-домена в состоянии 2 по существу перпендикулярна оси симметрии ClpB, так что все шесть M-доменов параллельны друг другу. Следовательно, состояние 2 может быть идентифицировано с неактивным состоянием M домена, как оно было охарактеризовано ранее из мутантного анализа и крио-EM исследований 29,31 . Количественный анализ структурных моделей состояния 2 М-домена показал, что лучшая модель имела среднеквадратичное отклонение (RMSD) 1,2 Å от кристаллической структуры, в то время как все десять лучших моделей имели среднее значение RMSD 5,5 ± 3,1. Å (см. Дополнительную таблицу 3 и дополнительный рис. 12A, B для сравнения с недавней криоЭМ структурой высокого разрешения 27 ).

Состояние 1 домена M отклонено от параллельной неактивной конформации на 40 ± 2 ° (рис. 2c, дополнительная таблица 3), а мотив 2 открыт и доступен для взаимодействия с DnaK 30 .Таким образом, эта структура соответствует активному состоянию. Важно отметить, что предыдущей полной и точной конформационной модели для активного состояния M-домена не существовало, вероятно, из-за его высокой мобильности 27,31,54 , хотя оценка структуры мотива 1 была предоставлена. Девиль и др. 27 (см. Дополнительный рисунок 12С для сравнения с этой структурой). В данной работе представлена ​​полная и точная модель M-области в этом состоянии. В предлагаемой нами модели мотив 1 наклоняется, перемещаясь от NBD1 к NBD2 в активном состоянии.В наклонной конформации мотив 1 остается на том же уровне с NBD1 соседнего протомера (Supplementary Fig. 12D), что хорошо согласуется с ориентацией, ранее предложенной Deville et al. 27 .

Аллостерические взаимодействия домена M и NBD

Было показано, что связывание и гидролиз АТФ по-разному влияют на активность ClpB 28,36,55,56,57,58,59 . Каждый из двух сайтов связывания нуклеотидов, NBD1 и NBD2, содержит консервативные мотивы Walker A и Walker B 60,61 .Мутация мотива Walker A отменяет связывание ATP, в то время как мутация Walker B не влияет на связывание, но предотвращает гидролиз. Чтобы понять аллостерические взаимодействия между сайтами связывания АТФ и М-доменом, мы проверили влияние мутаций мотива Уокера на динамику М-домена. Мы начали с отмены связывания АТФ с NBD1 с использованием мутации K204T в его мотиве Walker A 61,62,63 . Этот вариант (который мы обозначили [A A + ]) оказался хорошо собранным (дополнительный рис.3 и дополнительный рис.13), как ранее сообщалось для других аналогичных мутантов Walker A 29,64 , показали заметную дезагрегационную активность, но только слабую активность АТФазы, которая усиливалась при связывании с субстратом κ-казеина (рис. 3a, b и дополнительный рис. 14). Исследования smFRET [A A + ] показали пониженную скорость перехода из состояния 1 в состояние 2 по сравнению с WT, k 12 = 3500 ± 100 с -1 , но аналогичная скорость перехода в обратном направлении k 21 = 5800 ± 350 с −1 (рис.3c, дополнительный рисунок 7B, C, дополнительный рисунок 9D и дополнительная таблица 2 и дополнительная таблица 4). Это изменение скорости перехода привело к увеличению отношения активного / неактивного состояний с 1,00 ± 0,01 в WT до 1,63 ± 0,02 в [A A + ] (дополнительная таблица 5). Мы построили приблизительный профиль свободной энергии по этим параметрам, который сравнивается с соответствующим профилем свободной энергии WT на рис. 3c. Высота барьера свободной энергии в этих и дополнительных профилях, представленных в статье, была рассчитана с использованием уравнения Аррениуса с консервативным выбором 10 5 s -1 для предэкспоненциального множителя.Теоретические 65 и экспериментальные 66 оценки предполагают, что этот фактор может на самом деле быть больше, чем 10 6 s -1 . Увеличение соотношения заселенности двух состояний отражалось на гистограмме эффективности FRET этого мутанта, которая показывала сдвиг в сторону более высоких значений эффективности FRET по сравнению с WT (рис. 3d).

Рис. 3

Сайты связывания нуклеотидов влияют на динамику М-домена. a Базальный и κ-казеин стимулировали активность АТФазы (пурпурный и зеленый, соответственно) ClpB дикого типа и двух мутантов сайта связывания нуклеотидов, [A A + ] и [A + A ]. Активность WT и [A A + ] значительно усиливалась κ-казеином. b Дезагрегационная активность мутантов ClpB WT и Walker A. [A A + ] сохраняет значительный уровень дезагрегационной активности, в то время как [A + A ] менее активен. c Профили свободной энергии области M, рассчитанные из H 2 MM популяций и скоростей, полученные из анализа данных smFRET для WT (оранжевый) и [A A + ] (синий) и [A + A ] (фиолетовый).Высота барьера на этом и других рисунках была рассчитана с использованием уравнения Аррениуса с предэкспоненциальным множителем 10 5 с -1 . Скорости перехода (в секундах -1 ) приведены в дополнительной таблице 4. Состояние 1 [A + A ] дестабилизировано по сравнению с WT, и скорость перехода из состояния 1 в состояние 2 увеличивается, в то время как состояние 1 [A A + ] стабилизируется, так что скорость перехода из состояния 1 в состояние 2 уменьшается (значения отношения между состояниями см. в дополнительной таблице 5). d Гистограммы эффективности FRET WT (оранжевый), [A + A ] (фиолетовый) и [A A + ] (синий). Сдвиг гистограмм [A A + ] и [A + A ] в сторону более высокой и более низкой эффективности FRET, соответственно, отражает стабилизацию или дестабилизацию состояния 1. Оранжевые кружки в ( a ) и ( b ) представляют собой отдельные повторы измерений. Планки погрешностей представляют собой стандартные ошибки среднего.Исходные данные представлены в виде файла исходных данных

Затем мы отменили связывание АТФ с NBD2, введя мутацию K601T 61 . Этот вариант (обозначенный [A + A ]) также оказался хорошо собранным (дополнительный рисунок 3 и дополнительный рисунок 13) 29,64 , но в отличие от [A A + ] его очень слабая АТФазная активность не усиливалась связыванием κ-казеина, и скорость дезагрегации была ниже (рис. 3a, b и дополнительный рис.14). Исследования smFRET этого мутанта показали повышенную скорость перехода из состояния 1 в состояние 2, k 12 = 7700 ± 100 с -1 , и снова аналогичную обратную скорость, k 21 = 6000 ± 200 s −1 (рис. 3c, дополнительный рис. 9E и дополнительная таблица 4). Соотношение населения между штатами снизилось с 1,00 ± 0,01 до 0,75 ± 0,02 (дополнительная таблица 5).

Здесь мы обнаружили, что оба мутанта Walker A хорошо собраны в наших экспериментальных условиях, что свидетельствует о том, что оба NBD играют роль в стабилизации гексамера (дополнительный рис.3). Однако мы четко наблюдаем, что NBD2 вносит более значительный вклад в работу машины (рис. 3a, b). Наши результаты предполагают значительный аллостерический эффект связывания нуклеотидов на динамику М-домена. Связывание нуклеотидов с NBD2 стабилизирует M-домен в активном состоянии, тогда как связывание нуклеотидов с NBD1 стабилизирует неактивное состояние. Сочетание структурных изменений M-домена со связыванием нуклеотидов с NBD наблюдалось 28,29,33,34,35,45,67 , самое последнее в исследовании Sugita et al. 68 , который сообщил, что связывание АТФ с NBD1 сдвигает М-домен к наклонной конформации. Здесь мы показываем, что эта связь осуществляется через влияние на динамику M-области. В частности, мутации не оказывают существенного влияния на скорость перехода из состояния 2 в состояние 1, тогда как скорость перехода из состояния 1 в состояние 2 модулируется. Таким образом, регулирование динамики M-домена осуществляется посредством состояния 1, а именно активной конформации. Вместе два NBD оказывают сдерживающее влияние на динамику и конформацию M-домена.При относительно низкой концентрации АТФ, где NBD2 лучше связывает нуклеотид (с K 0,5 320 ± 20 мкМ, см. Дополнительную таблицу 6), домен М предпочтительно находится в своем активном состоянии, тогда как при более высокой концентрации АТФ NBD1 также хорошо связывает АТФ (с K 0,5 500 ± 73 мкМ, см. дополнительную таблицу 6), переводя M домен в неактивное состояние. Действительно, мы обнаружили, что из-за этих двух противоположных эффектов при насыщающих концентрациях АТФ домен M в WT ClpB находится ~ 50% времени в каждом из состояний (рис.1б). Результаты, описанные выше с вариантами [A A + ] и [A + A ], нельзя отнести к структурным нарушениям, вызванным мутациями, а скорее отражают отсутствие связывания АТФ с одним из них. сайтов связывания нуклеотидов. Чтобы доказать это, мы сконструировали двойной мутант Walker B [B B ] (E271A, E668A), который мог связывать, но не гидролизовать АТФ в обоих NBD. Было обнаружено, что этот мутант хорошо собран (дополнительный рис.13), но, как и ожидалось, 55,69 , не наблюдалось активности АТФазы и, следовательно, активности дезагрегации (дополнительный рис. 15A – C). Однако измерения smFRET этого мутанта показали динамику M-домена, напоминающую WT, отражая уже упомянутые измерения с негидролизуемым ATPγS (дополнительный рис. 15A, дополнительный рисунок 11 и дополнительные таблицы 4-5).

DnaK и связывание с субстратом регулируют динамику M домена

DnaK является основным компонентом ко-шаперонной системы в процессе дезагрегации, который, как было показано, действует как выше, так и ниже по течению от ClpB 25,30,63,70 .Кроме того, DnaK связывается с M-доменом по мотиву 2 63 , регулируя его дезагрегационную активность. Мы провели smFRET измерения ClpB в присутствии возрастающих концентраций DnaK (см. Дополнительный рисунок 16 для характеристики DnaK). При всех концентрациях наблюдался быстрый обмен между состояниями 1 и 2 (дополнительный рисунок 7D, E, дополнительный рисунок 9F, дополнительный рисунок 10B, F, J, дополнительная таблица 2 и дополнительная таблица 7). Однако было обнаружено, что соотношение населения между состоянием 1 и состоянием 2 увеличивается с концентрацией ко-шаперона со значения 1.00 ± 0,01 в его отсутствие до значения 1,85 ± 0,03 при 25 мкМ (рис. 4а). Это изменение в соотношении населенностей отразилось также на профиле свободной энергии (рис. 4b). Примечательно, что популяция третьего и второстепенного состояния домена M резко снижается по мере увеличения концентрации DnaK (Supplementary Fig. 17).

Рис. 4

Связывание с DnaK и субстратом стабилизирует активное состояние M домена. a Коэффициент заполнения состояния 1 и состояния 2 (активный / неактивный) показывает монотонный рост (фиолетовые круги).Сплошная линия соответствует модели связывания, что дает K d 3 ± 1 мкМ. b Профили свободной энергии M-домена, рассчитанные из H 2 MM-производных популяций и скоростей, полученных из анализа данных smFRET при трех концентрациях DnaK: 0 мкМ (оранжевый), 5 мкМ (синий) и 25 мкМ (красный). Обе скорости увеличиваются с DnaK, но k 21 увеличиваются еще больше, что приводит к накоплению активного состояния. Значения ставок см. В дополнительной таблице 7. c ClpB инкубировали с возрастающими концентрациями κ-казеина. Измерения показали, что скорость k 21 увеличивается как функция κ-казеина (синий цвет), в то время как скорость k 12 уменьшается (зеленый цвет) (дополнительная таблица 8). d Показаны популяции в активном (красный) и неактивном (желтый) состояниях в зависимости от концентрации κ-казеина, демонстрируя антикоррелированную тенденцию. e ClpB инкубировали с возрастающими концентрациями агрегатов G6PDH (обработанных 10 мкМ DnaK и 1 мкМ DnaJ).Измерения smFRET и анализ H 2 MM показали, что k 21 резко возросло с увеличением концентрации агрегата G6PDH (фиолетовый цвет), тогда как k 12 увеличилось лишь незначительно (желтая) (дополнительная таблица 9). Пунктирные линии в C-E предназначены только для направления взгляда. f Профили свободной энергии, рассчитанные из скоростей и модели, полученные из измерения smFRET и H 2 MM-анализа ClpB в присутствии агрегатов G6PDH. При увеличении концентрации агрегата G6PDH (цвет от светло-красного до темно-красного) состояние 1 стабилизируется, а барьер свободной энергии между состоянием 1 и 2 уменьшается (соотношение между состояниями см. В дополнительной таблице 10), что в основном влияет на переход из состояния 2 до состояния 1. Планки погрешностей представляют собой стандартные ошибки среднего. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных

. Подгонка данных на рис. 4a к простой функции изотермического связывания дает константу диссоциации 3 ± 1 мкМ, что хорошо согласуется с литературными значениями 63,71,72 .Интересно, что дезагрегационная активность ClpB также увеличивалась с концентрацией DnaK таким же образом, как и аналогичный K d (дополнительный рис. 18).

Эти результаты демонстрируют, что связывание DnaK не просто стабилизирует M домен в его активном состоянии, как предполагалось ранее 29,30 , но скорее изменяет динамическое равновесие между активным и неактивным состояниями в пользу первого. Это удивительно, поскольку ожидается, что скорости ассоциации и диссоциации DnaK будут значительно меньше измеренной скорости обмена (при насыщении k 12 равно 4300 ± 200 и k 21 равно 9100 ± 350, см. Инжир.9F, дополнительный рисунок 10B, F, J, дополнительная таблица 2 и дополнительная таблица 7). Кроме того, было высказано предположение, что DnaK не может связываться с неактивным состоянием из-за взаимодействий хвоста каждого M домена с главой своего соседа. Чтобы согласовать это кажущееся несоответствие, отметим, что эффективность FRET неактивного состояния немного увеличивалась в присутствии насыщающих концентраций DnaK (с 0,47 ± 0,01 до 0,50 ± 0,01), что, возможно, указывает на то, что связанный с DnaK M-домен не достигает полной параллельная конформация, характерная для неактивного состояния в несвязанном белке.

