Как узнать температуру двигателя на лада гранта: где находится и как работает, признаки выхода из строя и способы поиска причины, инструкция по замене и эксплуатации

Рахул Рой

¹ Физический факультет Университета Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр биофизики и компьютерной биологии, Университет компьютерной биологии Illinois at Urbana-Champaign, 1110 West Green Street, Urbana, Illinois 61801, USA

Sungchul Hohng

³ Департамент физики и астрономии, Сеульский национальный университет, San 56-1 Sillim 9-dong, Gwanak-gu, Seoul 151-747, Корея

Taekjip Ha

¹ Физический факультет Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр исследований Биофизика и вычислительная биология, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

⁴ Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

¹ Департамент физики Иллинойского университета в Урбана-Шампейн, 1110 West Green Street, Урбана, Иллинойс 61801, США

² Центр биофизики и вычислительной биологии, Университет Иллинойса в Урбана-Шампейн, 1110 Вест-Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

³ Департамент физики и астрономии, Сеульский национальный университет, Сан 56-1 Силлим 9-донг, Кванак-гу, Сеул 151-747, Корея

⁴ Медицинский институт Говарда Хьюза, 1110 Запад Грин-стрит, Урбана, Иллинойс 61801, США

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы: Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассивирования поверхности полиэтиленгликоля (PEG 9000)

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

GUID: 2C6897D7-8368-4C8B-A944-5AA7DB5A00BA

Аннотация

Несмотря на взрывной рост биологических применений методов одиночных молекул за последнее десятилетие, эти методы до сих пор практикуются в основном исследователями, ориентированными на биофизику.Отчасти это происходит из-за отсутствия коммерческих инструментов во многих случаях, а также из-за воспринимаемой крутой кривой обучения и необходимости в дорогостоящем оборудовании. Мы хотим предоставить практическое руководство по использованию резонансной передачи энергии (FRET) по Фёрстеру (или флуоресценции) на уровне отдельных молекул, уделяя особое внимание изучению иммобилизованных молекул, которые позволяют измерять траектории реакции отдельных молекул от 1 миллисекунды до многих минут. Инструмент может быть построен по разумной цене с использованием различных готовых компонентов и надежно эксплуатироваться с использованием текущих общепринятых протоколов и свободно доступного программного обеспечения.

Будущее открывает перспективы персонализированного секвенирования ДНК и высокопроизводительного скрининга на патогены по доступной цене и в разумное время. Эти обещания подкреплены всплеском технологий на основе одиночных молекул, которые позволяют нам манипулировать и исследовать отдельные молекулы. Используя этот подход, перед микроскопом предстает несколько важных биологических загадок, которые долгое время интересовали ученых. Как сказал Фейнман, «очень легко ответить на многие из этих фундаментальных биологических вопросов; вы просто посмотрите на вещь ! » ¹ .Одномолекулярные методы позволяют нам делать именно это ^{2, 3} . Однажды они могут стать элементарным инструментом для характеристики белков, сигнальных путей или любого биологического явления. В надежде способствовать достижению этой цели, мы предлагаем краткое, но практическое руководство для измерения одиночных молекул FRET ⁴ (smFRET) ^5-7 , одного из наиболее общих и адаптируемых методов измерения одиночных молекул. С момента своего скромного зарождения в неводных условиях в 1996 г. ⁸ smFRET быстро развился, чтобы ответить на фундаментальные вопросы о репликации, рекомбинации, транскрипции, трансляции, фолдинге и катализе РНК, неканонической динамике ДНК, фолдинге белков и конформационных изменениях, различных моторные белки, белки слияния мембран, ионные каналы, трансдукция сигналов, и это лишь некоторые из них, и этот список продолжает расти быстрыми темпами.Поскольку целью данного обзора не является обзор обширной литературы по таким исследованиям, мы отсылаем читателя к обзорам в данной области и ссылкам в них ^{6, 9-13} .

В измерениях FRET степень безызлучательного переноса энергии между двумя молекулами флуоресцентного красителя, называемыми донором и акцептором, сообщает о промежуточном расстоянии, которое можно оценить по отношению акцептора к общей интенсивности излучения () ^{4, 14, 15} . Эта эффективность передачи энергии, E , задается как E = [1 + ( R / R ₀ ) ⁶ ] ^-1 , где R — расстояние между красителями. и R ₀ — радиус Ферстера, при котором E = 0.5 (). Конформационную динамику отдельных молекул можно наблюдать в режиме реального времени, отслеживая изменения FRET (). Преимущество метода FRET заключается в том, что он является логометрическим методом, позволяющим нам измерять внутреннее расстояние в молекулярном каркасе, а не в лабораторном, и, следовательно, делает его в значительной степени невосприимчивым к инструментальным шумам и дрейфу. Измерение FRET свободно диффундирующих одиночных молекул проще в реализации (коммерческие решения также доступны, например, MicroTime200 от PicoQuant) и эффективно для выявления распределения популяций расстояний между красителями ^16-19 .Однако возможность отслеживать отдельные молекулы в течение длительного периода времени добавляет совершенно новое измерение с динамической информацией в диапазоне от миллисекунд до минут. Хотя можно использовать конфокальную микроскопию ^{20, 21} , временные траектории smFRET чаще всего получают путем визуализации иммобилизованных на поверхности молекул с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIR), которая позволяет осуществлять высокопроизводительный сбор данных ^{5, 22} . Установки МДП были успешно адаптированы многочисленными группами и могут быть легко собраны в соответствии с пошаговой инструкцией ⁷ с использованием готовых компонентов, которые стоят примерно столько же, сколько ультрацентрифуга.Здесь мы рассматриваем этот метод FRET, а также предоставляем список поставщиков различных реагентов и оборудования, используемых в нашей лаборатории (дополнительные таблицы 1 и 2 в Интернете; перечисленные элементы и поставщики не являются единственными вариантами, и можно найти другие альтернативы). Все программы сбора и анализа данных находятся в свободном доступе в Интернете (http://bio.physics.uiuc.edu), а инструкции по подготовке пассивированной полимером поверхности и веб-ссылка на демонстрационные видеоролики включены в Дополнительный протокол в Интернете. Хотя мы в основном обсуждаем двухцветную схему FRET в этом обзоре, схемы FRET более высокого порядка могут также применяться для исследования многокомпонентных взаимодействий или пространственно-временных отношений между различными конформационными изменениями в больших молекулярных комплексах (Box 1).

Одномолекулярный FRET. ( a ) Эффективность FRET, E как функция расстояния между красителями ( R ) для R ₀ = 50 Å. Донорский краситель, непосредственно возбуждаемый падающим лазером, либо флуоресцирует, либо передает энергию акцепторному красителю в зависимости от его близости. При R = R ₀ , E = 0,5, а на меньших расстояниях это> 0,5 и наоборот в соответствии с функцией, показанной синей линией. Обратите внимание на линейность значений E рядом с R ₀ .( b ) Пример двухцветных данных smFRET. Данные получают в виде интенсивностей донора и акцептора (верхняя панель), из которых вычисляется кажущаяся эффективность FRET (нижняя панель). Мутантный рибозим шпильки ⁹³ , который несет донор и акцептор на разных плечах одной и той же молекулы, претерпевает переходы между тремя состояниями FRET (E1, E2 и E3). Антикоррелированный характер донорного и акцепторного сигналов указывает на то, что эти изменения интенсивности происходят из-за передачи энергии.Молекулы красителя также показывают переходы в темное состояние, например. интенсивность акцептора временно падает до нуля (~ 9 с) или полностью фотообесцвечивается (~ 18,5 с).

Вставка 1

Схемы FRET

Однопарный FRET () — мощный метод, однако важно понимать, что глобальные конформационные изменения во время биомолекулярных взаимодействий, будь то сворачивание белка или взаимодействия белок-нуклеиновая кислота, редко бывают одномерными. В отсутствие кристаллических структур интерпретация изменений расстояния между красителями может быть согласована с несколькими различными, но не обязательно взаимоисключающими моделями.Следовательно, постоянно возрастает интерес к расширению досягаемости FRET до трех измерений. Здесь мы обсуждаем некоторые схемы FRET на начальной стадии или стадии разработки.

Трехцветная каскадная схема: Ограниченный диапазон расстояний FRET побудил исследователей использовать каскады кассет передачи энергии для увеличения эффективных значений R ₀ . Например, в трехцветном каскаде промежуточный акцептор энергии передает энергию, полученную от донора, акцептору более низкой энергии ().Эта схема может быть полезной при исследовании изменений в больших комплексах, таких как рибосомы или нуклеосомы.

Трехцветная бифуркатная схема: один краситель может действовать как донор для двух независимых акцепторов, которые можно спектрально разделить (). В зависимости от близости от любого из акцепторов донор гаснет с увеличением эмиссии соответствующего акцептора. Обратный подход был бы с двумя независимыми донорами (спектрально разделенными, но возбуждаемыми одной и той же длиной волны света), которые могут выборочно гасить в зависимости от того, какой из них находится рядом с единственным акцептором.

Общая трехцветная схема: В общем случае из двух вышеупомянутых будет ситуация, когда передача энергии между тремя красителями не ограничена, и, следовательно, необходимо провести подробные вычисления для оценки трех расстояний между красителями (). Это позволяет явно определить однозначную эталонную плоскость в трехмерном конформационном пространстве биомолекулы.