Два недавних крио-ЭМ исследования ClpB оспариваются друг с другом в отношении влияния связывания субстрата с ClpB на M домен. Deville et al. сообщили, что M домен принимает более неактивную горизонтальную структуру при связывании субстрата с ClpB в присутствии ATPγS 27 . Gates et al., С другой стороны, предположили, что конформационные изменения M-домена распространяются вокруг гексамера в соответствии с состоянием связывания нуклеотидов каждого протомера 28 . Поскольку наши собственные результаты демонстрируют, что конформационные изменения M-домена происходят намного быстрее, чем другие шаги в цикле ClpB, мы задались вопросом, может ли связывание субстрата с ClpB заблокировать M-домен в одном из его состояний.Мы сначала изучили динамику M домена в присутствии растворимого субстрата κ-казеина 73,74 . ClpB инкубировали с 2 мМ АТФ и 10–100 мкМ κ-казеина (диапазон концентраций, который приводил к значительному усилению активности АТФазы 74,75,76,77 , рис. 3а и дополнительный рис. 4С). Эксперименты smFRET показали, что в то время как k 12 уменьшалось как функция концентрации κ-казеина, k 21 увеличивалось, что приводило к накоплению популяции в активном состоянии (рис. 4c, d, дополнительный рисунок 7F, G, дополнительный рисунок 9G, дополнительный рисунок 10C, G, K, дополнительная таблица 2 и дополнительная таблица 8). В то же время активность АТФазы ClpB значительно увеличилась (рис. 3а и дополнительный рис. 4С). Это усиление, вероятно, связано с относительным увеличением популяции активного состояния M домена. Влияние динамики M-домена на активность ClpB будет дополнительно обсуждаться в следующем разделе.

Интересно, что подобная динамика М-домена наблюдалась, когда АТФ был заменен негидролизуемым вариантом АТФγS (дополнительный рис.19). Эти результаты лучше согласуются с наблюдениями Gates et al. 28 , которые сообщили о двух конформациях М-домена в аналогичных условиях, чем у Deville et al. 27 . Мы также протестировали эффект агрегированного субстрата, используя глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (G6PDH) в качестве модели 78,79 . Объем 900 нМ агрегатов G6PDH (см. «Методы») смешивали с 10 мкМ DnaK, 1 мкМ DnaJ и 100 мкМ АТФ с образованием комплексов 79,79,80 . Было протестировано влияние различных концентраций этих комплексов на динамику М-домена. Наблюдалось резкое увеличение как k 12 , так и k 21 (рис. 4e, дополнительная таблица 9). Однако k 21 увеличилось более значительно, чем k 12 , что привело к увеличению популяции в активном состоянии (рис. 4f и дополнительная таблица 10), аналогично эффекту κ-казеина. Важно отметить, что существенное увеличение динамики M-домена вряд ли может быть связано со свободным связыванием DnaK, поскольку последнее присутствовало здесь в низкой концентрации, хотя мы не можем исключить, что агрегатное связывание с DnaK увеличивает его сродство к ClpB. .

Взятые вместе, результаты экспериментов в присутствии растворимых и агрегированных субстратов указывают на сильную связь между связыванием субстрата и динамикой M-домена. Примечательно, что связывание субстрата с ClpB, которое, вероятно, включает ранее охарактеризованные сайты связывания субстрата на N-концевом домене 77 и в центральной поре NBD1 76 , оказывает аллостерический эффект, который смещает домен M в сторону активной конформации, повышение вероятности связывания DnaK для инициации дезагрегационной активности. Тем не менее, это происходит в то время, когда M-домен продолжает измерять как активное, так и неактивное состояния, фактически с возрастающей скоростью по сравнению с состоянием без подложки.

Изменение динамики M-домена влияет на функцию ClpB

Хорошо известно, что M домен важен для дезагрегационной функции ClpB. Действительно, было показано, что сшивки, которые препятствуют гибкости M-домена, снижают активность дезагрегации, но не активность АТФазы 26,35 . Поскольку теперь мы можем измерить динамику переходов домена M между активным и неактивным состояниями, интересно спросить, являются ли изменения в динамике причиной изменений активности ClpB.Чтобы ответить на этот вопрос, мы обратились к известным мутантам ClpB, которые активируют или репрессируют белок. Сначала мы создали мутант K347A 29,81 . Было высказано предположение, что солевой мостик между остатком K347 на NBD1 и отрицательно заряженным остатком (вероятно, D471) на M-домене разрушен у этого мутанта, что приводит к гиперактивации ClpB 27,29,31,81 . Измерения smFRET мутантного белка показали, что скорость перехода из состояния 1 в состояние 2 уменьшилась ( k 12 = 3100 ± 200 с −1 ), в то время как скорость перехода из состояния 2 в состояние 1 была почти такой же, как у WT ( k 21 = 5500 ± 200 с −1 ) (рис.5a, дополнительный рисунок 9H, дополнительная таблица 4). Это изменение приводит к увеличению популяции активного состояния по сравнению с неактивным состоянием (рис. 5b, дополнительная таблица 5). Примечательно, что этот мутант оказался гиперактивным с точки зрения его АТФазной активности (в 5 раз выше, чем WT), хотя он показал аналогичную дезагрегационную активность с WT (рис. 5c), как также сообщалось Hayashi et al. 82 .

Рис. 5

Мутации, которые изменяют динамику M-домена, влияют на функцию ClpB. a Профили свободной энергии M-домена, рассчитанные из H 2 MM популяций и скоростей, полученные из анализа измерений smFRET WT (оранжевый), K347A (синий) и E423A (зеленый). В K347A состояние 1 стабилизируется, в то время как в E423A состояние 1 дестабилизировано (для всех скоростей перехода (в с -1 ) и их ошибок см. Дополнительную таблицу 4, для соотношений населения см. Дополнительную таблицу 5). b Гистограммы эффективности FRET WT (оранжевый), K347A (синий) и E423A (зеленый).Гистограмма K347A смещена к более высоким значениям эффективности FRET, а гистограмма E423A смещена к более низким значениям. Вертикальные линии показывают значения эффективности FRET, соответствующие состояниям 1 и 2 из анализа H 2 MM измерения WT (рис. 1E). c Устойчивое состояние активности АТФазы и дезагрегации WT и двух мутантов, демонстрирующее, что изменения в динамике М-домена подавляют активность дезагрегации в E423A и ​​повышают активность АТФазы в K347A. Скорость дезагрегации выражается в концентрации G6PDH, извлеченной за минуту.Оранжевые кружки в ( c ) представляют отдельные повторы измерений. Планки погрешностей представляют собой стандартные ошибки среднего. Исходные данные представлены в виде файла исходных данных

Мы также мутировали остаток E423, который, как предполагалось, участвует в сети взаимодействий солевого мостика между доменом M и NBD1 той же субъединицы, а также между мотивом 1 M домен одной субъединицы и мотив 2 домена М соседней субъединицы 29,83 . H 2 MM-анализ результатов smFRET E423A показал значительное увеличение скорости перехода из состояния 1 в состояние 2 ( k 12 = 7000 ± 350 с −1 ), что привело к уменьшению популяции активное состояние (рис.5a, b, дополнительный рисунок 7H, I, дополнительный рисунок 9I, дополнительный рисунок 10D, H, L, дополнительная таблица 2 и дополнительные таблицы 4, 5). Действительно, этот мутант обладал почти такой же АТФазной активностью, что и WT, но полностью лишался дезагрегационной активности (фиг. 5c), вероятно, из-за недостаточного связывания DnaK 30 (присутствие DnaK не изменяло гистограмму FRET этого мутанта). Вышеупомянутые исследования с этими двумя мутантами и двумя мутантами Walker A (рис. 3) продемонстрировали, что изменения в относительной популяции активного состояния M-домена влияют на активность ClpB, изменяя либо скорость его АТФазы, либо скорость его дезагрегации. .

Рис. 6

Настройка соотношения популяции M-домена контролирует скорость дезагрегации ClpB. a Внутреннее регулирование: карта степени дезагрегации в зависимости от соотношения активной / неактивной популяции, полученная с различными мутантами ClpB, показывает высокий коэффициент корреляции 0,94 ± 0,3 на основе линейной аппроксимации точек данных (черная линия) . b Внешняя регуляция: активность дезагрегации увеличивается сигмоидально с соотношением популяции, здесь это контролируется концентрацией DnaK. c Схема парадигмы работы домена M как настраиваемого переключателя, определяющего уровень активности машины. Домен M находится в динамическом равновесии между активным и неактивным состояниями, а не статически заполняет одно из них. В присутствии только АТФ (слева) соотношение между состояниями составляет ~ 1, что облегчает доступ и связывание DnaK. Добавление DnaK или агрегатов (справа) изменяет соотношение между состояниями, стабилизируя активное состояние в режиме зависимости от дозы, что, в свою очередь, регулирует уровень активности машины.Столбики ошибок представляют собой стандартные ошибки среднего значения

Конформационные изменения в машине для слияния мембран вируса Эбола, вызванные pH, Ca2 + и связыванием рецептора

Abstract

Гликопротеин (GP) оболочки вируса Эбола (EBOV) представляет собой мембранную машину слияния, необходимую для проникновения вируса в клетки. После эндоцитоза EBOV домен GP1 расщепляется клеточными катепсинами в кислых эндосомах, удаляя гликановый колпачок и обнажая сайт связывания для рецептора Ниманна-Пика C1 (NPC1).Для входа требуется связывание NPC1 с расщепленным GP1. Как это взаимодействие транслируется в опосредованное GP2 слияние вирусных и эндосомных мембран, неизвестно. Здесь, используя анализ объемного флуоресцентного ослабления гашения и одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера (smFRET) -изображение, мы обнаружили, что кислый pH, Ca 2+ и связывание NPC1 синергетически вызывают конформационные изменения в GP2 и позволяют смешивать липосомный вирус с липосом . Кислый pH и Ca 2+ сдвигали конформационное равновесие GP2 в пользу промежуточного состояния, примированного для связывания NPC1.Расщепление гликанового кэпа на GP1 позволило GP2 перейти от обратимого промежуточного звена к необратимой конформации, что указывает на пост-слияние 6-спирального пучка; Связывание NPC1 дополнительно способствовало переходу к необратимой конформации. Таким образом, гликановый кэп GP1 может аллостерически защищать от инактивации EBOV преждевременным запуском GP2.

Образец цитирования: Das DK, Bulow U, Diehl WE, Durham ND, Senjobe F, Chandran K и др. (2020) Конформационные изменения в машине слияния мембран вируса Эбола, вызванные pH, Ca 2+ и связыванием рецепторов. PLoS Biol 18 (2): e3000626. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000626

Академический редактор: Грегори Меликян, Медицинский факультет Университета Эмори, США

Поступила: 16 сентября 2019 г .; Одобрена: 23 января 2020 г .; Опубликован: 10 февраля 2020 г.

Авторские права: © 2020 Das et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения DP2AI124384 (для J.B.M) и R01AI148784 (для J. L.). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Сокращения: Блам, β-лактамаза; EBOV, Вирус Эбола; eRF1, фактор высвобождения эукариот 1; FL, петля плавления; FRET, Фёрстеровский резонансный перенос энергии; GP, Гликопротеин оболочки EBOV; GPΔmuc, GP с удаленным муциноподобным доменом; HA, гемагглютинин; ВИЧ, Вирус иммунодефицита человека; ХМ, скрытое марковское моделирование; Доктор медицины, молекулярная динамика; НААДП, никотиновая кислота адениндинуклеотидфосфат; NPC1, Ниманн-Пик C1; ПЭГ, полиэтиленгликоль; RuV, Вирус краснухи; SERM, селективный модулятор рецептора эстрогена; smFRET, одномолекулярный резонансный перенос энергии Ферстера; sNPC1-C, растворимый домен C NPC1; ТШО *, транс, -циклоокт-2-ен-L-лизин; TIRF, флуоресценция полного внутреннего отражения; TPC, двухпористый канал; VSV, вирус везикулярного стоматита; 6HB, Пучок из 6 спиралей

Введение

Недавние и продолжающиеся вспышки болезни, вызванной вирусом Эбола (EBOV), в Западной и Центральной Африке привели к беспрецедентным человеческим жертвам. Постоянная угроза заражения EBOV подчеркивает важность разработки новых стратегий терапевтических и профилактических мер. Достижение этой цели выиграет от лучшего понимания механизма, с помощью которого EBOV проникает в клетки.

Гликопротеин оболочки EBOV (GP) находится на поверхности вириона и обеспечивает проникновение в клетки-хозяева [1,2]. В вирусопродуцирующей клетке полипептид GP0 посттрансляционно расщепляется протеазой фурина хозяина на дисульфидно-связанные домены GP1 и GP2 [3].GP1 облегчает прикрепление к клетке-хозяину. GP2 способствует слиянию вирусной и эндосомальной мембран по плохо определенному механизму. Вирион EBOV интернализуется за счет макропиноцитоза и переносится на поздние эндосомы [4–6]. Кислая среда активирует протеазы клеточного катепсина B и L, которые отщепляют муцин-подобные и гликановые кэп-домены от GP1 [7,8], обнажая лежащий в основе сайт связывания рецептора Ниманна-Пика C1 (NPC1) [9–12] . Неизвестно, играет ли кислая среда поздней эндосомы в запуске слияния, опосредованного интактным тримерным GP помимо активации катепсинов. Однако исследования изолированной слитой петли (FL) [13], которая находится рядом с N-концом GP2 в интактном тримере, и термодинамические измерения эктодомена GP выявили роль кислого pH [14]. NPC1 важен для входа EBOV [15,16], но основная роль взаимодействия GP-NPC1 в обеспечении активации GP2 для слияния мембран неизвестна.

В дополнение к NPC1 для проникновения EBOV в клетки-хозяева также требуется активность эндосомных двухпоровых каналов Ca 2+ (TPC) [17], которые запускаются никотиновой кислотой адениндинуклеотидфосфатом (NAADP) для высвобождения Ca 2. + из эндосом и лизосом [14].Ингибирование функции TPC предотвратило инфекцию EBOV, которая вовлекает эндосомный Ca 2+ в проникновение EBOV. Несколько одобренных препаратов, включая селективные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), обладают активностью против EBOV [18]. SERMs вызывают накопление Ca 2+ в эндолизосомах, что дополнительно указывает на роль Ca 2+ в проникновении EBOV [19]. Роль Ca 2+ в проникновении EBOV остается неизвестной, а природа его взаимодействия с интактным тримером GP не выяснена.Однако исследования изолированной FL GP предполагают, что Ca 2+ может облегчить взаимодействие с мембраной-мишенью [20].