Схема с двумя парами FRET: для больших комплексов использование двух независимых пар FRET может сообщать о конформационных изменениях в отдельных областях макромолекулы в реальном времени ().Реализация таких схем будет зависеть от разработки более голубых красителей, которые могут действовать как эффективные доноры одиночных молекул.

Схемы FRET одиночных молекул.

Схема эксперимента

Одномолекулярные флуоресцентные красители

Идеальный флуорофор для исследований одиночных молекул должен быть ярким (коэффициент экстинкции, ε > 50000 M ⁻¹ см ⁻¹ ; квантовый выход, QY > 0,1 ), фотостабильный с минимальными фотофизическими / химическими эффектами и эффектами агрегации, небольшой и водорастворимый с достаточным количеством химикатов биоконъюгации.Кроме того, отличная пара smFRET должна иметь (1) большое спектральное разделение между излучением донора и акцептора и (2) аналогичные квантовые выходы и эффективность обнаружения. В то время как флуоресцентные белки использовались для исследований smFRET ²³ , низкая фотостабильность и фотоиндуцированное мигание препятствовали дальнейшим применениям. Полупроводниковые квантовые точки (КТ) также использовались в качестве донора smFRET ²⁴ за счет химического подавления их мерцания ²⁵ , но большой размер (диаметр> 20 нм для коммерческих КТ) и отсутствие схемы одновалентного сопряжения ограничивают их использование.Следовательно, самые популярные одномолекулярные флуорофоры — это небольшие (<1 нм) органические красители ²⁶ . Мы сравнили три пары FRET с оптической плотностью от 500 до 700 нм от разных производителей (цианиновые, Alexa- и Atto-красители) в. Хотя цианиновые красители (Cy3 и Cy5; донор и акцептор соответственно) долгое время были фаворитами, их аналоги кажутся сопоставимыми по своим соответствующим свойствам. Ни один из более голубых красителей, например те, которые можно возбуждать при 488 нм, не был столь фотостабильным. Замена Cy3 для синтеза пользовательской РНК, Dy547, даже более фотостабильна, чем Cy3 (Sua Myong, личное сообщение).Тетраметилродамин является жизнеспособной альтернативой и имеет почти такой же спектр, что и Cy3, но с более низким коэффициентом экстинкции. Однако он имеет тенденцию спонтанно менять свою интенсивность между тремя разными уровнями (неопубликованные наблюдения). Красители ближнего инфракрасного диапазона, такие как Cy5.5 и Cy7, также служат в качестве эффективных однокомолекулярных красителей и могут использоваться в многоцветных схемах (обсуждаемых позже).

Таблица 1

Сравнение однокомолекулярных красителей FRET

Повышение фотостабильности

Молекулярный кислород является эффективным, но красителем также является источником высокореактивных форм кислорода, которые в конечном итоге вызывают фотообесцвечивание ²⁷ . Хотя удаление кислорода снижает фотообесцвечивание, оно увеличивает время пребывания в триплетном темном состоянии ²⁸ , вызывая миллисекундную или более длительную перемежаемость флуоресценции или раннее начало насыщения сигнала.Аналог витамина E под названием Trolox (2 мМ; 100 × исходный раствор, приготовленный в диметилсульфоксиде (ДМСО), требуется регулировка pH и фильтрация) является отличным гасителем триплетного состояния, который подавляет моргание и стимулирует длительное выделение популярных цианиновых красителей в сочетании с ферментативная система поглощения кислорода ²⁸ . Trolox также должен обеспечить значительное улучшение временного разрешения, поскольку он задерживает наступление насыщения излучения с увеличением интенсивности лазера. Восстановитель β-меркаптоэтанол (βME; 142 мМ) является менее эффективным гасителем триплетного состояния и вызывает долгоживущие темные состояния Cy5 ²⁸ , побочный эффект, который использовался для приложений фотопереключения с сверхвысоким разрешением ²⁹ .Существует множество других тушителей триплетного состояния или агентов против выцветания, которые могут оказаться полезными для нецианиновых красителей ³⁰ .

Самая популярная ферментативная система поглощения кислорода ³¹ представляет собой смесь глюкозооксидазы (165 Ед / мл), каталазы (2170 Ед / мл) и β-D-глюкозы (0,4% масс.) (Или 0,8% моногидрата декстрозы). Глюкозооксидазу необходимо добавить непосредственно перед визуализацией, а образец держать изолированным от воздуха, чтобы pH раствора не упал значительно из-за образования глюконовой кислоты, побочного продукта реакции.Другими вариантами могут быть комбинация протокатехуиновая кислота / протокатехуат-3,4-диоксигеназа ³² , которая обеспечивает ~ 40% улучшение по сравнению с предыдущим методом (Нильс Вальтер, личное сообщение). Если высокоочищенные формы этих ферментов коммерчески недоступны, необходимо позаботиться о том, чтобы гарантировать отсутствие загрязняющей активности, особенно рибонуклеаз.

Конъюгация

Если доступна структурная информация, места для маркировки должны быть выбраны так, чтобы расстояние между красителями изменилось от меньшего к большему, чем значение R ₀ (или наоборот ) для максимальной чувствительности.Существуют некоторые руководящие принципы для значений FRET ³³ , ожидаемых для меченых нуклеиновых кислот ^{34, 35} . Общие стратегии конъюгации нуклеиновых кислот и белков кратко изложены в. Нуклеиновые кислоты лучше всего метить во время синтеза или с помощью оснований, модифицированных амином, которые можно отделить от немеченых молекул электрофорезом в полиакриламидном геле. Для взаимодействий нуклеиновая кислота-белок выгодно маркировать нуклеиновые кислоты из-за простоты конъюгации, обращения, очистки и гибкости в нанесении красителя.В исследованиях, связанных с взаимодействием белков с каркасом ДНК, красители должны быть внутренне конъюгированы с использованием линкерных групп для предотвращения разрушения каркаса. Экономично распространять модификации на две или более цепочек ДНК (или РНК) и отжигать их для создания конечной конструкции. В качестве общего подхода к сайт-специфической маркировке белков мы попытались пометить неприродную аминокислоту, содержащую кетонную группу ³⁶ , генетически кодируемую в геликазе Rep E. coli , используя Cy3 или Cy5-гидризид.

Таблица 2

Стратегии конъюгации красителей или биотина

выход белка с приемлемой флуоресценцией был беден.Чрезвычайно низкий выход мечения кетоновыми группами на белках, размер которых превышает 100 остатков, даже в денатурирующих условиях, кажется общим (Ричард Эбрайт, личное сообщение). Низкое количество остатков цистеина (cys) в большинстве белков по сравнению с лизинами делает их идеальными для специфической маркировки. Следовательно, мечение остатков цистеина (введенное посредством сайт-направленного мутагенеза ^{37, 38} ) реакциями на основе малеимида остается наиболее популярной схемой мечения, хотя недавно разработаны, но менее общие альтернативы ^{26, 39} .Хотя выбор маркировки имеет наибольшее влияние на успех или неудачу экспериментов с smFRET, также важен выбор оборудования, используемого для обнаружения smFRET.

Обнаружение отдельных молекул

Спектроскопия полного внутреннего отражения

В TIR-микроскопии ^{40, 41} создается исчезающее поле возбуждающего света, которое распространяется только на ~ 100-200 нм от поверхности, к которой привязан образец, что значительно уменьшает фоновая флуоресценция (). Твердотельный лазер на 532 нм (~ 50 мВт) подходит для пар FRET, обсуждаемых здесь, и гелий-неоновый лазер на 633 нм (~ 30 мВт) или диодные лазеры с аналогичными длинами волн могут быть добавлены для проверки наличия акцептора.Интенсивность лазера ослабляется с помощью полуволновой пластины и поляризационного светоделительного куба (или с помощью фильтров нейтральной плотности). Путем возбуждения большой площади (размером ∼0,05 мм ² ) и использования детектирования на основе камеры параллельно отображаются сотни молекул. Обычно используется лазерный стол с плавающими в воздухе ножками, но макетная плата толщиной ∼25 мм с равномерно расположенными резьбовыми отверстиями, установленная на обычном лабораторном столе или столе, достаточно устойчива для TIR smFRET. Существует два типа TIR: призменный (PTIR) и объективный (OTIR) ().

Схема для спектроскопии smFRET. Этикетки — М, зеркальные; DM — дихроичное зеркало; L, линза; CCD, камера устройства с зарядовой связью; BE, расширитель луча; PBS, поляризационный светоделитель; λ / 2, полуволновая пластина ( a ), возбуждение TIR и обнаружение излучения одной пары FRET. Привязанные одиночные молекулы возбуждаются либо PTIR, либо OTIR. Флуоресценция собирается с помощью объектива, а щель создает конечную область изображения, которая составляет половину области изображения CCD. Коллимированное изображение разделяется на излучение донора и акцептора и отображается бок о бок на ПЗС-камере (см. Изображение камеры на вставке).( b ) Схемы возбуждения МДП (увеличенный вид коробки на (а)). В режиме PTIR лазерный луч, сфокусированный под большим углом падения ( θ _c > 68 °) на призму, расположенную в верхней части образца, создает исчезающее поле (EF) на границе раздела кварц / вода на предметном стекле. Поочередно при возбуждении OTIR сфокусированный лазерный луч падает на периферию задней фокальной плоскости объектива, вызывая TIR на границе раздела стекло / вода на покровном стекле рядом с объективом. ( c ) Обнаружение излучения для трех цветовой схемы.Изображение кадрируется с помощью щели, так что конечный размер изображения покрывает одну треть кристалла ПЗС. Набор дихроиков позволяет разделить отдельные излучения трех флуорофоров и визуализировать их одновременно.

В PTIR инвертированный микроскоп приспособлен для удерживания призмы из плавленого кварца наверху канала для образца, а флуоресценция собирается с объектива под ^{40, 41} (). После того, как падающий лазерный луч фокусируется с помощью линзы с длинным фокусным расстоянием, он входит в призму, проходит через масло для согласования показателя преломления и внутренне отражается на границе раздела кварц-вода (и дополнительные методы онлайн).Сигнал флуоресценции собирают с помощью иммерсионного объектива с большим рабочим расстоянием (60 ×, числовая апертура 1,2 (NA)). PTIR необходим для экспериментов с закачкой жидкости, потому что его отображающая поверхность, состоящая из предметного стекла толщиной 1 мм, не прогибается при изменении давления во время потока. Дорогие (но пригодные для вторичной переработки) кварцевые предметные стекла необходимы для минимизации фона флуоресценции, и призму необходимо собирать заново каждый раз, когда загружается новый образец. Необходимость перенастройки пути освещения сводится к минимуму, если призма воспроизводимо размещается в одном и том же месте относительно корпуса микроскопа.

OTIR полагается на использование нефтяной цели с высоким NA для создания быстро исчезающего месторождения. Фокусировка луча в задней фокальной плоскости генерирует параллельный луч, выходящий из объектива, а затем, переводя его на периферию объектива, создает ПВО на границе раздела стекло / вода ^{40, 41} (). Флуоресценция молекул, привязанных к поверхности покровного стекла, собирается с использованием того же объектива. OTIR имеет более высокую эффективность сбора фотонов, освобождает пространство над образцом для дополнительного контроля образца и имеет коммерческие возможности.Во многом благодаря использованию объектива с низкой флуоресценцией UPlanSApo (100 ×, 1,4 NA, Olympus) мы можем получить данные smFRET для пары Cy3 / Cy5 с отношением сигнал / шум и площадью изображения, сопоставимой с призматическим типом ( неопубликованные результаты).

Обнаружение излучения

Микроскопия TIR приобрела популярность, отчасти благодаря новой волне высокочувствительных и быстрых камер с электронно-умножением на заряженные пары (EM-CCD) с передачей кадров ^{3, 42} . В установках smFRET обычно используются EM-CCD, которые обладают высокой квантовой эффективностью (85-95%) в диапазоне 450-700 нм, низким эффективным шумом считывания (<1 электрон, среднеквадратичное значение) даже при самой высокой скорости считывания (≥ 10 МГц), быстродействием скорость вертикального сдвига (≤ 1 мкс / строка; для достижения более высокой частоты кадров) и низкий уровень шума умножения.Используя EM-CCD 512 × 512 пикселей, мы можем получать данные с частотой от 33 Гц (при полном кадре) до 125 Гц (с биннингом 2 × 2).

Рассеянный свет возбуждающего лазера отклоняется от флуоресценции, собираемой объективом, с использованием длиннопроходного фильтра. Вертикальная щель вводится в плоскости формирования изображения сразу за боковым портом микроскопа, чтобы ограничить область изображения так, чтобы окончательное изображение, падающее на ПЗС-матрицу, было вдвое меньше размера ПЗС-кристалла (). Затем флуоресцентное излучение донора и акцептора разделяется с помощью дихроичного зеркала.Регулируя смещение с помощью дихроичного и дополнительного зеркала, излучение донора и акцептора может отображаться на ПЗС-камере рядом друг с другом (вставка). Эта оптическая схема отображает область изображения ∼75 мкм × 37 мкм на ПЗС-чипе. Простое расширение с использованием более узкой щели, соответствующей трети области ПЗС-матрицы, обеспечивает трехцветное обнаружение FRET (). Без дополнительных полосовых фильтров между каналами обнаружения возникают значительные перекрестные помехи (например, 40% излучения Cy5 попадает в Cy5.5, если Cy5.5 используется в качестве второго приемника), но тщательная калибровка и коррекция могут восстановить исходную интенсивность ⁴³ . Наш недавний тест показывает, что Cy7 является многообещающим флуорофором, который может заменить Cy5.5 в исходной трехцветной схеме FRET с одной молекулой; фотостабильность и яркость Cy7 были сопоставимы с таковыми Cy5.5, в то время как излучение Cy7 можно лучше отличить от излучения Cy5. Относительно низкая эффективность обнаружения камеры EMCCD на длине волны излучения Cy7 в настоящее время является проблемой, но это не должно быть проблемой для конфокальных измерений, поскольку кремниевый лавинный фотодиод поддерживает высокий квантовый выход обнаружения на этих длинах волн.Уменьшение пропускания в этой спектральной области можно до некоторой степени уменьшить с помощью оптимизированных для инфракрасного излучения объективов и оптики.

Подготовка образца к сбору данных

Иммобилизация поверхности

Хотя кварцевые слайды абсолютно необходимы для PTIR, тонкое покровное стекло формирует поверхность для визуализации OTIR, а обычные стеклянные покровные стекла обычно подходят для флуоресцентной визуализации одиночных молекул в OTIR. Для стабильной и специфической, но не мешающей иммобилизации образца на предметном стекле или покровном стекле обычно используется связь биотин-стрепавидин ^{5, 22, 44} .В эффективном методе исследований с участием только нуклеиновых кислот используется биотинилированный бычий сывороточный альбумин (биотин БСА), который адсорбируется на поверхности стекла / кварца и связывает биотинилированные молекулы через поливалентный стрептавидиновый белок (нейтравидин — менее дорогая альтернатива) (). При изучении белков неспецифическое связывание с поверхностью необходимо подавлять с помощью дополнительного пассивирующего агента, наиболее популярным из которых является полиэтиленгликоль (ПЭГ) ⁴⁵ . Предварительно очищенное поверхностно-активированное предметное стекло аминосиланизируется и реагирует с ПЭГ, модифицированным сложным эфиром N-гидроксисукцинимида (NHS), который также включает небольшую фракцию сложного эфира биотин-ПЭГ-NHS для специфического связывания () ⁴⁴ (Дополнительный протокол онлайн).Адгезию нуклеиновых кислот к поверхности ПЭГ при pH <7,0 можно уменьшить путем дальнейшей пассивирования поверхности сульфодисукцинимидилтартратом ⁴⁶ . Сильное взаимодействие между денатурированным белком и линейным ПЭГ можно устранить, используя вместо этого разветвленный ПЭГ, и они могут служить лучшими пассивирующими агентами ^{47, 48} . Белки, меченные гистидином, также могут быть прикреплены к поверхности с помощью хелатных групп Ni ²⁺ или Cu ^{2+ 49} , однако для оптимального ориентационного позиционирования и устранения поверхностных артефактов иногда может потребоваться спейсер между последовательностью гистидиновой метки и белок ().Некоторые из этих ПЭГилированных вариантов также коммерчески доступны (http://www.proteinslides.com/index.html). Более строгое отклонение неспецифического связывания может быть достигнуто путем повторения реакции ПЭГилирования два или три раза (Yuji Ishitsuka, личное сообщение).

Стратегии иммобилизации поверхности для экспериментов smFRET. ( a ) Белки биотин-БСА неспецифично связываются с биотинилированными молекулами поверхностного связывания с помощью поливалентных белков авидина (например, нейтравидина).( b ) Смесь биотин-ПЭГ и ПЭГ ковалентно прикрепляется к аминосиланизированной поверхности предметного стекла. Биотины на ПЭГ могут связываться с ДНК (или белком), сконструированной с биотиновым фрагментом, с помощью сэндвич-белка нейтравидина. Покрытие PEG предотвращает неспецифическое связывание. ( c ) Поверхности, покрытые ПЭГ, могут быть сконструированы так, чтобы нести Ni ²⁺ или Cu ²⁺ , хелатированные на иминодиуксусной кислоте (IDA) (или нитрилотриуксусной кислоте (NTA)), которые эффективно связываются с 6 × His-меченными белками. при сохранении функциональной активности.( d ) Используя димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) при комнатной температуре, везикулы, избирательно проницаемые для малых молекул, можно использовать для захвата биомолекул. Фракция биотинилированного липида позволяет специфически прикреплять везикулы к поверхности биотин-ПЭГ. Этикетки D и A обозначают донорные и акцепторные красители.

Инкапсуляция одиночных молекул внутри поверхностно-привязанных фосфолипидных везикул ^50-52 имитирует клеточный захват, уменьшает возмущение в системе и не требует привязки к молекуле.С принятием полупроницаемых пузырьков ⁵³ , этот подход позволяет изучать повторяющиеся столкновения между одним и тем же набором слабо взаимодействующих молекул в различных условиях раствора, не страдая от высокого фона ().

Камера для образцов

Герметичная камера для образцов создается путем прослоения двусторонней ленты или парафильма между предварительно очищенным предметным стеклом и покровным стеклом (см. Дополнительный протокол в Интернете) и путем нанесения эпоксидной смолы по мере необходимости. Простое пипетирование или перекачивание через два отверстия, предварительно просверленных в предметном стекле, позволяет заменять раствор без сушки ().Собранную камеру проверяют на неспецифическое связывание перед нанесением стрептавидина путем визуализации поверхности в присутствии 1 нМ меченой ДНК и / или белка. Если плотность неспецифически связанных флуоресцентных пятен составляет <10% от специфически связанных молекул (обычно специфическое прикрепление с «хорошей» плотностью обеспечивает ~ 0,1-0,2 пятен / мкм ² ), препарат на слайде считается приемлемым. После стрептавидина добавляются биотиновые биомолекулы в низких концентрациях (20-100 пМ в буфере, содержащем 0.1 мг / мл БСА для уменьшения потерь молекул на другие поверхности) для достижения иммобилизации при желаемой плотности одиночных молекул. Более высокая плотность увеличивает вероятность перекрытия соседних молекул. Фильмы с такими связанными молекулами приобретаются и сохраняются на жестком диске напрямую с помощью специальной программы, написанной на Visual C ++.