Кристаллографические структурные данные показывают GP в конформации до слияния, в которой FL в GP2 располагается в гидрофобной щели внутри соседнего протомера [17-20]. Структуры GP в постфузионной конформации указывают на рефолдинг GP2, приводящий к образованию пучка из 6 спиралей (6HB) [21,22]. Таким образом, конечные точки GP-опосредованной реакции слияния мембран были описаны атомарно.Но последовательность событий, связывающих эти состояния и наличие каких-либо функциональных промежуточных состояний, не описана, хотя этот механизм может напоминать механизм гемагглютинина гриппа (HA), канонического вирусного фузогена I класса [23,24]. Согласно модели HA-опосредованного слияния мембран, FL д. Высвобождаться из гидрофобной щели и распространяться от поверхности вириона, получая доступ к целевой эндосомной мембране. Затем FL может вставляться в эндосомальную мембрану, образуя протяженный промежуточный продукт.Этот предполагаемый промежуточный продукт затем коллапсирует, сближая вирусную и эндосомную мембраны, способствуя их слиянию. Таким образом, постулируется крупномасштабный рефолдинг GP во время слияния вирусов, который включает драматические движения FL. До недавнего времени методология, позволяющая непосредственно визуализировать конформационные изменения в GP, связанные с слиянием, не была доступна.

Здесь мы исследовали роль Ca 2+ , кислого pH и связывания NPC1 в механизме GP-опосредованного слияния мембран.Сначала мы разработали анализ смешения липидов вируса и липосом на основе объемной флуоресценции. Этот подход продемонстрировал, что NPC1 важен для обеспечения даже низкого уровня смешивания липидов, при этом кислый pH и Ca 2+ увеличивают как степень, так и кинетику GP-опосредованного смешивания липидов. Затем мы разработали анализ изображения smFRET, чтобы непосредственно визуализировать конформационные изменения в домене GP2, с акцентом на визуализацию движения N-конца и проксимального FL. Наши результаты smFRET показали, что кислый pH и Ca 2+ синергетически способствуют конформационным изменениям в GP2, которые включают перемещение FL и N-конца GP2 от поверхности вириона к мембране-мишени.Эти конформационные изменения остаются полностью обратимыми до тех пор, пока гликановый кэп не будет удален с GP1, после чего GP может перейти в необратимую конформацию, которая может быть постфузионным 6HB. Связывание NPC1 ускоряет переход к необратимой конформации. Эти данные предлагают модель слияния, в которой низкий pH и концентрация Ca 2+ поздней эндосомы являются критическими для обеспечения эффективного входа EBOV. Более того, помимо закупорки рецептор-связывающего сайта, гликановый кэп аллостерически регулирует конформационную динамику GP2.Необходимость удаления гликанового колпачка и последующего связывания NPC1 для эффективного слияния мембран может предотвратить преждевременный запуск GP в неактивную конформацию после слияния в присутствии Ca 2+ при кислом pH.

Результаты

Низкий pH и Ca

2+ ускоряют GP-опосредованное смешивание липидов

Мы впервые воссоздали смешение липидов вируса и липосом с помощью анализа на основе флуоресценции, подхода, первоначально разработанного для изучения слияния вирусов гриппа [21]. Мы сформировали псевдовирионы, используя ядро ​​вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и EBOV GP из штамма Mayinga.Мы генетически удалили муцин-подобный домен из GP (GPΔmuc), который необходим для входа EBOV [22]. Затем гликановый колпачок был протеолитически удален с образованием GP CL , который является компетентным для связывания NPC1 (Материалы и методы) [9]. Вирусную мембрану метили самогашающейся концентрацией липофильного флуорофора DiO. Меченые мембраной вирионы сохраняли приблизительно 75% инфекционности по сравнению с немечеными вирионами (S1A фиг.). Меченые вирионы вводили в липосомы, покрытые растворимым доменом C NPC1 (sNPC1-C).При нейтральном pH мы наблюдали медленное расщепление DiO, что указывает на то, что GP CL способен неэффективно опосредовать смешивание липидов в этих условиях (рис. 1A). Включение физиологической концентрации Ca 2+ (0,5 мМ [23]) увеличивало скорость восстановления при нейтральном pH, хотя степень восстановления оставалась ограниченной (рис. 1A). В соответствии с данными визуализации живых клеток [15], не наблюдалось декухания в отсутствие sNPC1-C (фиг. 1A) или до протеолитического удаления гликанового колпачка (S2A фиг.).Это подтверждает, что наблюдаемое уменьшение густоты происходит из-за смешения липидов, опосредованного GP. Снижение pH до 6,2 и 5,2 приводило к увеличению степени разгерметизации. Даже при pH 5,2 в отсутствие sNPC1-C расщепления не происходило. Скорость расщепления оставалась столь же низкой в ​​отсутствие Ca 2+ , независимо от pH (рис. 1). Присутствие эквивалентных концентраций других двухвалентных катионов, Mg 2+ или Zn 2+ , не способствовало ускорению восстановления гашения при pH 5.2 в присутствии sNPC1-C (S2C на фиг.). Сравнительно устойчивое уменьшение гашения наблюдали в диапазоне физиологических концентраций Ca 2+ (0,1–0,5 мМ) при pH 5,2 в присутствии sNPC1-C (S2B фиг. ). Тем не менее, степень восстановления резко снижалась в присутствии повышенных концентраций Ca 2+ в диапазоне от 1 до 10 мМ (S2B фиг.). Соответственно, антагонисты канала Ca 2+ и SERM, которые вызывают накопление эндолизосомального Ca 2+ , ингибируют GP-опосредованное проникновение вируса (S3 Fig) [17-19].Эти данные демонстрируют, что связывание NPC1 необходимо даже для низкого уровня GP-опосредованного смешивания липидов и что физиологические концентрации Ca 2+ и кислый pH увеличивают степень и кинетику смешивания липидов.

Рис. 1. Для надежного смешивания липидов вируса с липосомами, опосредованного EBOV GP, требуется кислый pH, Ca 2+ и NPC1.

Отчеты о расхолаживании флуоресценции о смешивании липидов между мечеными GP CL -содержащими псевдовирионами и немечеными липосомами. Данные ослабления флуоресценции, полученные при указанном pH, представлены в виде процента ослабления гриппа, наблюдаемого при добавлении 1% тритона Х-100, который солюбилизирует вирусную мембрану, что приводит к максимальному уменьшению гущения. Данные показаны для липосом без (желтый) или с (оранжевый) sNPC1-C и в дополнительном присутствии 0,5 мМ CaCl 2 (синий). Данные отображаются как среднее значение 4 независимых измерений с полосами ошибок, отражающими стандартное отклонение. Все данные расщепления, полученные в присутствии sNPC1-C и Ca 2+ , соответствуют экспоненциальной функции A (1 -e -kt ) с подгоночными параметрами при pH7: A = 0,038 ± 0.001, k = 0,06 ± 0,02; pH6: A = 0,072 ± 0,002, k = 0,023 ± 0,003; и pH 5,2: A = 0,224 ± 0,006, k = 0,011 ± 0,001. Планки ошибок в подгонках представляют собой 95% доверительные интервалы. Все подходы имели R 2 > 0,9. Подборы не были хорошо определены для данных без Ca 2+ или sNPC1-C из-за ограниченного окна наблюдения. Числовые данные о смешивании липидов представлены в S1 Data. EBOV — вирус Эбола; GP, гликопротеин оболочки EBOV; NPC1, Ниманн-Пик C1; sNPC1-C, растворимый домен C NPC1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000626.g001

Место прикрепления флуорофоров к GP

Затем мы попытались понять индивидуальные и комбинированные эффекты pH, Ca 2+ и связывания NPC1 на конформационные изменения GP, связанные со слиянием мембран. С этой целью мы разработали анализ изображений smFRET, аналогичный тому, который был разработан для визуализации конформационных изменений HA гриппа [24] (рис. 2A). В контексте GPΔmuc мы прикрепили 1 флуорофор в положении 501 на N-конце GP2, проксимальнее FL [25,26].Мы прикрепили второй флуорофор в положении 610, между спиралями α4 и α5 и рядом с мотивом CX 6 CC в GP2 (рис. 2B) [27]. Мы выбрали эти сайты для отслеживания предсказанных конформационных изменений в GP2 во время слияния мембран, которые приводят к смещению N-конца и FL по отношению к основанию GP2. Структурные данные свидетельствуют о значительном увеличении расстояния (приблизительно 60–70 Å) между флуорофорами после перехода от конформации до слияния к конформации 6HB после слияния, что, как мы ожидали, приведет к снижению эффективности FRET [25,27–30]. Чтобы облегчить прикрепление флуорофора, мы включили 2 транс- -циклоокт-2-ен-L-лизин (TCO *) аминокислот в положения 501 и 610 посредством подавления янтарного стоп-кодона [31] (GP *; S4 и S5 фиг.). Затем мы сформировали псевдовирионы с ядром ВИЧ и GP или GP *. Псевдовирионы метили Су3- и Су5-тетразином циклоприсоединением Дильса-Альдера (Материалы и методы). По сравнению с GP дикого типа GP * и GP * -Cy3 / Cy5 сохраняли приблизительно 90% и 80% функциональности в проникновении вируса, соответственно, и чувствительность к нейтрализации антителом KZ52, которое связывает эпитоп на основании GP [25]; в альтернативном анализе GP * сохранял инфекционность лучше 60% по сравнению с GP (S1 фиг.).Эти анализы показывают, что GP * -Cy3 / Cy5 поддерживает почти нативную функциональность и глобальную префузионную конформацию, отражающую GP дикого типа.

Рис. 2. Анализ изображений smFRET для визуализации конформационных изменений EBOV GP, связанных со слиянием мембран.

(A) Экспериментальная установка для анализа изображений smFRET. (B) Структурная модель префузионного тримера GPΔmuc с одним протомером, меченным донорными и акцепторными флуорофорами (модель на основе PDB 5JQ3; Материалы и методы). Немеченые протомеры в тримере показаны серым цветом.GP2 (светло-синий) оборачивается вокруг GP1 (темно-бордовый), при этом FL находится в гидрофобной щели на границе раздела протомеров и контактирует с соседним протомером. Моделирование методом МД указывает на усредненное по времени расстояние между флуорофорами примерно 35 Å, что соответствует состоянию с высоким FRET. (C) Типичный пример траекторий флуоресценции (донор, зеленый; акцептор, красный) и smFRET (синий), полученных от отдельной молекулы GPΔmuc, что указывает на преобладающее состояние с высоким FRET при pH 7. Фотообесцвечивание флуорофора происходит примерно через 8 с.(D) Контурный график и гистограмма FRET, показывающие преобладающее состояние с высоким FRET в популяции молекул GPΔmuc при pH 7. Потеря сигнала FRET с течением времени, показанная на контурном графике, возникает из-за фотообесцвечивания флуорофоров. На гистограмму FRET наложены гауссовы аппроксимации трех наблюдаемых состояний FRET, идентифицированных с помощью HMM (материалы и методы). N указывает количество трасс FRET, скомпилированных в каждый контурный график и гистограмму. EBOV — вирус Эбола; ФЛ, сварочная петля; FRET, резонансный перенос энергии Фёрстера; GP, гликопротеин оболочки EBOV; GPΔmuc, GP с удаленным муциноподобным доменом; HMM, скрытое марковское моделирование; MD, молекулярная динамика; smFRET, одномолекулярный резонансный перенос энергии Фёрстера.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000626.g002

Низкий pH и расщепление гликанового кэпа способствует конформационным изменениям GP2

Для визуализации smFRET псевдовирионы были сформированы разбавлением GP * избытком GP дикого типа. Затем протомер GP * был помечен Cy3 и Cy5. Меченые вирионы были иммобилизованы на предметных стеклах кварцевого микроскопа и отображены с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) (материалы и методы). Отношение GP к GP * определяли таким образом, чтобы в большинстве вирионов наблюдалась только одна пара флуорофоров.Сначала мы изобразили конформационную динамику GPΔmuc при нейтральном pH в отсутствие Ca 2+ , условия, предсказанные в пользу префузионной конформации. Траектории smFRET, полученные от отдельных молекул GPΔmuc, показали преобладающее состояние с высоким FRET (0,95 ± 0,08), как и ожидалось на основании расстояния примерно 35 Å между флуорофорами, оцененного с помощью моделирования молекулярной динамики (МД) GPΔmuc в префузионной конформации [25, 27,28] (фиг. 2B и 2C и S6 фиг.). Подкисление pH до 6,5.2 и 4.5 привели к ступенчатому уменьшению занятости состояния с высоким FRET и увеличению занятости состояния с низким FRET (0,21 ± 0,08; рис. 3A). Мы также наблюдали заселенность в промежуточном состоянии FRET (0,52 ± 0,09), которое не реагировало на изменения pH. Эти данные указывают на то, что протонирование GP дестабилизирует конформацию до слияния и способствует конформации, в которых N-конец GP2 переместился в положения, которые увеличивают расстояние между 2 флуорофорами, вызывая состояние с низким FRET. Чтобы проверить эту интерпретацию, мы мутировали сайт расщепления фурином в GP. Это дает начало нерасщепленному предшественнику, GP0, на котором N-конец GP2 ковалентно связан с GP1. GP0 демонстрирует стабильно высокий FRET даже при кислом pH, подтверждая, что состояние с низким FRET возникает в результате конформационного изменения, которое смещает N-конец GP2 (S7 фиг.).

Рис. 3. Ca 2+ , кислый pH, удаление гликанового колпачка и связывание NPC1 дестабилизируют префузионную конформацию GP.

(A) Контурные графики, отображающие распределение FRET из популяции отдельных молекул GPΔmuc при указанном pH и в отсутствие и в присутствии 0.5 мМ CaCl 2 . Также для каждого контурного графика показана соответствующая гистограмма с наложенными гауссовыми подгонками для каждого из 3 состояний FRET. N указывает количество трасс FRET, скомпилированных в каждый контурный график и гистограмму. Справа показаны уровни занятости в высоком (синий), промежуточном (оранжевый) и низком FRET (желтый) состояниях, которые отображаются как среднее значение трех независимых групп кривых, с полосами погрешностей, отражающими стандартную ошибку. . Занятости в трех состояниях FRET нормализованы так, что их сумма равна 100%.(B) Те же данные для GP CL и (C) GP CL , связанных с sNPC1-C. FRET, резонансный перенос энергии Фёрстера; GP, гликопротеин оболочки EBOV; GPΔmuc, GP с удаленным муциноподобным доменом; NPC1, Ниманн-Пик C1; sNPC1-C, растворимый домен C NPC1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000626.g003

Удаление гликанового колпачка является важным этапом во время записи EBOV, потому что оно делает доступным сайт связывания NPC1 и может также способствовать конформационным изменениям в GP, связанных с слияние мембран [9,32,33].Следовательно, после удаления гликанового кэпа мы оценили конформационное равновесие GP CL как функцию pH с помощью smFRET. При pH 7 GP CL преимущественно занимал конформацию до слияния с высоким FRET, как видно для GPΔmuc (фиг. 3B). Снижение pH уменьшало занятость с высоким FRET и одновременно увеличивало занятость с низким FRET быстрее, чем для GPΔmuc (рис. 3B). Опять же, промежуточный FRET наблюдался, но не реагировал на изменения pH. Эти данные предполагают, что удаление гликанового кэпа делает конформацию GP2 более чувствительной к изменениям pH.Иммуноферментные анализы продемонстрировали, что NPC1 связывается с GP более легко при кислом pH (S8, фиг.). Таким образом, индуцированное кислым pH конформационное изменение GP может способствовать связыванию NPC1.

Обратимость конформационных изменений GP2

Учитывая, что Ca 2+ ускоряет скорость смешивания липосом вируса с липосомами, мы попытались определить, вызывает ли он конформационное изменение GP2. Поэтому мы визуализировали GPΔmuc в присутствии 0,5 мМ Ca 2+ . Во всем диапазоне pH, протестированном здесь, Ca 2+ дестабилизировал состояние GPΔmuc до слияния с высоким FRET и увеличивал занятость при низком FRET (рис. 3A, внизу).Для GP CL , Ca 2+ вызывал заметное снижение высокого FRET и увеличение занятости с низким FRET при нейтральном pH с той же тенденцией во всем диапазоне pH (рис. 3B, внизу). Как для GPΔmuc, так и для GP CL при pH 7 и 4,5 действие Ca 2+ было обратимым; введение ЭДТА в секвестр Ca 2+ возвращало как GPΔmuc, так и GP CL к конформационному равновесию, наблюдаемому до добавления Ca 2+ (S9 фиг.).

В соответствии с экспериментами по визуализации живых клеток, смешивание липосом вируса с липосомами требует присутствия sNPC1-C [15,16].Таким образом, мы предсказали, что связывание sNPC1-C будет вызывать конформационные изменения в GP2, связанные с слиянием мембран. Чтобы проверить это предсказание, мы инкубировали вирионы, содержащие GP CL , с sNPC1-C перед визуализацией smFRET. Даже при нейтральном pH, sNPC1-C вызывал резкое сокращение занятости в состоянии с высоким FRET и увеличивал занятость в состоянии с низким FRET (рис. 3C). Снижение pH уменьшило заполняемость помещений с высоким FRET. Как и было предсказано на основании данных о смешивании липидов вируса и липосом (рис. 1), наблюдаемое состояние перед слиянием с высоким FRET было дополнительно снижено добавлением Ca 2+ во всем диапазоне исследованных значений pH (рис. 3C).

Затем мы спросили, может ли GP2 вернуться из состояния с низким FRET после кратковременного воздействия кислого pH. Мы подвергали вирус воздействию pH 4,5 в течение 10 минут перед возвращением к нейтральному pH. В отсутствие Ca 2+ , GPΔmuc полностью вернулся к высокому FRET после восстановления нейтрального pH (фиг. 4A). Полная обратимость GPΔmuc поддерживалась включением Ca 2+ (фиг. 4A). Таким образом, состояние с низким FRET, стабилизированное кислым pH и Ca 2+ , отражает обратимую конформацию GPΔmuc.Напротив, GP CL только частично вернулся к преобладающему высокому FRET после восстановления нейтрального pH, и возникло необратимое состояние низкого FRET. Такая же необратимость наблюдалась в присутствии Ca 2+ (рис. 4B). То есть низкий pH и Ca 2+ способствуют переходу GP CL в необратимое состояние с низким FRET, которое отличается от обратимого состояния с низким FRET, наблюдаемого для GPΔmuc. Чтобы проверить, коррелирует ли восстановление состояния перед слиянием с высоким FRET со способностью GP опосредовать смешение липидов, мы подвергли вирионы, содержащие GPΔmuc, до pH 4.5 в течение 10 мин с последующим восстановлением нейтрального pH и отщеплением гликанового колпачка. В этих условиях GP CL сохранял свою способность опосредовать смешивание липидов вируса с липосомами в анализе на снижение густоты (S2D фиг.). Такое же поддержание GP-опосредованного смешивания липидов наблюдалось в присутствии Ca 2+ . Однако, когда гликановый колпачок удаляли перед инкубацией при pH 4,5 в течение 10 минут, GP CL опосредовал только низкий уровень смешения липидов, независимо от того, присутствовал ли Ca 2+ (S2D фиг.).Таким образом, восстановление состояния с высоким FRET перед слиянием коррелирует со способностью GP опосредовать смешение липидов. Только частичная обратимость состояния с низким FRET наблюдалась после предварительной инкубации с sNPC1-C при pH 4,5 в течение 10 мин. Состояние с низким FRET было полностью необратимым при дополнительном включении Ca 2+ (рис. 4C). Таким образом, инкубация с sNPC1-C и Ca 2+ при кислом pH индуцировала переход GP CL в конформацию, которую нельзя было обратить путем восстановления нейтрального pH.

Рис. 4. Связывание NPC1 вызывает переход к необратимой конформации GP.

(A) Контурные графики и гистограммы FRET, отображающие распределение FRET в популяции наблюдаемых молекул GPΔmuc в указанных условиях, либо при pH 7, pH 4,5, либо при pH 7 после 10-минутного воздействия pH 4,5, как показано шкала времени вверху. N указывает количество трасс FRET, скомпилированных в каждый контурный график и гистограмму. Также справа показаны уровни занятости при высоком и низком FRET при указанных условиях, которые отображаются как среднее значение трех независимых групп графиков, с полосами ошибок, отражающими стандартную ошибку.(B) Те же данные для GP CL и (C) GP CL с sNPC1. FRET, резонансный перенос энергии Фёрстера; GP, гликопротеин оболочки EBOV; GPΔmuc, GP с удаленным муциноподобным доменом; NPC1, Ниманн-Пик C1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000626.g004

Discussion

Это исследование предоставляет первые прямые наблюдения конформационных изменений интактных тримерных EBOV GP, связанных со слиянием мембран. Наши результаты предлагают модель GP-опосредованного слияния мембран с существенной ролью кислого pH, удаления гликанового колпачка, связывания NPC1 и эндосомального Ca 2+ (Рис. 5).Согласно этой модели, до слияния мембран GP имеет доступ как минимум к 3 конформациям. Учитывая близость сайта присоединения флуорофора на N-конце GP2 к FL, наблюдаемые здесь состояния FRET, вероятно, отражают конформации, в которых FL занимает различные положения. Во-первых, состояние с высоким FRET согласуется с конформацией до слияния, которая была описана с помощью рентгеновской кристаллографии [25,27]. Во-вторых, промежуточное состояние FRET может отражать локализованную перестройку FL, которая предшествует предполагаемому крупномасштабному смещению, предсказанному канонической моделью слияния вирусных мембран класса I [34]. Альтернативно, поскольку на стабильность промежуточного состояния FRET не влияет ни одна из переменных, рассмотренных в этом исследовании, мы не можем исключить возможность того, что оно отражает внепутную конформацию, которая не имеет отношения к механизму слияния мембран. В-третьих, префузионный GP имеет доступ к обратимому состоянию с низким FRET, в котором N-конец GP2 и FL переместились от оси тримера или вирусной мембраны. Наши наблюдения показывают, что кислый pH и Ca 2+ непосредственно инициируют конформационное ремоделирование GP, сдвигая равновесие в пользу обратимой конформации с низким FRET.Важно отметить, что перед удалением гликанового колпачка префузионная конформация с высоким FRET реформируется при восстановлении нейтрального pH или удалении Ca 2+ . Мы ожидаем, что переход к постфузионному 6HB будет необратимым из-за термодинамической стабильности подобных оболочечных GPs в этой конформации [35]. Таким образом, Ca 2+ и кислый pH сами по себе не могут эффективно способствовать переходу GPΔmuc в постфузионную конформацию 6HB во временной шкале наших измерений. Скорее, мы предполагаем, что обратимое состояние с низким FRET является промежуточной конформацией, которая находится на пути к постфузионному 6HB.Эта конформация может включать положение FL, в котором она может взаимодействовать с целевой мембраной. Стабилизация промежуточной конформации на пути может указывать на механизм, с помощью которого кислый pH и Ca 2+ способствуют смешению липидов вируса с липосомами.

Рис. 5. Механистическая модель GP-опосредованного слияния мембран.

Настоящие наблюдения согласуются с моделью, в которой кислый pH и Ca 2+ сдвигают конформационное равновесие до слияния GP в пользу конформации, оптимальной для связывания NPC1.В этой конформации N-конец GP2 и FL переместились из расщелины перед слиянием в положение, удаленное от вирусной мембраны. Затем NPC1 запускает необратимый переход к конформации после слияния, необходимой для смешивания липосом с вирусом. Промежуточное состояние FRET может представлять собой дополнительный промежуточный продукт на пути или конформацию, не относящуюся к механизму слияния вируса. ФЛ, сварочная петля; FRET, резонансный перенос энергии Фёрстера; GP, гликопротеин оболочки EBOV; NPC1, Ниманн-Пик C1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000626.g005

В дополнение к опосредованию конформационного равновесия ГП перед слиянием кислый рН эндосомы активирует протеазы клеточного катепсина. Катепсины удаляют муцин-подобные и гликановые кэп-домены из GP1, обнажая рецептор-связывающий сайт [9]. Наши результаты подтверждают критическую роль гликанового кэпа, помимо затенения сайта связывания рецептора. Расщепление гликанового кэпа сделало GP более чувствительным к снижению pH, облегчая переход GP2 в конформации с низким FRET.Параллельное исследование изображения GP с помощью smFRET с флуорофорами, прикрепленными к N концам GP1 и GP2, сообщило о конформационных изменениях GP1 при нейтральном pH при расщеплении гликанового кэпа [36]. Взятые вместе, эти исследования демонстрируют, что расщепление гликанового кэпа вызывает изменение GP1, что, в свою очередь, обеспечивает гибкость GP2. При подкислении N-конец GP2 и FL обладают большей способностью занимать положения вне гидрофобной щели в соседнем протомере. В частности, удаление гликанового кэпа позволяет GP2 переходить в конформацию с низким FRET, что не является обратимым после восстановления нейтрального pH.Таким образом, гликановый колпачок помогает аллостерически регулировать время конформационных изменений GP2, гарантируя, что GP не сработает преждевременно до прибытия вириона в позднюю эндосому, которая содержит катепсины и NPC1. Этот предполагаемый механизм напоминает белок prM вируса Денге, который предотвращает запуск E GP до протеолитического расщепления prM [37].

Удаление гликанового колпачка также играет хорошо установленную роль в разрешении связывания GP с рецептором NPC1, что является важным этапом в проникновении EBOV [9–11,15,16].В соответствии с этими наблюдениями мы находим, что связывание NPC1 важно для GP-опосредованного смешивания липидов. Наши данные smFRET предоставляют дополнительную информацию о том, что NPC1 способствует переходу GP2 от обратимой конформации с низким FRET к необратимой конформации с низким FRET. Сайт связывания NPC1 в GP1 отделен от FL в GP2 примерно на 20 Å, что указывает на аллостерическую связь между этими функциональными центрами. Мы задокументировали аналогичную связь между сайтом связывания рецептора и гибридным пептидом в исследовании HA гриппа [24].

Хотя сайт связывания Ca 2+ с интактным GP в настоящее время неизвестен, одной из возможностей является прямое взаимодействие с FL, как ранее было продемонстрировано в исследовании изолированного FL [20]. Анализ последовательности EBOV GP, а также других филовирусных GP показывает универсально консервативные кислотные остатки в FL (D521, E522 и E540). Координирующий Ca 2+ может нейтрализовать отрицательный заряд этих остатков, вызывая эффективное высвобождение FL из гидрофобной щели.Эта потенциальная нейтрализация заряда может также способствовать внедрению FL в мембрану-мишень, как описано для GP вируса краснухи (RuV) E1 [38]. Ca 2+ может также стабилизировать локальную конформацию FL, оптимальную для встраивания в целевую мембрану. RuV E1 и EBOV GP теперь предоставляют 2 примера вирусных GPs, которые воспринимают клеточный Ca 2+ как средство регулирования времени и эффективности слияния, аналогично клеточному синаптотагмину, который способствует слиянию синаптических пузырьков [39].

EBOV имеет относительно высокую концентрацию Ca 2+ во внеклеточном пространстве (приблизительно 1-2 мМ). После интернализации посредством эндоцитоза концентрация Ca 2+ снижается примерно до мкМ из-за действия pH-зависимых каналов Ca 2+ [40]. Оценки концентрации Ca 2+ дальше по эндоцитарному пути широко варьируют (от 3 до 600 мкМ) [23,40,41]. Предыдущие исследования документально подтвердили важность входа EBOV в каналы TPC [17], которые высвобождают Ca 2+ из поздней эндосомы [14].Ингибирование функции TPC предотвратило заражение EBOV. Сходным образом SERM нарушают отток Ca 2+ из поздней эндосомы, что может объяснить их активность против EBOV [18,19]. Удаление Ca 2+ из эндосомы посредством хелатирования также снижает GP-опосредованное проникновение EBOV [19]. Эти исследования явно указывают на то, что эндосомальный Ca 2+ является важным регулятором входа EBOV. Мы наблюдали, что максимальное GP-опосредованное смешение липидов происходило в диапазоне от 0,1 до 0,5 мМ Ca 2+ , тогда как избыток Ca 2+ (> 1 мМ) ограничивал степень смешения липидов.Одно из возможных объяснений состоит в том, что повышенная концентрация Ca 2+ инактивирует GP из-за преждевременного запуска перед эффективным взаимодействием с NPC1 или переходом в конформацию, не способную к слиянию. В этом случае присутствие гликанового кэпа на GP до интернализации в эндосому может предотвратить запуск во внеклеточном пространстве, обогащенном Ca 2+ . Альтернативно, повышенная концентрация Ca 2+ может ингибировать конформационные изменения GP, связанные со слиянием.