Камера для проб. ( a ) Камера для образцов состоит из предметного стекла микроскопа и покровного стекла с двусторонней лентой и герметизации эпоксидной смолой. Отверстия на слайде используются для входа и выхода обмена раствора.( b ) Шприц подсоединен к камере через трубку, а наконечник пипетки, содержащий раствор, плотно вставлен во входное отверстие. Когда шприц вытягивается, раствор вводится в камеру. Воспроизведено с ^{исх. 7} с разрешения Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Калибровка

Перекрестные помехи между каналами обнаружения необходимо скорректировать до оценки истинной эффективности FRET. С молекулами только донора и только акцептора, возбужденными на длинах волн возбуждения донора, мы определяем утечку излучения донора в канал (ы) акцептора и прямое возбуждение акцептора (ов) соответственно.При прямом возбуждении только акцепторных молекул (вблизи максимума поглощения) мы определяем утечку излучения акцептора в канал обнаружения донора.

Картирование между изображениями донора и акцептора выполняется с изображением привязанных к поверхности флуоресцентных микросфер со значительной эмиссией во всех каналах обнаружения. Мы вручную выбираем 3-4 пика флуоресценции в изображении донора и соответствующие им пики в изображении акцептора, и автоматический алгоритм генерирует линейное преобразование между двумя изображениями, которое корректирует смещение, поворот, масштабирование и искажение.

Обработка и анализ данных.

Алгоритмы обработки данных. сгенерированное отображение (

Эффективность FRET

После корректировки перекрестных помех и фона (определяемых по кривым интенсивности после фотообесцвечивания красителя) в обоих каналах кажущаяся эффективность FRET рассчитывается как E _app = I _A / ( I _A + I _D ), где I _A и I _D представляют интенсивности акцептора и донора, соответственно. E _app предоставляет только приблизительный индикатор расстояния между красителями из-за неопределенности в коэффициенте ориентации κ ² между двумя флуорофорами и необходимыми инструментальными поправками. Как показывает опыт, если анизотропия флуоресценции r обоих флуорофоров меньше 0,2, κ ² близка к 2/3 ^{34, 55} . Мы обнаружили, что в целом r > 0,2 для популярных флуорофоров smFRET, конъюгированных с нуклеиновыми кислотами или белками, поэтому необходимо соблюдать осторожность при извлечении информации об абсолютном расстоянии.Тем не менее, в каждом случае, который мы тестировали, кажущееся FRET было монотонной функцией расстояния. Чтобы определить фактическую эффективность FRET, необходимо определить поправочный коэффициент, γ , который учитывает различия в квантовом выходе и эффективности обнаружения между донором и акцептором. γ рассчитывается как отношение изменения интенсивности акцептора, ΔI _A к изменению интенсивности донора, ΔI _D при фотообесцвечивании акцептора ( γ = ΔI _A IΔI _Д ) ^{21, 56} .Затем рассчитывается скорректированная эффективность FRET с использованием выражения

Белки могут изменять фотофизические свойства флуорофора. Например, мы и другие наблюдали, что флуоресценция ДНК-конъюгированного Cy3 увеличивается, когда белок связывается около ^{57, 58} . Этот эффект изменяет эффективность FRET за счет изменения γ . Точно так же фотоиндуцированный перенос электронов между основаниями ДНК и красителем может тушить красители, и на это явление может влиять связывание с белками в окрестности ^59-61 .

Интерпретация данных: подводные камни и советы

Высокопроизводительные эксперименты на основе TIR помогают нам быстро получать статистически значимые объемы данных. Тогда основной проблемой является анализ и интерпретация данных, которые иногда могут сбивать с толку из-за потенциальных артефактов или двусмысленностей. Вот несколько советов о том, чего следует остерегаться.

1. Не останавливайтесь на «интересных» эффектах, наблюдаемых в небольшой части (<5%) молекул, потому что на этом уровне многие артефакты невозможно отличить от реальных событий.Вместо этого улучшите биологические конструкции и условия анализа, чтобы большинство молекул функционировало аналогичным образом.

2. Если поправочный коэффициент γ близок к 1, общий сигнал флуоресценции (сумма интенсивностей доноров и акцепторов), I total, должен оставаться постоянным. Постоянные изменения I _итого могут быть признаком неспецифической привязанности. Дополнительные источники интенсивного шума включают временное связывание флуоресцентных примесей, изменения свойств красителя из-за взаимодействия с белками или поверхностью или постепенную потерю фокуса.

3. Длинные видеоролики, которые показывают одноэтапные события фотообесцвечивания, должны быть сняты, чтобы убедиться, что полученный сигнал действительно исходит от отдельных молекул.

4. Обратимое выключение (так называемое мигание) Cy5 (или подобных красителей) ⁶² — хорошо известный артефакт (см.), Который часто ошибочно интерпретируется как большое изменение конформации в состояние с очень низким FRET, например макромолекулярное разворачивание. Эмпирическое правило заключается в том, что если FRET мгновенно падает до уровня только донора ( E _app = 0), считайте, что это мигает.Если очень низкое состояние FRET обнаруживается даже в присутствии подавителей мигания, таких как Trolox, и если прямое возбуждение акцептора подтверждает его активность, можно исключить мигание. Фотофизические явления, такие как мигание, также можно отличить по их известной зависимости от интенсивности возбуждения ²⁸ .

Хотя анализ данных по отдельным молекулам зависит от системы, стоит упомянуть некоторые часто используемые инструменты. Информацию о равновесных свойствах лучше всего получить с помощью гистограммы smFRET, полученной путем усреднения эффективности FRET каждой молекулы по первым 3-10 точкам данных.Обычно мы получаем 10-20 коротких (~ 5 с) фильмов о различных областях выборки для объективного обзора распределения населения. Временные траектории отдельных молекул (из длинных фильмов) в равновесии передают ценную кинетическую информацию системы через время пребывания в каждом конформационном состоянии. Например, для системы с двумя состояниями, претерпевающих стохастические переходы, скорости переходов определяются из экспоненциального спада, подходящего к распределению времени пребывания каждого состояния ⁶³ , или путем выполнения автокорреляционного анализа в сочетании с определением равновесия, если переходы слишком быстрые для надежных определение времени пребывания ⁶⁴ .Для более сложных переходов между отчетливо идентифицируемыми множественными состояниями можно использовать анализ скрытой марковской модели (HMM) для несмещенной оценки количества заселенных состояний FRET, оценки скорости взаимного преобразования между ними и определения наиболее вероятной временной эволюции каждое состояние ⁶⁵ (доступно для загрузки на http://bio.physics.uiuc.edu/HaMMy.html). График плотности переходов от начальных к конечным значениям FRET для каждого перехода, полученный из анализа HMM (или другого), обеспечивает визуально привлекательную и объективную компиляцию данных ^{57, 65-67} .Другие подходы, основанные на теории информации, также доступны для данных о конфокальных одиночных молекулах, полученных фотон за фотоном ^68-70 . Преимущества экспериментов с одной молекулой становятся более очевидными в неравновесных условиях, когда можно проследить, например, путь реакции одного фермента, претерпевающего серию переходов для достижения своего каталитического цикла. Мощный визуальный метод представления неравновесных данных smFRET многих молекул был разработан для исследований рибосом ⁷¹ .

Ограничения smFRET

Крайне важно указать на некоторые ограничения этого метода, прежде чем приступить к разработке первого эксперимента smFRET. (1) smFRET требует присоединения по крайней мере двух внешних красителей к интересующей молекуле (ам), поскольку (полу) собственные хромофоры, такие как 2-аминопурин и триптофан, недостаточно яркие или фотостабильные для измерения одиночных молекул. В некоторых случаях сайт-специфическое мечение не является тривиальным, особенно для больших молекул РНК ^{72, 73} и многих белков ^{74, 75} .Обратите внимание, что smFRET относительно нечувствителен к неполной разметке. Если донор отсутствует, молекула просто не наблюдается; если акцептор отсутствует, этот вид только-донора обнаруживается как популяция с нулевым FRET. (2) Поскольку обнаружение одиночных молекул достигается за счет пространственного разделения, слабо взаимодействующие флуоресцентные частицы трудно изучать (но не всегда, см. Выше, ). (3) FRET нечувствителен к изменениям расстояния за пределами диапазона расстояний между красителями 2-8 нм для R ₀ = 5 нм.Однако изменение расстояния до 0,3 нм может быть обнаружено для одиночных молекул между 0,6 R ₀ и 1,5 R ₀ , где FRET является почти линейной функцией R. (4) Для достижения адекватного сигнала: Отношение к шуму, необходимо зарегистрировать ∼100 полных фотонов. Учитывая, что до фотообесцвечивания можно собрать более 10 ⁵ фотонов из отдельных молекул красителя, можно получить более 10 ³ точек данных. (5) Временное разрешение ограничено частотой кадров ПЗС-камеры (в лучшем случае = 1 мс).(6) Оценка абсолютного расстояния является сложной задачей из-за зависимости флуоресцентных свойств и передачи энергии от окружающей среды и ориентации красителей. Таким образом, smFRET использовался в основном для задач, где точная информация о расстоянии не важна. Тем не менее, можно сделать разумные оценки факторов ориентации ⁷⁶ , и контрольные эксперименты с каждым красителем могут обеспечить хорошее приближение расстояний между красителями ^{77, 78} . Опасения по поводу этих проблем можно было бы дополнительно уменьшить, используя избыточное количество ограничений расстояния в исследованиях триангуляции ^{79, 80} .