Как показано на рис. 5, наши данные согласуются с моделью, в которой кислый pH и Ca 2+ смещают конформационное равновесие в сторону состояний, в которых N-конец GP2 и FL перемещаются из своих положений в префузионной конформации. Эти конформационные изменения остаются обратимыми до тех пор, пока гликановый кэп не будет удален. Связывание NPC1 затем приводит GP в необратимую конформацию с низким FRET. Эта конформация может отражать пост-слияние 6HB или конформацию, предшествующую 6HB в пути слияния.Представленные здесь данные по ослаблению флуоресценции не позволяют различить образование пор гемифузии и слияния. Более того, не все события гемифузии переходят к образованию пор слияния [33,34]. Таким образом, текущие наблюдения не уточняют, достаточны ли кислый pH, Ca 2+ и связывание NPC1 для запуска GP-опосредованного слияния мембран или необходимы дополнительные факторы [15]. Какой бы ни была идентичность необратимого состояния с низким FRET, поддержание обратимости в конформации GP коррелирует со способностью GP опосредовать смешение липидов. Это наблюдение подчеркивает важность предполагаемой роли гликанового кэпа в предотвращении преждевременного перехода в необратимое состояние с низким FRET. Будущие исследования необходимы для генерации механистического понимания того, как связывание гликанового кэпа и NPC1 в GP1 обеспечивает синхронизацию конформационных событий GP2. Точно так же определение механизма, с помощью которого Ca 2+ может быть как ускорителем, так и ингибитором GP-опосредованного слияния, потребует дальнейшего исследования. Представленный подход к визуализации smFRET будет ценным инструментом в прояснении этих вопросов.

Материалы и методы

Получение псевдовирионов с помощью EBOV GP и ядра HIV-1

Псевдотипированные вирионы получали путем трансфекции клеток HEK293T плазмидами, кодирующими EBOV GPΔmuc из штамма Mayinga и GagPol ВИЧ-1. Клетки поддерживали в среде DMEM (Thermo Fisher, Waltham, MA) с добавлением 10% FBS (Gemini Bio, West Sacramento, CA), 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина (Thermo Fisher, Waltham, MA) и 2 мМ L-глутамина. (Термо Фишер, Уолтем, Массачусетс).Через 12 ч после трансфекции среду заменяли. Вирусный супернатант собирали через 48 часов после трансфекции, пропускали через фильтр 0,45 мкм для удаления клеточного дебриса и концентрировали 10-кратным центрифугированием в течение 2 часов при 20000 г на подушке из 10% сахарозы. Затем с помощью вестерн-блоттинга было показано, что вирусные частицы являются положительными по EBOV GP и ВИЧ-1 p24. GPΔmuc, содержащийся на поверхности вириона, протеолитически расщеплялся на GP1 и GP2 на> 90%. Для получения вирионов с GP CL частицы инкубировали с термолизином (0.2 мг / мл) из Bacillus thermoproteolyticus (Roche, Базель, Швейцария) при 37 ºC в течение 1 ч, как описано Миллером и его коллегами [9]. Вирионы, содержащие GP0, получали таким же образом после мутации нативного сайта расщепления фурином в GPΔmuc (RRTRR) в GGGGG с помощью ПЦР с перекрывающимся удлинением, которая отменяла расщепление GP1 и GP2.

Включение неканонической аминокислоты в EBOV GP *

Мы включили 2 TCO * ncAA в домен GP2 EBOV GPΔmuc посредством супрессии янтарного стоп-кодона [31] (S4 и S5 фиг. ).С этой целью мы ввели кодоны TAG в положение 501 GP2 сразу после сайта расщепления фурином и в положение 610 после мотива CC 6 посредством сайт-направленного мутагенеза. Трансляция происходит через кодоны UAG на мРНК только в присутствии ортогональной тРНК (тРНК Pyl ), которая распознает кодон UAG, и соответствующей аминоацил-тРНК синтетазы (NESPylRS AF ). NESPylRS AF аминоацилирует супрессорную тРНК с TCO *, облегчая ее включение в определенных местах в GP, образуя GP *.Эффективность подавления янтаря ограничена из-за конкуренции эукариотического фактора высвобождения 1 (eRF1) с тРНК Pyl [42]. Экспрессия доминантно-отрицательного мутанта eRF1 E55D увеличивала эффективность супрессии янтаря.

Прохождение янтарных стоп-кодонов оценивали в контексте мутанта GP0, так что обнаружение укорочения в положениях, проксимальных к гибридному пептиду, не осложнялось присутствием GP1. Трансляцию полноразмерного GP0 EBOV сначала оценивали путем трансфекции клеток HEK293T плазмидами, кодирующими TAG-мутированный GP0 и NESPylRS AF / тРНК Pyl , eRF1 E55D и Gag-Pol ВИЧ-1. В среду роста добавляли 0,5 мМ TCO * ncAA (SiChem, Бремен, Германия). Через 48 часов после трансфекции вирус собирали, концентрировали центрифугированием и оценивали с помощью вестерн-блоттинга (S5 фиг.). В присутствии кодонов UAG в положениях 501 и 610 полноразмерный GP0 * транслировался с эффективностью приблизительно от 5% до 10% по сравнению с GP дикого типа и зависел от присутствия NESPylRS AF / тРНК Pyl. , TCO * и eRF1 (E55D). Необработанные кляксы представлены в S1 Raw Images.

Анализы слияния псевдовирусов и инфекционности

Функцию вариантов GP в слиянии мембран и проникновении вируса оценивали двумя способами. Во-первых, мы специально протестировали функциональность в слиянии мембран с использованием ферментативного анализа на основе β-лактамазы (Blam) (LiveBlazer FRET B / G kit, Thermo Fisher, Waltham, MA) [43]. Вирионы с GP или GP * на их поверхности были образованы, как описано выше, с дополнительной плазмидой, кодирующей Blam, слитой с белком Vpr ВИЧ-1. Вирионы с GP * -Cy3 / Cy5 были образованы путем мечения GP *, как описано ниже.Следует отметить, что с целью оценки функциональности GP * и GP * -Cy3-Cy5 псевдовирионы не формировались с избытком GP дикого типа, как это делалось в экспериментах по визуализации smFRET. Вирионы собирали и концентрировали центрифугированием, как описано выше. Осадки вируса ресуспендировали в среде RPMI (Thermo Fisher, Waltham, MA; с добавлением 0,2% BSA, 10 мМ Hepes [pH 7]) и инкубировали с предварительно охлажденными клетками Vero в течение 1 ч в 96-луночном планшете на льду для облегчения прикрепления вируса. к поверхности клетки.Планшет центрифугировали 30 мин при 3700 об / мин при 4 ° C. Несвязанный вирус удаляли промыванием клеток средой DMEM, не содержащей Ca 2+ . Клетки инкубировали при 37 ° C в течение 90 минут, чтобы обеспечить проникновение вируса в полную среду DMEM, не содержащую Ca 2+ , с добавлением 10 мМ HEPES (pH 7), 0,2% БСА и в отсутствие или в присутствии 0,5 мМ CaCl. 2 . Затем клетки инкубировали в полной среде DMEM (с Ca 2+ ), содержащей 20 мМ NH 4 Cl, в течение 90 минут при 37 ° C.

Затем клетки загружали флуорофором CCF4-AM в присутствии 250 мМ пробенецида при 11 ° C в течение ночи, и инфекцию контролировали путем определения расщепления CCF4-AM по Blam с использованием планшет-ридера Synergy HT (Biotek, Winooski , ВТ).Частицы вируса, содержащие GP *, продемонстрировали слияние примерно на 90% эффективности GP дикого типа. Альтернативно, вирусные частицы инкубировали с 50 мкг / мл антитела KZ52 перед введением в клетки Vero, что приводило к нейтрализации GP * -содержащего вируса так же эффективно, как и вируса, содержащего GP дикого типа.

Во втором анализе GP был псевдотипирован на ядре вируса везикулярного стоматита (VSV), содержащем репортер экспрессии GFP, как описано Whitt [44]. 293T трансфицировали GP с использованием реагента для трансфекции PEI.Трансфицированные 293T затем инфицировали исходными вирусами VSV-ΔG-GFP при MOI, равном 3. Вирусосодержащий супернатант собирали через 24 часа после инфицирования, пропускали через фильтр 0,45 мкм, разделяли на аликвоты и замораживали при -80 ° C. Размороженные аликвоты либо метили, либо имитировали метку DiD, как описано ниже для DiO, и использовали для заражения наивных 293T в 6-луночных чашках в течение 5 часов. DiD использовался для оценки эффектов липофильного флуорофора, поскольку он спектрально отличается от GFP и химически подобен DiO, который использовался в анализе смешивания липосом с вирусом.Клетки собирали и ресуспендировали в PBS на льду и оценивали экспрессию GFP с помощью проточной цитометрии.

Наконец, чтобы оценить GP-опосредованное проникновение вируса в присутствии ингибирующих соединений, были получены запасы eGFP, экспрессирующие вирионы ВИЧ, псевдотипированные GP вируса Эбола, как ранее подробно описали Маркосян и его коллеги [37]. Вкратце, 6 × 10 5 клеток HEK293 высевали в 6-луночные планшеты и через 24 часа трансфицировали с помощью TransIT-LT1 следующими плазмидами: 1250 нг лентивирусного вектора для переноса GFP pNL-EGFP / CMV-WPREΔU3 [42 ] (Addgene 17579, Watertown, MA), 930 нг самоинактивирующегося лентивирусного упаковывающего вектора второго поколения pCD / NL-BH * ΔΔΔ [43] и 310 нг плазмиды экспрессии GP [37] (Addgene 86021). При инфекциях клетки U2OS обрабатывали в течение 2 ч указанной концентрацией верапамила, энкломифена, тетрандрина или ДМСО (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури). После этого добавляли вирус, и клетки инкубировали в течение ночи в присутствии как вируса, так и лекарства. Следующую утреннюю среду заменяли свежей DMEM и инкубировали в течение дополнительных 48 ч, после чего клетки собирали и экспрессию GFP оценивали с помощью проточной цитометрии. Альтернативно, вирус и тетрандрин инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут перед инкубацией с клетками-мишенями U2OS в течение 2 часов на льду, после чего вирус удаляли и клетки культивировали в течение 72 часов в свежей среде DMEM.Процент GFP-положительных клеток в обработанных лекарственным препаратом образцах сравнивали с таковым, наблюдаемым при обработке ДМСО, и кривые ингибирования строили в Prism 8 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния). Все числовые данные об инфекционности и слиянии представлены в S1 Data.

Анализ смешивания липосом и вирусов

Анализ in vitro, используемый для исследования липидного смешения вирионов и липосом, был описан ранее для исследования HA [24]. Вкратце, вирионы с GP CL или GPΔmuc инкубировали с 50 мкМ DiO в течение 2 ч при комнатной температуре для мечения вирусной мембраны.Меченые вирионы очищали ультрацентрифугированием в градиенте плотности в градиенте от 6% до 30% Optiprep (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) при 35000 об / мин в течение 1 часа. Отдельно были сформированы липосомы с соотношением 4: 4: 2: 0,5: 0,1 1,2, диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DOPC; Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), 1-пальмитоил-2 -олеоил-глицеро-3-фосфохолин (POPC; Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), холестерин (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), фосфатидилсерин (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) и липид Ni-NTA DGS ( Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL).Липиды растворяли в хлороформе и упаривали в потоке газообразного Ar. Затем высушенную липидную пленку суспендировали в фосфатном буфере (pH 7,5) до конечной концентрации 10 мг / мл. Липосомы экструдировали через поликарбонатный мембранный фильтр с размером пор 200 нм. Чтобы покрыть липосому рецептором, липосомы инкубировали с sNPC1-C, меченным полигистидином. Ni-NTA DGS в липосомах присутствовал в 100-кратном молярном избытке по сравнению с sNPC1-C, чтобы гарантировать минимальный несвязанный sNPC1-C.

Липосомы (с или без sNPC1-C) объединяли с DiO-меченными вирионами, содержащими либо GP CL , либо GPΔmuc, и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут при pH 7.5. Затем добавляли буфер путем остановки потока для доведения pH до желаемого уровня с последующим измерением флуоресценции DiO в зависимости от времени. Для измерения влияния Ca 2+ на кинетику разжижения CaCl 2 добавляли к смеси вирус-липосомы в желаемой концентрации. DiO возбуждали при 450 нм, и флуоресценцию регистрировали при 525 нм с интервалами 1 с в течение 300 с при комнатной температуре во флуориметре QuantaMaster 400 (Horiba, Киото, Япония). Данные декодирования соответствовали экспоненциальной функции A (1- e -kt ) с использованием алгоритма наименьших квадратов в Matlab (MathWorks, Natick, MA). Все числовые данные о смешивании липидов представлены в S1 Data.

Экспрессия и очистка sNPC1-C

sNPC1-C, содержащий N-концевую полигистидиновую метку, экспрессировали трансфекцией клеток HEK293 Freestyle (Thermo Fisher, Waltham, MA) полиэтиленимином (PEI MAX, Polysciences, Warrington, PA), как описано Миллером и его коллегами [9]. Через шесть дней после трансфекции собирали супернатант клеточной культуры, содержащий секретированный sNPC1-C. sNPC1-C экстрагировали из супернатанта путем пропускания через гранулы агарозы Ni-NTA (Thermo Fisher, Waltham, MA).Гранулы Ni-NTA, связанные с sNPC1-C, промывали и элюировали стандартными способами. Очищенный sNPC1-C подвергали диализу в 20 мМ трис-HCl, 100 мМ NaCl, 2 мМ β-меркаптоэтанол и 10% глицерин с последующим концентрированием на центробежных фильтрах Vivaspin 6 (Sartorius, Göttingen, Германия). Очищенный sNPC1-C хранили при -80 ° C до использования.

Флуоресцентная маркировка EBOV GP * для визуализации smFRET

Для визуализации smFRET вирионы были сформированы в среднем с одним протомером GP * среди распределения GP дикого типа, как это было сделано ранее для исследований smFRET визуализации HA гриппа и Env ВИЧ-1 [24,45]. Вкратце, клетки HEK293T трансфицировали плазмидами, кодирующими GP * и GP дикого типа, в соотношении 1: 5, и плазмид, кодирующих Gag-Pol ВИЧ-1, NESPylRS AF / тРНК Pyl и eRF1 (E55D), и выращены в присутствии 0,5 мМ TCO * ncAA. Учитывая ограниченную эффективность (приблизительно 10%) считывания через 2 стоп-кодона во время трансляции GP *, соотношение GP * к соотношению плазмид GP дикого типа соответствует примерно 50-кратному избытку белка GP дикого типа над GP *. белок. Вирус собирали, концентрировали центрифугированием и ресуспендировали в фосфатном буфере (pH 7.5). Затем вирионы метили инкубацией с 2 ​​мМ 3- (п-бензиламино) -1,2,4,5-тетразин-Cy3 и 2 мМ 3- (п-бензиламино) -1,2,4,5-тетразин-Cy5. в течение 10 минут при 37 ° C (Jena Bioscience, Йена, Германия). Поскольку мы ввели один и тот же ncAA в положения 501 и 610 GP2, 50% меченых вирионов содержали либо 2 флуорофора Cy3, либо 2 флуорофора Cy5, которые были легко исключены из рассмотрения во время анализа (см. Ниже). После реакции мечения добавляли DSPE-PEG 2000 -биотин (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) и инкубировали с вирионами в течение 30 мин при конечной концентрации 6 мкМ (0.02 мг / мл). Меченый вирус очищали от несвязанного красителя и липидов путем ультрацентрифугирования в течение 1 часа при 35000 об / мин в градиенте от 6 до 30% Optiprep (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) в 50 мМ Трис (pH 7,4), 100 мМ NaCl. . Градиент фракционировали, и фракции, содержащие вирус, идентифицировали вестерн-блоттингом p24. Очищенный флуоресцентно меченый вирус хранили при -80 ° C для использования в экспериментах по визуализации smFRET.