Усовершенствованные методы smFRET

Некоторые из новых интересных технических разработок, все еще находящихся на стадии проверки принципа работы, кратко излагаются ниже.

По мере усложнения исследуемой системы требуется дополнительная информация для устранения неоднозначности. Для этой цели был реализован трехцветный smFRET с использованием Cy3 (донор), Cy5 (акцептор 1) и Cy5.5 (акцептор 2) в качестве трех отдельных флуорофоров, оптимизации конфокальной оптики обнаружения и разработки новой схемы анализа данных ⁴³ .Используя эту технику, были обнаружены коррелированные движения различных сегментов четырехстороннего соединения ДНК (Холлидея). Трехцветный smFRET также работает на основе TIRF и привел к прямому наблюдению за движением белка на одноцепочечной ДНК (неопубликованные результаты). Трехцветное обнаружение одной молекулы также использовалось для различения нескольких видов и наблюдения взаимодействий между тремя разными молекулами ^{81, 82} . Многоцветная схема возбуждения для дальнейшего различения различных молекулярных частиц ^{83, 84} недавно была расширена до трехцветной FRET ⁸⁵ .Также были показаны перспективы дальнейшего расширения FRET с помощью нескольких флуорофоров на отдельных молекулах ДНК ⁸⁶ .

По мере признания важности механических факторов в биологии, к smFRET добавляется недостающее измерение контролируемого манипулирования силой с конечной целью измерения конформационных изменений с помощью флуоресценции как функции силы, применяемой такими методами, как оптические и магнитные. пинцет. Оптические пинцеты были объединены с функцией расшифровки флуоресценции одиночных молекул ⁸⁷ и FRET ⁸⁸ , чтобы сообщить о принудительном распаковке шпильки ДНК.Магнитный пинцет использовали для построения калибровочной кривой FRET в зависимости от силы для энтропийной пружины, изготовленной из однонитевой ДНК ⁸⁹ . Совсем недавно отклик одиночных узлов Холлидея при низкой силе отслеживался с помощью гибридного инструмента, объединяющего FRET и оптический пинцет, чтобы составить карту 2D складчатого ландшафта ⁹⁰ . smFRET также был объединен с одноканальной записью простого димерного канала грамицидина ^{91, 92} .

Заключительные примечания

Мы обсудили практические вопросы по хорошо зарекомендовавшей себя системе smFRET на основе МДП, а также кратко упомянули более футуристические технические разработки.Две области, которые все еще не разработаны, — это измерения в живой клетке, что, вероятно, требует значительных улучшений зондов, и анализ динамики мембранных белков, что уже является сложной задачей на уровне ансамбля. Тем не менее, smFRET является одним из мощных инструментов для «изучения» динамики и взаимодействия отдельных биомолекул в реальном времени. Все, что нам нужно сейчас, — это открыть глаза «одной молекулы» на широкий спектр биомолекулярных взаимодействий, требующих тщательного изучения.

Дополнительный материал

Дополнительные материалы

Дополнительная таблица 1 : Список материалов и реагентов

Дополнительная таблица 2 : Список оптики и инструментов

Дополнительный протокол : Протокол пассивирования поверхности полиэтиленгликоля (PEG 9000)

Дополнительные методы : Настройка возбуждения и излучения МДП

Благодарности

Мы благодарим И. Расника, С. Маккинни, К.Джу, Р. Клегг, С. Мион и члены группы Ха в Университете Иллинойса и К. Дрексхаге из Университета Зигена за экспертные консультации и обсуждение, С. Сайед из Университета Иллинойса за закупку красителей и реагентов и П. Корниш, М. Бреннеру и Л. Суприя за внимательное чтение рукописи. К. Джу подготовил видеоинструкцию по приготовлению слайдов с ПЭГ. Авторская работа по FRET с одной молекулой финансировалась Национальными институтами здравоохранения, карьерной премией Национального научного фонда и Медицинским институтом Говарда Хьюза.SH также была поддержана Фондом научно-исследовательских работ для нового факультета Сеульского национального университета (Корея), грантом Министерства науки и технологий (№ RH0-2005-000-01003-0, 2007) и грантом на фундаментальные научные исследования из Кореи. Исследовательский фонд.

Список литературы

Симптомы сухой гитары

Никакие условия окружающей среды не могут нанести вашему инструменту большего вреда, чем низкая относительная влажность (RH).Во многих регионах США круглый год наблюдается естественная низкая влажность. Например, в районе Скалистых гор, как и в Фениксе, Рино, Лас-Вегасе и ряде других городов, общеизвестно низкий уровень относительной влажности. Однако в большинстве регионов страны низкие уровни относительной влажности сопровождают наступление зимы, в основном из-за эффектов искусственного обогрева наших домов и зданий.

Если вы читали различные ссылки на проблемы, связанные с влажностью, опубликованные в нашем информационном бюллетене Wood & Steel, вы знаете, что более холодные месяцы наносят ущерб акустическим гитарам из цельного дерева.Когда погода становится влажной и температура падает, возникает естественная тенденция включать внутренние отопительные приборы. К сожалению, многие не осознают, что нагревание комнаты снижает относительную влажность до уровня, который представляет реальную угрозу для качественных акустических гитар, буквально высыхая их. Суть в отношении сухости заключается в том, что если ваша гитара не находится в комфортном диапазоне относительной влажности 45-55 процентов, она может треснуть. Мы настоятельно рекомендуем использовать увлажнитель для гитары вместе с цифровым гигрометром для точного измерения уровня влажности в том месте, где вы храните гитару.(Советы по использованию увлажнителей см. В техническом описании Taylor «Использование увлажнителя для гитары».) Следующая информация подробно описывает неблагоприятное воздействие сухости на гитары, характерные индикаторы сильной сухости и шаги, которые можно предпринять, чтобы противодействовать. эти эффекты.

Время от времени нам звонит покупатель, который расстраивается из-за проблем с «гудением струн» на его гитаре. Он или она может заметить, что струны расположены ближе к ладам, чем когда они были новыми. Струны «гудят» еще хуже, когда играют в высоких регистрах, но может показаться, что поднятие седла, достаточное для устранения проблемы, приведет к необычно высокому седлу.

В таких случаях мы сразу распознаем, что гитара «высохла», что вызывает ряд связанных проблем: арка в верхней части тонет, унося с собой мост; шея наклоняется вперед, что требует регулировки анкерного стержня; Гриф сжимается в ширину, в результате чего острые концы ладов выходят за край грифа.

В совокупности эти события могут сделать гитару похожей на плохо сделанную гриф. На самом деле с грифом все в порядке — проблема в корпусе, и это можно исправить с помощью регулировки анкерного стержня и использования гитарного увлажнителя.Однако многим клиентам все еще трудно поверить, что такое простое решение, как увлажнение тела, решит серьезную проблему с шеей. Позвольте нам вас убедить.

Когда мы делаем гитару, древесина сначала сушится, или «выдерживается», и приспосабливается к определенному содержанию влаги. В результате все гитары покидают завод в одном и том же состоянии, и все они будут более или менее одинаково реагировать на изменения влажности.

Наш завод оснащен системой климат-контроля, позволяющей поддерживать температуру 74 градуса и относительную влажность 47 процентов.Эта консистенция заставляет древесину выравниваться при определенном содержании влаги, идеально подходящем для изготовления гитар. По мере изменения содержания влаги в древесине изменяется и размер древесины. В частности, ель сильно сжимается и расширяется по мере того, как набирает и теряет влагу. Например, предположим, что мы кондиционируем верхушку ели в комнате с относительной влажностью 47%, а затем разрезаем эту ель до ширины 16 дюймов. Если бы мы тогда понизили относительную влажность комнаты до 30 процентов, тот же кусок ели уменьшился бы до 15.Ширина 9 дюймов — усадка почти 1/8 дюйма! Если вместо этого мы увеличим относительную влажность комнаты до 60 процентов, ель раздувается до 16,06 дюйма, т.е. расширение почти на 1/16 дюйма. Хотя наши методы сушки и кондиционирования древесины минимизируют это движение, древесина остается деревом, поэтому даже после того, как она станет гитарой, значительные колебания влажности вызовут усадку или рост древесины.

Причина, по которой мы предпочитаем относительную влажность 47 процентов, заключается в том, что это очень «нормальная» или «средняя» влажность.При таком уровне относительной влажности гитара может подвергаться большей или меньшей влажности и при этом работать хорошо. Чем более резкие колебания температуры и / или влажности, тем быстрее это повлияет на гитару.

Хорошая новость заключается в том, что вашу гитару можно защитить от многих изменений, просто поместив ее в футляр, что поможет защитить гитару и замедлит разрушительное воздействие низкой влажности. Если он станет слишком сухим, его влажность и форму можно восстановить, подвергнув его воздействию влаги.Увлажнитель для гитары отлично справляется с этим.

Для справки, посмотрите прилагаемые фотографии гитары, присланной нам покупателем. Гитарный увлажнитель и регулировка анкерного стержня — все, что требовалось, чтобы переломить эту катастрофическую ситуацию.

Родная магнитола «Лады Грантс»: характеристики, установка и прошивка

Сегодня сложно представить машину без автомагнитолы. Сейчас такое устройство считается не роскошью, а очень важной составляющей современного транспортного средства.В этой статье мы рассмотрим основные характеристики штатной магнитолы Lada Grants, а также правила и особенности ее установки и прошивки.

Вступительное слово

С каждым годом представления о качестве и простоте использования транспортного средства все больше меняются и улучшаются. Теперь вы можете не только получать удовольствие от вождения любимой машины, но и слушать любимую музыку, различные радиопередачи, смотреть видео и даже быть пользователем Интернета. Безусловно, наличие всех этих функций сделает вашу жизнь комфортнее и удобнее.

Как известно, чем дороже машина, тем в ней установлена ​​более качественная аудиосистема. То же можно сказать и об автомобиле Lada Grant Lux. Головное устройство здесь будет максимально качественным. Такой прибор, несомненно, удивит всех автолюбителей. Конечно, ведь многим понравится наличие огромного функционала, надежной и безопасной рабочей системы, с очень удобным и качественным интерфейсом. Такой прибор отлично вписывается в интерьер транспортного средства и правильно выполняет все возложенные на него задачи.

Штатная магнитола «Лады Грантс»: характеристики

Ни для кого не секрет, что данный аппарат выпущен отечественным производителем. Итак, никогда раньше отечественная штатная аудиотехника не была такой качественной, современной и продвинутой. Головное устройство «Лада Грантс» выпускал очень популярный в этой сфере производитель — компания «Ительма».

Устройство оснащено жидкокристаллическим экраном, а также имеет сенсорную систему управления. Несмотря на то, что дисплей построен по резистивным технологиям, это нельзя назвать сильным недостатком.Конечно, это создает небольшой дискомфорт при использовании автомагнитолы водителями, но зато устройство будет бесперебойно работать даже в самых тяжелых условиях, например, в постоянных сильных морозах.

Штатная магнитола Lada Grants имеет отличную цветовую схему и разрешение экрана, особенно если вспомнить, что это оборудование отечественного производителя. Даже при ярком солнечном свете вы можете легко увидеть все, что отображается на ЖК-экране. Следовательно, можно сделать вывод, что при солнечном свете видимость и читаемость экрана не нарушаются.И это несравненный плюс, свидетельствующий об отличном качестве русского радио.

Также стоит отметить радиоинтерфейс. Что немаловажно, он русифицирован, выполнен в очень удобном и понятном стиле. Таким образом, каждый пользователь, даже новичок, сможет разобраться в системе управления и использования. По словам автовладельцев Lada Grants, это штатное устройство действительно очень хорошо выполняет свою работу, работает очень хорошо и быстро, при этом очень простое и удобное в использовании.

Технические характеристики

Каждый владелец автомобиля знает, насколько важны его технические характеристики для автомагнитолы.Ведь обладая этой информацией, вы сразу можете иметь представление о том, что получите в будущем.

Штатная магнитола «Лада Грантс» имеет следующие технические характеристики:

— объем внутренней памяти самого устройства составляет 5341184 байт, объем оперативной памяти — 128 мегабайт;

— Магнитола поддерживает музыкальные форматы MP3, WMA, WAV;

— устройство работает благодаря процессору SIRF Atlas-V AT551;

— в автомагнитолу встроен качественный радиоприемник;

— также, что очень важно, в устройстве есть встроенный видеовход для камеры;

— с его помощью можно просматривать всевозможные популярные форматы изображений;

— возможность воспроизведения видео с расширением 240 на 320 пикселей;

— Кроме того, вы можете читать любую информацию, полученную с USB или SD носителя;

— Устройство оснащено функцией Bluetooth.

Штатная магнитола Lada Grants, характеристики которой были описаны выше, работает благодаря операционной системе Windows, поэтому у водителей есть возможность самостоятельно прошить данное устройство, что автовладельцы и делают очень часто. Благодаря этой прошивке есть возможность добавить недостающие функции в существующую базу данных или исправить появившиеся системные ошибки.

Есть ли недостатки????????????Но, несмотря на это, все же есть недостатки, с которыми не могут согласиться некоторые автомобилисты.

Например, это устройство не поддерживает чтение компакт-дисков. Производители даже разъема для этого корпуса не оставили. Конечно, в общих чертах это нельзя назвать большим недостатком. Но некоторые меломаны крайне недовольны такой «ошибкой» производителя. Ведь, как известно, чистый звук может передавать только компакт-диск.

Также многие водители жалуются на не очень качественную функцию Bluetooth.Конечно, есть в наличии, и это неоспоримый плюс. Но при передаче информации система может полностью зависнуть.

Владельцы автомобилей с чистейшим слухом замечают, что мощность звука радио не соответствует 13-дюймовым динамикам, входящим в комплект. Однако такая проблема очень легко решается их заменой.

Стоит сказать несколько слов о воспроизведении видео. Очень много сложностей возникает при работе с видео в формате AVI 720.

Прошивка

Прошивка штатной магнитолы Lada Grants позволяет добавлять новые функции в операционную систему, а также исправлять существующие ошибки.Рассмотрим, чего именно можно добиться с помощью прошивки:

— можно правильно синхронизировать работу камеры заднего вида и самой магнитолы;

— Также, что очень важно, вы можете добавить функцию навигации. Это будет особенно полезно при поездках на большие расстояния;

— при необходимости можно подключить модем и безопасный доступ в Интернет.

Стандартный набор характеристик данной автомагнитолы способен полностью удовлетворить потребности среднего водителя.Однако если вы хотите увеличить количество функций, то прошивка штатной магнитолы Lada Granta может вам в этом помочь. Вы легко можете найти новую прошивку в Интернете. Однако не забывайте, что, пользуясь неофициальными материалами, вы снимаете устройство с гарантийного обслуживания.

Радиоустановка

Как известно, в стандартной версии автомобиля автомагнитола отсутствует, поэтому сразу возникает вопрос, как установить магнитолу на «Ладу Грант». На самом деле сделать это очень просто, так как место для устройства было предусмотрено еще при изготовлении самого автомобиля.

В «Гранте» ниша для магнитолы сделана таким образом, что нет необходимости тянуть дополнительные провода. Для начала возьмите плоскую отвертку и снимите пластиковый карман, который находится в том месте, где вы будете устанавливать магнитолу. За этим карманом вы увидите несколько разъемов, к которым, собственно, и нужно подключить ваше устройство. Соедините эти два разъема и поместите устройство на предполагаемое место. Установка штатной магнитолы Лада Грантс займет совсем немного времени, поэтому вы можете сделать это самостоятельно.Но при необходимости можно обратиться к специалисту.

Установка динамиков на передние двери

Подключение магнитолы Лада Грантс должно сопровождаться установкой динамиков на передние двери. Для этого придется демонтировать дверные накладки с ручками, а также регуляторы положения стекол автомобиля. Теперь с помощью специальных шаблонов нужно вырезать отверстия для самих динамиков. Закрепите динамики в подготовленных вами отверстиях с помощью саморезов и протяните провода через специальные входы, предназначенные для стереосистемы.Теперь нужно поставить на место все разобранные детали автомобиля. Учтите, что все работы можно производить только при отключенном минусе на аккуме.

Как происходит процесс перепрошивки

В данной статье был рассмотрен обзор штатной магнитолы Лада Грантс. Теперь нужно разобраться, как правильно выполнить его прошивку. Для этого вам придется использовать SD-карту с возможностью форматирования FAT. Скачайте на него прошивку.

Проще всего найти на различных форумах автолюбителей.Теперь вставьте карту в специальное отверстие для нее на магнитоле и перезагрузите само музыкальное устройство.

Усилители звука

Довольно часто воспроизведение звука, издаваемого штатной мультимедийной системой, не устраивает автомобилистов, поэтому к лифтбеку Лада Грантс подключают различные усилители звука. Магнитола в этом случае не пострадает, но звук действительно будет намного чище.Для этого придется демонтировать нижнюю часть центральной панели и снять консоль. Там вы найдете несколько разъемов mini iso. Найдите желтый разъем и вставьте в него вилку приобретенного вами провода.

В этом случае зеленый и синий провода необходимо оставить в исходном виде. Автовладельцы, выполняющие эту процедуру, отмечают, что в этом случае нельзя использовать штатные провода.

выводы

Магнитола Лада Грантс является товаром хорошего качества отечественного производителя.Многие автолюбители довольны данным устройством, но не возражают и немного «поправят» его прошивкой.

Архив температурной компенсации — Швейцария (США)

Разработка и создание самолета — сложная задача, и ни в коем случае не мелкий подвиг. Бесконечные расчеты, проектирование, моделирование и перепроектирование кажутся бесконечным процессом; однако в конечном итоге мы достигнем рубежа интенсивного тестирования! Это очень увлекательный процесс, все трехмерные детали, которые вы спроектировали, системы, которые вы собрали вместе, и все компоненты теперь находятся прямо перед вами.Пора доказать себе и своим менеджерам, что все будет работать безупречно, но не забегайте вперед! Для этого нам нужно первоклассное оборудование для записи данных, чтобы проверить работу нашей системы. Более того, нам нужны испытательные датчики, которые могут работать в самых экстремальных условиях как внутри, так и снаружи самолета. Что ж, именно поэтому STS здесь, чтобы предоставить нам надежные датчики измерения давления, чтобы гарантировать, что наши раунды испытаний под давлением работают так же плавно, как и система, которую мы разработали.Мы проведем оставшуюся часть этой статьи, представляя пошаговое руководство, чтобы полностью познакомить вас с полным спектром возможностей, которые предлагает STS, и с тем, как интегрировать их в нашу систему.