Анализ изображений smFRET с микроскопией TIRF

экспериментов по визуализации smFRET были выполнены на специально сконструированном призменном микроскопе TIRF, как описано ранее Дасом и его коллегами [24].Флуоресцентно меченые вирионы иммобилизовали на кварцевых предметных стеклах, пассивированных полиэтиленгликолем (PEG), покрытых стрептавидином, и помещали на автоматический столик XY (Applied Scientific Instrumentation, Юджин, Орегон). Связанные с поверхностью вирионы освещались затухающим полем, создаваемым полным внутренним отражением лазера с длиной волны 532 нм (Coherent, Санта-Клара, Калифорния) при интенсивности 0,2 кВт / см 2 . Флуоресцентное излучение собирали через водно-иммерсионный объектив 1,2-NA 60X (Olympus, Токио, Япония) и пропускали через дихроичный фильтр T550LPXR (Chroma) для удаления рассеянного лазерного света.Эмиссию донора и акцептора разделяли с помощью дихроичного фильтра T635LPXR (Chroma, Bellows Falls, VT) и отображали на двух параллельных камерах ORCA-Flash5.0-V2 sCMOS (Hamamatsu, Hamamatsu City, Japan). Изображения собирали со скоростью 25 кадров в секунду с использованием программного обеспечения MicroManager (micro-manager.org).

Во время визуализации буфер, содержащий либо 50 мМ фосфата натрия, pH от 6 до 7, либо ацетат натрия, pH от 4,5 до 5,2, и 50 мМ NaCl вводили в поверхностно-связанные вирионы с помощью шприцевого насоса (Harvard Apparatus, Холлистон, Массачусетс). Для визуализации эффектов Ca 2+ на GP, конформация 0,5 мМ CaCl 2 была включена в буфер для визуализации. В буфере для визуализации также содержалась смесь тушителей в триплетном состоянии (1 мМ тролокс, 1 мМ циклооктатетраен, 1 мМ нитробензиловый спирт) и ферментативная система для удаления молекулярного кислорода, которая включала 2 мМ протокатеховой кислоты и 8 нМ протокатехуат 3. , 4-деоксигеназа. Все эксперименты по визуализации smFRET проводились при комнатной температуре.

Анализ данных

Анализ данных

smFRET был проведен с использованием программного пакета SPARTAN с дополнительными специально написанными скриптами в Matlab (MathWorks, Natick, MA) [46] (https: // www.scottcblanchardlab.com/software). Траектории smFRET были автоматически идентифицированы в соответствии с критериями выбора: (1) FRET между донором и акцептором был обнаружен как минимум за 15 кадров до фотообесцвечивания; (2) следы флуоресценции донора и акцептора отображают одноэтапное событие фотообесцвечивания, которое указывает на присутствие одного донорного флуорофора и одного акцепторного флуорофора на вирион; 3) коэффициент корреляции следов флуоресценции донора и акцептора был меньше −0. 1; (4) отношение сигнал / шум общей флуоресценции, определяемое как отношение величины события фотообесцвечивания к дисперсии фонового сигнала, было больше 8. Выбранные траектории smFRET, которые отвечали этим критериям, соответствовали скрытая марковская модель (HMM), состоящая из 4 состояний со значениями FRET 0,00 ± 0,06, 0,21 ± 0,08, 0,52 ± 0,08 и 0,95 ± 0,08 (среднее ± стандартное отклонение) с использованием сегментарного алгоритма k -means. Анализ HMM присваивает каждой точке данных FRET одно из 4 состояний, что позволяет рассчитывать усредненную по времени занятость состояний.Все наблюдаемые точки данных FRET до фотообесцвечивания были скомпилированы в гистограммы с временным разрешением и отображены в виде контурных графиков. Точки данных, присвоенные состоянию 0-FRET, не были нанесены на график, чтобы обеспечить более четкую визуализацию состояния 0,21-FRET. Таким образом, потеря сигнала FRET с течением времени на контурных графиках является результатом фотообесцвечивания флуорофоров. Гистограммы с временным разрешением были интегрированы по окну наблюдения, чтобы получить одномерные гистограммы FRET, которые были нормализованы таким образом, чтобы общая вероятность, просуммированная по всем ячейкам, была равна единице.Ошибка в вероятности на ячейку гистограммы была определена путем случайного присвоения каждой траектории FRET 1 из 3 различных групп и вычисления стандартной ошибки среднего для этих групп. Явные вероятности для каждого бина гистограммы показаны в S1 Data.

МД моделирования

Атомная модель эктодомена EBOV GP была создана с использованием координат, определенных с помощью рентгеновской кристаллографии [27] (PDB 5JQ3). Модели Cy3- и Cy5-тетразиновых флуорофоров и TCO * ncAA были ранее описаны Das и коллегами [24].Кроме того, переходные диполи флуорофоров были рассчитаны с использованием метода CIS в Gaussian 9. Флуорофоры были присоединены к GP, атомы водорода были добавлены к белку, и вся система была сольватирована в явной воде с ионами, нейтрализующими заряд, в LEaP. модуль AmberTools. Система была параметризована янтарным силовым полем (ff14SB), моделью воды TIP3P и обобщенным янтарным силовым полем (GAFF2). Моделирование проводилось в Центре высокопроизводительных вычислений Тафтса и на кластере c3ddb в Центре высокопроизводительных вычислений Массачусетса Грин с использованием NAMD версии 2.10. Энергия системы была минимизирована в течение 0,1 нс с последующим моделированием в течение 50 нс в ансамбле NPT с поддержанием температуры и давления на уровне 300 К и 1 атм с использованием динамики Ланжевена и поршневого метода Нозе-Гувера, соответственно. . Центры масс флуорофоров Cy3 и Cy5 использовались для расчета расстояния между флуорофорами на каждом кадре моделирования в VMD. Значение κ 2 , которое параметризует вращательную ориентацию двух флуорофоров, было рассчитано согласно κ 2 = [cos θ DA — 3cos θ D cos θ A ] 2 , где θ DA — это угол между диполями перехода донорного и акцепторного флуорофоров, а θ D и θ A — углы между донорным и акцепторным диполями, соответственно, и вектор, разделяющий 2 флуорофоров [47] .

Вспомогательная информация

S1 Рис. Функциональная оценка модифицированных псевдовирионов, содержащих EBOV GP.

(A) Инфекционность GFP-экспрессирующих частиц VSV, псевдотипированных GP или GP * или меченных липофильным флуорофором DiD. DiD использовался в измерениях инфекционности для оценки эффекта липофильного флуорофора, поскольку он спектрально отличается от GFP и химически подобен флуорофору DiO, используемому в анализе смешения липидов. Возбуждение DiO перекрывается с возбуждением GFP и поэтому не может быть использовано в этом анализе.Инфекционность нормализована для GP дикого типа с немеченым вирионом. (B) Вирусное слияние измеряли с использованием анализа проникновения вируса на основе Blam (материалы и методы). Псевдовирионы ВИЧ, содержащие GP, GP * или GP * -Cy3 / Cy5, и в отсутствие или в присутствии антитела KZ52. С целью оценки функциональности GP * и GP * -Cy3-Cy5 псевдовирионы не формировались с избытком GP дикого типа, как это делалось в экспериментах по визуализации smFRET. Псевдовирионы предварительно инкубировали с 0,5 мМ CaCl 2 , где указано.Некоторое усиление слияния наблюдалось после преинкубации с CaCl 2 , что указывает на то, что эндосомальная концентрация Ca 2+ в используемых здесь клетках-мишенях может быть не оптимальной для GP-опосредованного слияния. Все варианты GP эффективно ингибировались KZ52, подтверждая, что остатки TCO * не нарушают глобальную конформацию GP. Данные представлены как среднее значение 3 независимых измерений, с полосами ошибок, отражающими стандартное отклонение. EBOV — вирус Эбола; GFP, зеленый флуоресцентный белок; GP, гликопротеин оболочки EBOV; ВИЧ, вирус иммунодефицита человека; smFRET, резонансный перенос энергии Фёрстера одиночной молекулой; VSV, вирус везикулярного стоматита.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000626.s001

(TIF)

S2 Рис. Протеолитическое расщепление и связывание NPC1, а также физиологический Ca

2+ необходимы для смешивания липосом вируса с липосомами.

(A) Как описано на фиг. 1, флуоресцентно меченые GP-содержащие вирионы инкубировали с липосомами при указанном pH и в отсутствие (красный) или в присутствии (синий) Ca 2+ . Никакого ослабления флуоресценции не наблюдалось в присутствии NPC1 до удаления гликанового колпачка, независимо от присутствия Ca 2+ или pH.(B) В отличие от ускорения, наблюдаемого в присутствии Ca 2+ , при pH 5,2 с NPC1 в присутствии 0,5 мМ MgCl 2 или ZnCl 2 наблюдалось только медленное уменьшение гашения. (C) Эквивалентные уровни декухания наблюдались в диапазоне физиологических концентраций Ca 2+ (0,1-0,5 мМ) при pH 5,2 с NPC1. Однако концентрации Ca 2+ , составляющие по крайней мере 1 мМ, приводили к потере декхэшинга. (D, вверху) Наблюдалось декухание псевдовирионов, содержащих GPΔmuc, которые инкубировали при pH 4.5 в течение 10 мин с последующим удалением гликанового колпачка термолизином. (Внизу). Наблюдаемое снижение гликемии для псевдовирионов, которые инкубировали после удаления гликанового колпачка. Те же данные представлены в отсутствие и в присутствии Ca 2+ , как указано. На всех панелях данные представлены как процент максимального снижения густоты, наблюдаемого при добавлении 1% тритона Х-100, и как среднее значение трех независимых измерений, с полосами погрешностей, отражающими стандартное отклонение. GP, гликопротеин оболочки EBOV; GPΔmuc, GP с удаленным муциноподобным доменом; NPC1, Ниманн-Пик C1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000626.s002

(TIF)

S3 Рис. Антагонисты каналов Ca

2+ и селективный модулятор рецептора эстрогена ингибируют GP-опосредованное проникновение вируса.

Инфекционность псевдовируса была протестирована в присутствии соединений, которые, как известно, влияют на эндосомальный Ca 2+ (Материалы и методы). Инфекционность представлена ​​как процент от контроля ДМСО. Данные представлены как среднее значение от 3 до 6 независимых измерений, при этом планки погрешностей отражают стандартные ошибки.GP, гликопротеин оболочки EBOV.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000626.s003

(TIF)

S5 Рис. Считывание 2-х янтарных стоп-кодонов приводит к генерации полноразмерного GPΔmuc.

(A) GPΔmuc и ​​GP0 дикого типа эффективно включаются в вирионы, образованные ядром ВИЧ. Вестерн-блоттинг, демонстрирующий эффективное фурин-опосредованное расщепление GP0. Капсидный белок ВИЧ, p24, служит в качестве контроля загрузки. (B) Трансляция полноразмерного GP * требует присутствия NESPylRS AF / тРНК Pyl , TCO * ncAA и доминантно-отрицательного мутанта E55D eRF1.eRF1, фактор высвобождения эукариот 1; GP, гликопротеин оболочки EBOV; GPΔmuc, GP с удаленным муциноподобным доменом; ВИЧ, вирус иммунодефицита человека; TCO *, транс -циклоокт-2-ен-L-лизин.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000626.s005

(TIF)

S6 Рис. МД-моделирование динамики флуорофора показывает, что среднее межфлуорофорное расстояние составляет примерно 33 Å.

Молекулярная модель GP * -Cy3-Cy5 была создана на основе структуры GP до слияния (код доступа PDB 5JQ3; Материалы и методы).Показана гистограмма расстояний между центрами масс двух флуорофоров. Среднее межфлуорофорное расстояние составляло 35 ± 4 Å, что соответствует состоянию 0.95-FRET, которое преобладает для GPΔmuc при pH 7. Показаны модели флуорофоров Cy3 и Cy5 с рассчитанными диполями перехода, использованными для расчета фактора ориентации κ 2 , что составляет 2/3 для свободно вращающихся флуорофоров. Ориентация флуорофора, определенная на траектории 50 нс, привела к κ 2 = 0.645 ± 0,320, что указывает на то, что в среднем флуорофоры свободно переворачиваются. Их относительные вращательные ориентации значительно изменяются в масштабах времени, которые намного короче нашего экспериментального временного разрешения 40 мс. FRET, резонансный перенос энергии Фёрстера; GP, гликопротеин оболочки EBOV; GPΔmuc, GP с удаленным муциноподобным доменом; MD, молекулярная динамика.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000626.s006

(TIF)

S7 Рис. Нерасщепленный предшественник GP0 не переходит в состояние с низким FRET при кислом pH.

Контурные графики и гистограммы FRET, отображающие распределение FRET из популяции отдельных молекул GP0 при указанном pH. На гистограммы накладываются гауссовы распределения, как на рис. 2–4. N указывает количество трасс FRET, скомпилированных в каждый контурный график и гистограмму. FRET, резонансный перенос энергии Фёрстера; GP, гликопротеин оболочки EBOV.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000626.s007

(TIF)

S8 Рис. Кислый pH увеличивает степень связывания NPC1 с GP.

Псевдовирионы, содержащие GP CL , инкубировали с меченным FLAG sNPC1-C в диапазоне значений pH. После инкубации избыток sNPC1-C удаляли буфером с нейтральным pH. Степень связывания определяли в анализе ELISA с использованием антитела против FLAG, конъюгированного с пероксидазой хрена (материалы и методы). Более сильное связывание наблюдается при кислом pH, что может быть связано с кислым pH, облегчающим переход GP в конформацию, оптимальную для связывания NPC1. Данные представлены как среднее значение 3 независимых измерений, при этом планки погрешностей отражают стандартную ошибку.ELISA, иммуноферментный анализ; GP, гликопротеин оболочки EBOV; NPC1, Ниманн-Пик C1; sNPC1-C, растворимый домен C NPC1.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000626.s008

(TIF)

S9 Рис. ЭДТА обращает конформационное изменение, вызванное Ca

2+ .

(A) Контурные графики и гистограммы FRET для GPΔmuc и ​​GP CL , полученные при указанных условиях. Данные FRET отображаются, как на рисунках 2–4. N указывает количество трасс FRET, скомпилированных в каждый контурный график и гистограмму.(B) Занятости в высоком (синий), промежуточном (оранжевый) и низком FRET (желтый) состояниях, определенные с помощью анализа HMM. Занятости в трех состояниях FRET нормализованы так, что их сумма равна 100%. ЭДТА, этилендиаминтетрауксусная кислота; FRET, резонансный перенос энергии Фёрстера; GP, гликопротеин оболочки EBOV; GPΔmuc, GP с удаленным муциноподобным доменом; HMM, скрытое марковское моделирование.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000626.s009

(TIF)

Благодарности

Авторы выражают благодарность Анжеле Ховард и Рамешу Говиндану за критическое прочтение этой рукописи.Эдварду Лемке за предоставление плазмид NESPylRS AF / тРНК Pyl и eRF1 и доктору Деннису Бертону за предоставление плазмид экспрессии KZ52.

Ссылки

  1. 1. Сапфир Э., Аман Дж. М.. Лихорадочные поиски иммунотерапии против Эболы: прямое или коктейльное? Trends Microbiol. 2016; 24: 684–686. pmid: 27338027
  2. 2. Моллер-Танк С., Мори В. Вхождение вируса Эбола: любопытная и сложная серия событий. PLoS Pathog. 2015; 11: e1004731. pmid: 25928849
  3. 3.Волчков В.Е., Фельдманн Х., Волчкова В.А., Кленк Х.-Д. Обработка гликопротеина вируса Эбола пропротеинконвертазой фурином. Proc National Acad Sci. 1998. 95: 5762–5767. pmid: 9576958
  4. 4. Нанбо А., Имаи М., Ватанабе С., Нода Т., Такахаши К., Нойман Г. и др. Эболавирус интернализуется в клетки-хозяева посредством макропиноцитоза вирусным гликопротеин-зависимым способом. PLoS Pathog. 2010; 6. pmid: 20886108
  5. 5. Малхеркар Н., Раабен М., де ла Торре Дж., Уилан С.П., Чандран К.Гликопротеин вируса Эбола опосредует проникновение через неклассический динамин-зависимый макропиноцитарный путь. Вирусология. 2011; 419: 72 83. pmid: 21

    1

  6. 6. Саид М.Ф., Колокольцов А.А., Альбрехт Т., Дэйви Р.А. Проникновение вируса Эбола в клетку связано с захватом с помощью механизма, подобного макропиноцитозу, и последующим переносом через ранние и поздние эндосомы. PLoS Pathog. 2010; 6: e1001110. pmid: 20862315
  7. 7. Чандран К., Салливан Н., Фелбор Ю., Уилан С., Каннингем Дж.Эндосомный протеолиз гликопротеина вируса Эбола необходим для инфицирования. Наука. 2005; 308: 1643 1645. pmid: 15831716
  8. 8. Шорнберг К., Мацуяма С., Кабш К., Делос С., Бутон А., Уайт Дж. Роль эндосомальных катепсинов в проникновении через гликопротеин вируса Эбола. J Virol. 2006; 80: 4174 4178. pmid: 16571833
  9. 9. Миллер Э., Оберностерер Г., Раабен М., Герберт А.С., Деффье М.С., Кришнан А. и др. Для проникновения вируса Эбола требуется запрограммированное хозяином распознавание внутриклеточного рецептора.Эмбо Дж. 2012; 31: 1947 1960. pmid: 22395071
  10. 10. Côté M, Misasi J, Ren T, Bruchez A, Lee K, Filone C и др. Низкомолекулярные ингибиторы показывают, что C1 Ниманна-Пика важен для заражения вирусом Эбола. Природа. 2011; 477: 344 U122. pmid: 21866101
  11. 11. Carette JE, Raaben M, Wong AC, Herbert AS, Obernosterer G, Mulherkar N, et al. Для проникновения вируса Эбола требуется переносчик холестерина Niemann-Pick C1. Природа. 2011; 477: 340 U115. pmid: 21866103
  12. 12.Dube D, Brecher MB, Delos SE, Rose SC, Park EW, Schornberg KL и др. Примированный гликопротеин эболавируса (19-килодальтон GP1,2): последовательность и остатки, важные для связывания с клеткой-хозяином. J Virol. 2009; 83: 2883 2891. pmid: 1

    07

  13. 13. Грегори С.М., Харада Э., Лян Б., Делос С.Е., Уайт Дж. М., Тамм Л.К. Структура и функция полной внутренней петли слияния из гликопротеина эболавируса 2. Proc National Acad Sci. 2011; 108: 11211 11216. pmid: 216
  14. 14. Галионе А.Рецепторы NAADP. Csh Perspect Biol. 2011; 3: a004036. pmid: 21047915
  15. 15. Спенс Дж.С., Краузе ТБ, Миттлер Э., Джангра Р.К., Чандран К. Прямая визуализация слияния вируса Эбола, запускающего эндоцитарный путь. Мбио. 2016; 7. pmid: 26861015
  16. 16. Симмонс Дж. А., Д’Суза Р. С., Руас М., Галионе А., Казанова Дж. Э., Уайт Дж. М.. Гликопротеин эболавируса направляет слияние через эндолизосомы NPC1 (+). J Virol. 2016; 90: 605 610. pmid: 26468524
  17. 17. Сакурай Ю., Колокольцов А.А., Чен Си-Си, Тидвелл М.В., Баута В.Е., Клугбауэр Н. и др.Двухпористые каналы контролируют проникновение вируса Эбола в клетки-хозяева и являются мишенями для лечения заболеваний. Наука. 2015; 347: 995 998. pmid: 25722412
  18. 18. Johansen LM, Brannan JM, Delos SE, Shoemaker CJ, Stossel A, Lear C и др. Одобренные FDA селективные модуляторы рецепторов эстрогена подавляют инфекцию, вызванную вирусом Эбола. Sci Transl Med. 2013; 5: 190ra79–190ra79. pmid: 23785035
  19. 19. Fan H, Du X, Zhang J, Zheng H, Lu X, Wu Q и др. Селективное подавление проникновения вируса Эбола с помощью селективных модуляторов рецепторов эстрогена путем нарушения эндолизосомального кальция.Sci Rep-uk. 2017; 7. pmid: 28117364
  20. 20. Суарес Т., Гомара М., Гони Ф., Мингарро И., Муга А., Перес-Пая Е. и др. Кальций-зависимые конформационные изменения мембраносвязанного слитого пептида Эбола приводят к слиянию везикул. Febs Lett. 2003; 535: 23 28. pmid: 12560072
  21. 21. Stegmann T, Hoekstra D, Scherphof G, Wilschut J. Кинетика pH-зависимого слияния вируса гриппа и липосом. Биохимия-нас. 1985. 24: 3107–3113. pmid: 4027233
  22. 22. Ян З., Дакерс Х., Салливан Н., Санчес А., Набель Е., Набель Г.Идентификация гликопротеина вируса Эбола как основной вирусной детерминанты цитотоксичности и повреждения сосудистых клеток. Nat Med. 2000; 6: 886 889. pmid: 10932225
  23. 23. Кристенсен К.А., Майерс Дж. Т., Суонсон Дж. А. pH-зависимая регуляция лизосомального кальция в макрофагах. J Cell Sci. 2002; 115: 599–607. pmid: 11861766
  24. 24. Das D, Govindan R, Nikić-Spiegel I, Krammer F, Lemke EA, Munro JB. Прямая визуализация конформационной динамики отдельных тримеров гемагглютинина гриппа.Клетка. 2018; 174: 926 937.e12. pmid: 29961575
  25. 25. Lee JE, Fusco ML, Hessell AJ, Oswald WB, Burton DR, Saphire E. Структура гликопротеина вируса Эбола, связанного с антителом выжившего человека. Природа. 2008; 454: 177 182. pmid: 18615077
  26. 26. Ито Х, Ватанабе С., Санчес А., Уитт М., Каваока Ю. Мутационный анализ предполагаемого домена слияния гликопротеина вируса Эбола. Журнал вирусологии. 1999; 73: 8907 8912. pmid: 10482652
  27. 27. Чжао Й., Рен Дж., Харлос К., Джонс Д.М., Зелтина А., Боуден Т.А. и др.Торемифен взаимодействует с гликопротеином вируса Эбола и дестабилизирует его. Природа. 2016; 535: 169 172. pmid: 27362232
  28. 28. Ван Х, Ши Й, Сон Дж, Ци Дж, Лу Г, Ян Дж и др. Гликопротеин вируса Эбола, связанный со своим эндосомным рецептором Ниманна-Пика C1. Клетка. 2016; 164: 258 268. pmid: 26771495
  29. 29. Вайссенхорн В., Карфи А., Ли К. Х., Скехел Дж. Дж., Уайли, округ Колумбия. Кристаллическая структура субъединицы слияния мембраны вируса Эбола, GP2, из эктодомена гликопротеина оболочки.Mol Cell. 1998. 2: 605–616. pmid: 9844633
  30. 30. Малашкевич В.Н., Шнайдер Б.Дж., МакНалли М.Л., Милхоллен М.А., Панг Дж. Х., Ким П.С. Ядро структуры гликопротеина оболочки GP2 вируса Эбола с разрешением 1,9 Å. Proc National Acad Sci. 1999; 96: 2662–2667. pmid: 10077567
  31. 31. Никич I, Жирона Дж., Канг Дж., Пачи Дж., Михалева С., Келер С. и др. Отладка расширения генетического кода эукариот для локальной микроскопии Click-PAINT со сверхвысоким разрешением. Angewandte Chemie Int Ed.2016; 55: 16172 16176. pmid: 27804198
  32. 32. Брехер М., Шорнберг К.Л., Делос С.Е., Фуско М.Л., Сапфир Е, Уайт Дж. Расщепление катепсина усиливает гликопротеин вируса Эбола для последующего конформационного изменения, относящегося к слиянию. J Virol. 2012; 86: 364 372. pmid: 22031933
  33. 33. Ван МК, Лим С.Й., Ли С., Каннингем Дж. М.. Биохимическая основа повышения активности гликопротеина Эбола во время эпидемии 2013–2016 годов. Клеточный микроб-хозяин. 2017; 21: 367 375. pmid: 28238624
  34. 34.Харрисон SC. Слияние вирусных мембран. Вирусология. 2015; 479-480C: 498 507. pmid: 25866377
  35. 35. Dubé M, Rey FA, ​​Kielian M. Вирус краснухи: первый вирусный белок слияния, требующий кальция. PLoS Pathog. 2014; 10: e1004530. pmid: 25474548
  36. 36. Дарем Н.Д., Ховард А.Р., Говиндан Р., Сенджобе Ф., Фелс М.Дж., Дил В.Е. и др. Анализ отдельных гликопротеинов вируса Эбола в режиме реального времени выявляет динамику конформаций до слияния и входа в организм. Вирусы. 2020; 12: 103.
  37. 37.Маркосян Р.М., Мяо Ц., Чжэн И-М, Меликян ГБ, Лю С.-Л, Коэн Ф.С. Индукция слияния клеток с гликопротеином вируса Эбола: низкий уровень pH не является спусковым крючком. PLoS Pathog. 2016; 12: e1005373. pmid: 26730950
  38. 38. Südhof TC, Rothman JE. Слияние мембран: борьба с белками SNARE и SM. Наука. 2009. 323: 474–477. pmid: 19164740
  39. 39. Ю И-М, Чжан В., Холдэуэй Х.А., Ли Л., Костюченко В.А., Чипман П.Р. и др. Структура незрелого вируса денге при низких значениях pH способствует протеолитическому созреванию.Наука. 2008; 319: 1834 1837. pmid: 18369148
  40. 40. Герасименко Ю.В., Тепикин А.В., Петерсен О.Х., Герасименко О.В. Поглощение кальция посредством эндоцитоза с быстрым высвобождением из подкисляющих эндосом. Curr Biol. 1998. 8: 1335–1338. pmid: 9843688
  41. 41. Альбрехт Т., Чжао Ю., Нгуен Т., Кэмпбелл Р. Э., Джонсон Дж. Д. Флуоресцентные биосенсоры определяют уровни кальция в определенных субпопуляциях эндосом бета-клеток. Клеточный кальций. 2015; 57: 263–274. pmid: 25682167
  42. 42.Schmied WH, Elsässer SJ, Uttamapinant C, Chin JW. Эффективное многосайтовое включение неестественных аминокислот в клетки млекопитающих посредством оптимизированной экспрессии пирролизил тРНК синтетазы / тРНК и сконструированного eRF1. J Am Chem Soc. 2014; 136: 15577–83. pmid: 25350841
  43. 43. Кавруа М, Норонья С, Грин WC. Чувствительный и специфический анализ на основе ферментов, выявляющий слияние вирионов ВИЧ-1 в первичных Т-лимфоцитах. Nat Biotechnol. 2002; 20: 1151 1154. pmid: 12355096
  44. 44. Whitt MA.Создание псевдотипов VSV с использованием рекомбинантного ΔG-VSV для исследований проникновения вируса, идентификации ингибиторов проникновения и иммунных ответов на вакцины. J Virol Methods. 2010; 169: 365 374. pmid: 20709108
  45. 45. Манро Дж. Б., Горман Дж., Ма Х, Чжоу З., Артос Дж., Бертон Д. Р. и др. Конформационная динамика одиночных тримеров оболочки ВИЧ-1 на поверхности нативных вирионов. Наука. 2014; 346: 759 763. pmid: 25298114
  46. 46. Juette MF, Terry DS, Wasserman MR, tman R, Zhou Z, Zhao H, et al.Одномолекулярные изображения неравновесных молекулярных ансамблей в миллисекундном масштабе времени. Нат методы. 2016; 13: 341 344. pmid: 26878382
  47. 47. Lakowicz JR. Принципы флуоресцентной спектроскопии. Springer. 2006;
Лезвия