Точность

Шаг первый, нам нужно внимательно изучить систему самолета, которую мы тестируем, и определить точность, необходимую для сбора данных. Например, гидравлическая система, которая управляет тормозами самолета, часто работает в определенном диапазоне давлений, и этот диапазон достаточно велик, чтобы исключительная точность не требовалась при выборе испытательного датчика.Поэтому вариант STS с ± 0,25% полной шкалы будет подходящим вариантом. С другой стороны, давление масла необходимо контролировать гораздо более разумно по сравнению с тормозной гидравликой. Имея это в виду, мы можем выбрать опцию STS для высокоточного датчика давления с наивысшей доступной степенью точности, а именно ± 0,05% полной шкалы, чтобы гарантировать, что давление масла остается на пиковом уровне во всей системе двигателя.

Температура

Теперь, когда мы установили требуемую точность для нашего приложения, давайте перейдем к интеграции датчика давления в нашу систему испытательного самолета.Естественно, что ориентированные на давление системы на самолете исключительно разнообразны с точки зрения размера, рабочей температуры и среды под давлением; следовательно, нам нужна свобода выбора каждой из этих функций для нашего датчика.

На следующем этапе выбора обратим внимание на рабочую температуру. В самолете ваш тестовый датчик давления потенциально может записывать данные в душных пределах моторного отсека. И наоборот, он может быть расположен снаружи, измеряя давление Пито или, возможно, давление жидкости для удаления льда, и в этом случае рабочая температура будет значительно ниже, чем в моторном отсеке.Не бойтесь, STS предлагает впечатляющий диапазон рабочих температур от -25 до 125 ° C. Этот базовый диапазон в целом покрывает большинство наших потребностей в давлении в аэрокосмической отрасли. Чтобы сделать сделку еще более приятной, все датчики STS производятся с учетом компенсированного диапазона температур, что означает, что внутренняя погрешность измерения значительно ниже в пределах, указанных выше. Это исключительно полезная функция при проведении интенсивных испытаний наших систем давления!

Вышеупомянутый температурный диапазон никоим образом не высечен.Когда возникает необходимость, мы можем выбрать оснащение нашего датчика охлаждающими ребрами для повышения максимальной температуры до 150 ° C.Такая потребность может возникнуть, если датчик должен быть расположен рядом с выхлопной системой двигателя, которая может излучать значительно большие количество тепла. Кроме того, мы можем выбрать для нашего датчика минимальную температуру -40 ° C, если датчик будет находиться на очень большой высоте. Это охватывает процесс выбора температурного сопротивления вашего датчика; всегда помните о своей операционной среде!

Присоединение к процессу

Как упоминалось ранее, размеры и размеры различных систем давления в самолете далеко не постоянны.Следовательно, следующим шагом в нашем процессе выбора является определение оптимального места для датчика и выбор разъема, который позволит датчику поместиться в этом конкретном месте. Например, возьмем тормозную систему самолета. Гидравлическая система будет состоять из труб и компонентов различных размеров, но после того, как вы выберете точное место для вашего датчика, можно будет выбрать технологическое соединение. STS предлагает ряд размеров и диафрагм, включая G ¼ M и G ½ M с дополнительным выбором для Hastelloy и фронтальных диафрагм, среди прочего.Этот широкий диапазон возможных вариантов выбора гарантирует, что мы можем заказать датчик, который будет идеально вставлен в нашу испытательную систему без какой-либо специальной модификации для установки, что снижает нашу рабочую нагрузку!

Уплотнения

Последний важный компонент нашего испытательного датчика, который мы рассмотрим, — это доступные нам уплотнительные материалы. Как и в случае технологического соединителя, выбор материала для уплотнения датчика во многом зависит от жидкости, из которой состоит ваша система давления.К счастью для нас, работающих в аэрокосмической сфере, наши системы давления редко подвергаются воздействию коррозионных, кислотных или других неприятных жидкостей. Тем не менее, мы все же должны подумать о наших печатях. В случае нашей гидравлической системы для шасси стандартным выбором является нитрил (NBR) в качестве уплотнения. Этот резиноподобный материал идеально подходит для этого применения, помимо того, что он устойчив к маслам и другим смазочным материалам. Однако, если мы ожидаем высоких температур или других суровых условий в моторном отсеке, то витон будет гораздо более подходящим выбором с его улучшенной термостойкостью и долговечностью.И последнее, но не менее важное: резина EPDM зарекомендовала себя при работе с тормозными жидкостями. Это только три из множества вариантов уплотнения, которые предлагает STS, и главный вывод заключается в том, что не все уплотнения взаимозаменяемы. Изучите свою систему, доступные варианты и сделайте лучший выбор, чтобы обеспечить оптимальные результаты датчика!

Теперь вы полностью готовы начать процесс выбора датчика давления для аэрокосмических испытаний! Мы рассмотрели уровень точности, необходимый для вашего датчика, который зависит от конкретной системы, в которой расположен датчик.Затем мы перешли к определению правильного уровня термостойкости, необходимого для наших индивидуальных приложений. Затем следует технологическое соединение, где мы можем выбрать различные размеры и диафрагмы, чтобы гарантировать, что датчик всегда соответствует нашим конкретным потребностям. Нашим последним пунктом было объяснение основных различий между множеством доступных вам вариантов уплотнения и идеальным применением каждого из них. Обладая этой информацией, вы можете посмотреть на основные компоненты вашего датчика испытательного давления и сделать лучший выбор, чтобы убедиться, что ваш датчик буквально создан специально для вас!

Структурная динамика спирали миозинового реле по данным ЭПР и FRET с временным разрешением

Реферат

Мы использовали два дополнительных метода спектроскопии с временным разрешением, диполярный электронно-электронный резонанс и флуоресцентный резонансный перенос энергии, чтобы определить конформационные изменения в единственном структурном элементе моторного домена миозина, релейной спирали, до и после инсульта восстановления.Два мутанта с двойным Cys метили оптическими зондами или спиновыми метками и определяли межзондовые расстояния. Оба метода разрешили два различных структурных состояния миозина, соответствующих прямым и изогнутым конформациям релейной спирали. Изогнутое состояние было занято только после добавления нуклеотидов, что указывает на то, что релейная спираль, как и вся миозиновая головка, изгибается в ходе восстановления. Однако насыщение миозина нуклеотидом, приводящее к единственному биохимическому состоянию, не приводило к единому структурному состоянию.Как прямые, так и изогнутые структурные состояния релейной спирали были заняты, когда в активном сайте были связаны аналоги АТФ (ADP.BeF _x ) или ADP.P _i (ADP.AlF ₄ ). Большая популяция была обнаружена в изогнутом структурном состоянии, когда был связан постгидролизный аналог ADP.AlF ₄ . Мы пришли к выводу, что изгиб эстафетной спирали в ходе восстановления не требует гидролиза АТФ, но ему способствует. Более узкое распределение расстояний между зондами показывает упорядочение релейной спирали, несмотря на ее изгиб, во время такта восстановления, обеспечивая дальнейшее понимание динамики этого структурного перехода, преобразующего энергию.

Миозин — это молекулярный мотор, который генерирует силу на актин при сокращении мышц, перемещении клеток и внутриклеточном движении. Миозин работает циклически, дважды за цикл меняя свою структуру, производя силовой удар и восстановительный удар. Эти структурные изменения модулируются связыванием и гидролизом АТФ. Рентгеновские кристаллические структуры миозина в различных биохимических состояниях, захваченные аналогами нуклеотидов, которые, как считается, имитируют структурные промежуточные соединения миозина, предоставляют информацию о молекулярной организации и чувствительности к связыванию нуклеотидов, но молекулярные механизмы структурных переходов в растворе остаются неизвестными.Более того, взаимосвязь между связанным нуклеотидом и кристаллической структурой миозина не совсем согласована. Например, две различные кристаллические структуры были получены для миозина в комплексе с нуклеотидным аналогом ADP.BeF _x (1, 2). Неясно, отражают ли эти различия внутреннее свойство миозина, или они просто возникают из-за различий в условиях кристаллизации. Как недавно было написано в обзоре (3), для дополнительного понимания необходимы сайт-ориентированное мечение и спектроскопия с использованием кристаллографических данных в качестве отправной точки.

На основании кристаллических структур миозина (4–6) и спектроскопии (7) было предложено, что домен, связывающий легкую цепь, вращается относительно каталитического домена, заставляя миозиновую головку выпрямляться при силовом ударе и изгибаться. ход восстановления (рис. 1 A ). Эти же кристаллические структуры предполагают, что этот переход между прямой (M *) и изогнутой (M **) структурами отражает удивительно похожий переход в релейной спирали (рис.1 B ), α-спираль длиной 4,7 нм, которая связывает сайт связывания нуклеотидов с доменом легкой цепи через домен-конвертер (4, 5).Цель настоящего исследования — проверить эту гипотезу непосредственно в растворе во время восстановительного инсульта.

Предлагаемая координация домена легкой цепи и релейной спирали. ( A ) Миозин S1 связан с актином (коричневый) в состояниях до восстановления (M *, S1 зеленый) и после восстановления (M **, S1 красный) (3). ( B ) Миозиновый моторный домен, наложение кристаллических структур 1FMV (M *, релейная спираль, зеленый) и 1VOM (M **, релейная спираль, красный), демонстрирующие предполагаемый изгиб релейной спирали.Оранжевый указывает на спроектированные участки маркировки, показывая прогнозируемое сокращение расстояния между 639 и 498 (голубые стрелки) и между 515 и 498 (пурпурные стрелки) во время такта восстановления.

Мы сконструировали два мутанта миозина с двойным Cys Dictyostelium discoideum, с одним сайтом мечения, расположенным на С-конце релейной спирали (K498C), а другим — внутри стабильных спиралей в нижнем 50K-домене (D515C или A639C) (рис. 1 ). В ). Эти цистеины были помечены либо нитроксидной спиновой меткой, либо донорно-акцепторной парой.Затем мы измерили межзондовые расстояния с помощью ЭПР с временным разрешением (диполярный электронно-электронный резонанс (DEER)) и FRET с временным разрешением (TR-FRET) для определения структурных состояний релейной спирали в различных биохимических состояниях миозина.

Сайт-направленная спектроскопия ранее использовалась для обнаружения нуклеотид-зависимых структурных переходов в миозине. Флуоресценция мутантов миозина с одним Trp (9, 10) и ЭПР спиновых меток, прикрепленных к сайтам с одним Cys (11, 12), показали нуклеотид-зависимые изменения в локальном окружении меченых сайтов, и предыдущие исследования FRET (8, 13) ) предоставили информацию о структуре всей миозиновой головки, но ни одно из этих исследований не разрешило структурные состояния отдельного структурного элемента внутри миозина.В настоящем исследовании мы использовали ЭПР с временным разрешением и TR-FRET для получения структурного разрешения, необходимого для обнаружения движения, беспорядка и конформационной гетерогенности в пределах одного субдомена миозина, информации, необходимой для выяснения механизма междоменного взаимодействия и принципов энергии. трансдукция в миозине.

Результаты

Изгиб спирали реле, определяемый DEER.

DEER — это метод импульсного спинового эха ЭПР, который обнаруживает зависящие от расстояния дипольные взаимодействия между парой электронных спинов (14).Из-за зависимости r ⁻³ дипольного взаимодействия и детектирования с временным разрешением, этот метод сообщает распределение спин-спиновых расстояний в образце с высоким разрешением в диапазоне от 2 до 6 нм (15). Спин-меченый миозин был захвачен в различных биохимических состояниях: M (апо), M.ADP, M.ATP (M.ADP.BeF _x ) и M.ADP.P _i (M.ADP.AlF _{). 4} или M.ADP.V _и ), а распределения межзондовых расстояний измеряли с помощью DEER (рис.2). Данные, полученные для M.ADP.AlF ₄ и M.ADP.V _i (улавливание биохимического состояния, аналогичного M.ADP.P _i ), были практически идентичны, поэтому в данном исследовании приводится только первый аналог. . Для обоих миозиновых мутантов связывание нуклеотидов вызывает более быстрый распад и колебания амплитуды спинового эха, что прямо указывает на уменьшение расстояния между зондами. По сравнению с состоянием апомиозина, ADP оказал наименьшее влияние на данные DEER, ADP.AlF ₄ имел наибольший эффект и эффект ADP.BeF _x (аналог АТФ) был промежуточным (рис. 2).

Перегиб спирали реле разрешен ОЛЕНЬЕМ. ( Left ) Данные DEER с поправкой на фон, полученные из указанных биохимических состояний, нормированные на постоянную глубину модуляции и смещенные по вертикали для ясности. ( Right ) Распределения расстояний, извлеченные из данных DEER (M и M.ADP: одногауссово распределение, M.ADP.BeF _X , M.ADP.AlF ₄ : двухгауссово распределение). Параметры распределений приведены в таблице 1.

Сигналы спинового эха были смоделированы и подогнаны к экспериментальным данным с использованием гауссовых распределений расстояний (уравнение 1 ). В состоянии апо или с привязанным ADP одного гауссовского распределения расстояний было достаточно для получения качественной подгонки. Добавление второго гауссовского распределения расстояний не улучшило подгонку (рис. S1), указывая на единственную конформацию релейной спирали (рис. 2). Расстояние между зондами было наибольшим в состоянии апо, и наблюдалось небольшое, но последовательное уменьшение расстояния при связывании АДФ.Когда миозин образовывал комплекс с ADP.BeF _x или ADP.AlF ₄ , удовлетворительные совпадения были получены только с двухгауссовым распределением расстояний, отражающим два структурных состояния миозина с более длинными и более короткими расстояниями между зондами (рис. S1). . Все длинные и короткие расстояния, извлеченные из индивидуальных совпадений сигналов спинового эха, были подобны между комплексами M.ADP, M.ADP.AlF ₄ и M.ADP.Be.F _x . Следовательно, сигналы, соответствующие этим биохимическим состояниям, были подобраны глобально, предполагая, что присутствовали одни и те же два состояния, M * и M ** (характеризующиеся одинаковыми средними межзондовыми расстояниями R * и R **) (рис.2 и таблица 1). Качество этих подгонок, судя по значениям χ ² , было сопоставимо с качеством индивидуальных подгонок без ограничений, что указывает на наличие только двух различных структурных состояний (рис. 3 A и C ).

Распределение расстояний, R (FWHM) и мольные доли, наблюдаемые в каждом биохимическом состоянии, обнаруженные с помощью DEER (рис. 2)

Подгонка сигналов DEER в различных биохимических состояниях миозина (мутант 639: 498).( A ) Каждый сигнал был адаптирован независимо. ( B ) Все сигналы были согласованы глобально с использованием одного набора параметров: R *, R **, FWHM *, FWHM **. ( C ) Все сигналы были согласованы глобально с использованием одного набора параметров, за исключением того, что FWHM * для M.ADP было разрешено отличаться от такового для M.ADP.BeF _x и M.ADP.AlF ₄ . Мы пришли к выводу, что два структурных состояния M * и M ** имеют одинаковые средние расстояния R * и R ** во всех трех биохимических состояниях, но ширина FWHM * распределения M * меньше в биохимических состояниях нуклеотидных аналогов.Параметры, полученные на основе этих наилучших совпадений, сведены в Таблицу 1.

Спираль реле становится более упорядоченной во время восстановительного инсульта.

Нуклеотидные аналоги АТФ и АДФ.P _i явно вызывают не только более высокие скорости распада, но и более выраженные колебания затухания спинового эха (особенно для 639: 498, рис. 2 Нижний , что указывает на более узкое распределение расстояний между зондами, по сравнению с состояниями, связанными с апо или АДФ (рис. 2, , справа, ).3, было невозможно удовлетворительно подогнать данные, предполагая, что ширина распределений не изменялась во время структурного перехода миозина (сравните фиг. 3 A и B ). Если ширине распределения M * позволялось варьироваться, качество общих подгонок было эквивалентно качеству подгонок без ограничений (сравните Рис. 3 A и C ). Мы обнаружили, что структурная гибкость (характеризуемая шириной распределения расстояний) в состоянии M * была меньше в состоянии M.Комплексы ADP.BeF _x и ADP.AlF ₄ по сравнению с комплексом M.ADP. Ширина распределения расстояний была еще меньше в структурном состоянии M ** (Рис. 2 Правый и Таблица 1).

Изгиб спирали реле, определяемый TR-FRET.

FRET определяет расстояние r между донорными и акцепторными зондами, связанное за счет безызлучательной передачи энергии. В результате этой передачи энергии скорость затухания флуоресценции донора увеличивается пропорционально r ⁻⁶ .В эксперименте TR-FRET донор возбуждается наносекундным лазерным импульсом, его флуоресценция детектируется с субнаносекундным разрешением, а время жизни флуоресценции τ используется для вычисления расстояния r . Основным преимуществом TR-FRET по сравнению с обычным FRET (где измеряется только интенсивность стационарной флуоресценции) является способность разрешать множественные конформации белка с различными межзондовыми расстояниями, что приводит к различным временам жизни (16). Сигналы флуоресценции только донора [5 — ({2 — [(иодацетил) амино] этил} амино) нафталин-1-сульфоновая кислота (IAEDANS)] (рис.S2) и донорно-акцепторные [IAEDANS-4 — ((4- (диметиламино) фенил) азо) бензойная кислота (DABCYL)] — меченые мутанты миозина были приобретены в различных биохимических состояниях: апо, M.ADP, M.ADP.BeF _x (M.ATP) и M.ADP.AlF ₄ (M.ADP.P) (рис.4 слева ). В отличие от DEER, TR-FRET был нечувствителен к связыванию ADP (рис. 4), вероятно, из-за более низкого разрешения по расстоянию FRET, а также большего размера и большей гибкости прикрепленных оптических зондов. Однако связывание ADP.BeF _x и ADP.AlF ₄ на миозин существенно уменьшал время жизни донора, указывая на увеличение эффективности FRET и сокращение среднего расстояния между зондами (рис. 4), как наблюдалось с помощью DEER (рис. 2). Сигналы донорной флуоресценции для всех четырех биохимических состояний были согласованы глобально (при условии наличия тех же двух структурных состояний: M * и M **) в соответствии с уравнениями. 2 — 6 (рис.4). На основании сравнения невязок и значений χ ² для одно