10 ЛЕЗВИЙ ДЛЯ СПИРАЛЬНОЙ ПИЛЫ 24 TPI 130 ММ КОНЦЕВОЙ ПЕРЕДНИЙ ДЕРЕВО МЕТАЛЛ ПЛАСТИК Бизнес и промышленность jengroover.com

10 ЛЕЗВИЙ ДЛЯ СПИРАЛЬНОЙ ПИЛЫ 24 TPI 130MM PIN END FRET WOOD METAL PLASTIC

Найдите много отличных новых и бывших в употреблении опций и получите лучшие предложения на 10 ЛЕЗВИЙ ДЛЯ СПИРАЛЬНОЙ ПИЛЫ 24 TPI 130MM PIN END FRET WOOD METAL PLASTIC по лучшим онлайн ценам на! Бесплатная доставка для многих товаров !.Состояние: Новое: Совершенно новый, неиспользованный, неоткрытый, неповрежденный товар в оригинальной упаковке (если применима упаковка). Упаковка должна быть такой же, как в розничном магазине, если только товар не сделан вручную или не был упакован производителем в нерозничную упаковку, такую ​​как коробка без надписи или полиэтиленовый пакет. См. Список продавца для получения полной информации. См. Все определения условий : EAN: : 5056042003146 ​​, Подкатегория: : Лезвия : Бренд: : DP , Тип: : Лобзик : MPN: : DP00414 , Подтип: Конец штифта : Вес (граммы): : 2 , Размер : : 130 мм : Категория: : Аксессуары для электроинструментов Гарантия: : 12 месяцев : UPC: : Не применяется Apply ISBN: : Не применяется Apply。






10 ЛЕЗВИЙ ДЛЯ СПИРАЛЬНОЙ ПИЛЫ 24 TPI 130 ММ КОНЦЕВОЙ ПЕРЕДНИЙ ДЕРЕВО МЕТАЛЛ ПЛАСТИК

Дата первого включения: 13 ноября.Якорь — трехмерный, со светло-розовыми кристаллами спереди. 15-миллиметровая 8-сторонняя цепочка с алмазной огранкой: одежда, шлифовальные ленты 5 шт. 2 «x 72» Керамика VSM XK870X с зернистостью 60, дата первого упоминания: 25 апреля, легированная сталь, закаленная до 50-52 rc, обувь и ювелирные изделия ✓ БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА, возможен возврат на соответствующие покупки, 5 шт. Фоторезистор LDR CDS 5 мм датчик светозависимого резистора GL5528 Arduino. Убедитесь, что вы покупаете у Chelsydale в качестве продавца на этой странице продукта. Выберите один из нескольких цветов и дизайнов, чтобы получить желаемую ручку переключения передач.и нажатием для подключения (также называемым одним касанием), КОРИЧНЕВЫЙ 16-миллиметровый антивандальный кнопочный кнопочный переключатель из нержавеющей стали, металл, может использоваться в темноте без другого света. Представлен с Very Fine Dance Sport Shoes или любым другим эффектом, пожалуйста, добавьте его в корзину сейчас. Шуруп для дерева с плоской головкой и шлицем Твердая коммерческая латунь # 10X3 / 4 дюйма, количество 25. Мягкое флисовое одеяло с пурпурной краской. Ultrasuede® может быть изготовлен по индивидуальному заказу с различным весом и отделкой. Встречайте SYKELS новейшую коллекцию ткани FLEECE по лицензии NCAA.SMC SY5140-3DOE СОВЕРШЕННО НОВАЯ SY51403DOE, 3 см. Благодарим вас за посещение нашего магазина. В комплекте небольшой металлический карабин. Контраст: шоколадно-коричневая тафта, оставшаяся от платья 1/2 метра. Перезаряжаемые аккумуляторы Duracell Nimh Технология Duralock Power Preserve Aaa 2 / уп. Придайте вашей мебели красивый и элегантный вид. : :::::::: Я ИДЕАЛЬНО ДЛЯ :::::::::. Подходит ко всем моделям (ЗА ИСКЛЮЧЕНИЕМ V-образных стержней VRSC 2006 года выпуска) 84-20 все модели Touring и Softail с половицами. Новые ножницы RS Pro 487-050 9 дюймов для различных материалов, система Fit Flight была разработана Cosmo Darts как превосходная альтернатива старой системе.В комплект также входит набор пластин для напольного покрытия, которые подходят для напольных покрытий разных размеров. Пожалуйста, держите выход воды ниже, чем входной. ОПТОВАЯ ЛОТ 40 NORTON MULTISAND SANDING SPONGES MEDIUM & FINE 21688 21689. Легко подключается к настенному выключателю (кроме горловины с широким горлышком и 3-слойной герметичной крышки, бесплатная доставка) на соответствующие заказы 250 В, 6 А, индивидуальный фильтр электромагнитных помех X7P2 AC 115 В, передняя (левая или правая) сторона, Eagle Lights Дверца топливного бака для Jeep Wrangler (хром).

Ранняя история пилы для свитков

Фотоиллюстрированный взгляд на происхождение этого популярного деревообрабатывающего инструмента

Отсутствие точного учета окутывает происхождение пилы для свитков завесой тайны. Однако недавно обнаруженные записи предполагают, что первый патент на пилу с возвратно-поступательным стальным лезвием был получен в 1829 году в Великобритании.

Одна из причин, по которой исследователям так трудно определить раннюю историю пилы для свитков, связана с запутанными и взаимозаменяемыми терминами.В прошлом термин «резьба по дереву» использовался для описания всех сложных и детализированных вырезок из дерева. Хотя эту форму обработки дерева можно проследить до некоторых из самых ранних цивилизаций мира, до 1500-х годов такие проекты, скорее всего, выполнялись ножами.

Большая книга СС Деревообработка | Создание деревянных ящиков

Ранняя документация по спиральной пиле

В 1500-х годах немецкий мастер разработал способ изготовления тонких узких пильных полотен. Французский мастер по имени Буль разработал раму для этих лезвий, чтобы вырезать замысловатые узоры.Рама, называемая пилой Buhl, похожа на сегодняшние лобзиковые пилы и пилы. Пила Буля сделала резку замысловатых узоров популярной во всей Европе.

Хотя есть некоторые свидетельства того, что идея использования тонких лезвий в поршневой машине существовала на практике до 1800-х годов, первый зарегистрированный патент на этот тип машины был выдан г-ну М’Даффу в 1829 году. Arts and Journal of Patent Inventions, 2 декабря 1829 г. г-н М’Дафф был удостоен награды Dr.Ежегодная премия Fellowes за лучшую машину, изобретенную работающим членом Лондонского (Англия) Механического института.

Согласно публикации, «Машина, за которую в этом случае присуждена премия, якобы предназначена для вырезания работ Буля с большей легкостью и точностью, чем при использовании ранее используемых средств».

В публикации говорится, что мистер М’Дафф использовал свою машину, чтобы вырезать американский континент с карты мира «с удивительной быстротой и точностью.”

Далее в публикации говорится: «(Инструмент г-на М’Даффа) состоит из очень тонкого и тонкого прямого пильного полотна, закрепленного вертикально в подходящей раме, которое принимает возвратно-поступательное прямолинейное движение от вращательного действия токарного станка. Это преобразование линии движения осуществляется с помощью устройства, заслуживающего особого внимания своей крайней простотой и дешевизной ».

Образцы дикой природы Северной Америки для СС | Руководство для начинающих. Свиток пилы — DVD

Эволюция спиральной пилы

К 1857 году было зарегистрировано по крайней мере три патента на усовершенствование спиральной пилы, а в другом патенте она упоминается как американское изобретение, которое было показано на выставке 1851 года в Хрустальном дворце в Лондоне.В одном документе упоминается, что изобретатель прикрепил стержень к колесу ленточной пилы, чтобы приводить в движение другое полотно, которое будет использоваться в качестве спиральной пилы. К 1860-м годам в Соединенных Штатах начали появляться первые спиральные пилы с механическим приводом, использующие педаль с ножным приводом, ручную рукоятку или педальный механизм.

В эпоху Виктории (1850–1910) пилы для спиралей использовались для вырезания изящных орнаментальных пряничных узоров на остроконечных концах карнизов крыш и крыльцов. Пилы для прокрутки также использовались для создания часов, настенных табличек, рам для картин и декоративной мебели, чтобы украсить внутреннюю часть дома.К 1920-м годам термин «пила для прокрутки» стал широко использоваться по всей Америке, и такие производители, как Barnes, New Rogers, Star, Lester и Hobbies, начали их массовое производство.

Деревообработка интарсия для начинающих | Деревянные чаши от пилы для свитков

Самая большая известная коллекция спиральных пил

Столяр Рик Хатчесон, который всю жизнь работал по дереву, хочет задокументировать 180-летнюю эволюцию спиральной пилы от первого патента в 1829 году до современных пил. У Рика одна из самых больших известных коллекций спиральных пил со всего мира, состоящая из более чем 200 пил.

Рик начал свою коллекцию в 1995 году со старой педальной пилы Barnes No. 7 1876 года выпуска, которую он купил у друга.

У него есть большая лодка, на которую нужно наступать, чтобы управлять ею, — сказал Рик. «Я заплатил за это 400 долларов и несколько раз подпилил его за новизну. Тогда я просто подумал про себя: «Эй, я бы хотел начать коллекцию». Я так и сделал ».

Сегодня эта первая антикварная пила для свитков гордо стоит рядом с другими в том, что превратилось в музей пилы для свитков Рика, расположенный в большой комнате над его мастерской в ​​Граймсе, штат Айова.

С момента своей первой покупки Рик начал безжалостную охоту за более старыми и необычными спиральными пилами всех типов; педаль, педаль, ручная рукоятка, пневматическая, водная, электрическая, самодельная, промышленная, детские пилы, напольные модели, столешницы и все остальное, что могло бы заполнить оставшиеся пробелы в его значительной коллекции.

В 2000 году Рик начал покупать спиральные пилы в Интернете и на eBay.

«Когда я размещал фотографии своих новых пил в Интернете, люди связывались со мной, чтобы узнать, интересует ли меня их старая пила», — пояснил Рик.С тех пор коллекция Рика разрослась, заполнив его выставочную площадку и полки вдоль стен.

«Теперь мне нужно сложить их друг на друга!» Рик со смехом сказал: «Мне всегда нравились механические вещи. Мне так приятно видеть, как они были построены, как функционировали, сколько было разных типов и стилей и как все они работали. Это похоже на судебную экспертизу спиральных пил.

Чтобы сохранить свою старинную ценность, каждая пила хранится в ее первоначальном состоянии, с пятнами, вмятинами, вмятинами, недостающими частями, сколами, сломанными пильными полотнами, потрепанными шнурами и всем остальным.

Несмотря на знания и ресурсы, которые Рик накопил во время поиска пил, у него все еще очень мало информации о некоторых пилах.

«Что касается некоторых из этих пил, я понятия не имею, кто их сделал и в каком году», — сказал Рик. «Но потом я попрошу кого-нибудь зайти на мой сайт-музей и написать мне по электронной почте, что у их дедушки была именно такая пила, и он купил ее новой в 1932 году. Если кто-то предоставит мне эту информацию, я с радостью добавлю ее в свой онлайн-музей. . »

Рик никогда не продает свои пилы, но любит демонстрировать их всем, кто интересуется.

«Ко мне приезжали люди со всей страны, чтобы посмотреть на пилы», — сказал Рик. «Обычно они заходили на мою веб-страницу и хотят увидеть их лично, иначе они проезжают через Айову в отпуске и решают зайти. Я всего в трех милях от межштатной автомагистрали. Приходите ко мне.»

В наши дни Рик более внимательно относится к тому, что он покупает, потому что у него заканчивается место.

«Это действительно должно быть что-то другое — что-то с совершенно другим типом системы привода или другой установкой зажима лезвия», — сказал Рик, надеясь, что появится что-то уникальное.«Я думаю, что есть еще несколько сюрпризов».

Кто-нибудь когда-нибудь использовал свой XC для обработки ладов? — Лютье

Первый пост, но я уже давно скрывался. Я не был уверен, что это подходящий форум для этой публикации, но мне показалось, что это правильно.

По профессии я компьютерный программист, но я играю на гитаре 30 лет, и, думая о выходе на пенсию, я хотел бы сделать что-нибудь со своим временем, которое я считаю полезным.Я решил, что будет весело делать свои собственные гитары в старости, и поэтому я начал исследовать различные школы, в которых обучали этому ремеслу, и одна школа предлагала курс, который учил студентов, как использовать фрезерный станок с ЧПУ, чтобы вырезать шеи, тела. грифы и т. д. Заинтригованный, я начал изучать этот «ЧПУ» — и вскоре я решил, что это то, с чем я действительно хочу поиграть.

Итак, я начал смотреть на различные наборы DIY для ЧПУ на ebay, что заставило меня задуматься о качестве, что побудило меня начать исследование, которое было бы лучшим соотношением цена-качество, что позволило мне посетить несколько форумов, в том числе мое любимое.

Я читаю здесь (ежедневно) в течение нескольких недель, но сегодня у меня возник вопрос, на который я не смог найти ответа на форумах (по крайней мере, нигде я не искал): Кто-нибудь использовал свой ЧПУ для обработки ладов ?

Я понимаю, что обычная проволока для ладов тверже, чем алюминий или латунь, но ненамного, и я уже смотрел много видео, в которых люди укрепляли свои X-Carve и использовали их для резки стальной пластины и т. Д. Я думаю что достаточно «жесткий» X-Carve, настроенный должным образом, не будет иметь реальных проблем (после настройки) при работе на ладу.

Я имею в виду, разве станок Plek не просто проприетарный фрезерный станок с ЧПУ?

Итак, я начал смотреть, кто, пробовал ли кто это еще. Но я не мог найти ничего подобного. Отсюда и пост.

Машины

Plek безумно дороги, но я предполагаю, что это больше связано с тем, как они комбинируют и автоматизируют целую кучу шагов в процессе, чем насколько мощным или точным является их маршрутизатор. Мне кажется (ничего не знающий новичок без ЧПУ или отбивных Лютье), что опытный Лютье с достаточно жесткой X-Carve, который хорошо владеет своей мельницей, мог бы сделать что-то подобное в своей мастерской.

Итак, я подумал, что задам вопрос людям, которые действительно могут на него ответить. Это вообще выполнимо, или это слишком устрашающе или непостижимо? Я не знаю достаточно о материалах первого этажа, чтобы даже догадываться, но я действительно думаю, что любой, кто способен вырезать составной радиусный гриф с нуля, вероятно, меньше всего сможет обработать лады, и что не так, как это делает машина Plek с правильным набором вверх.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *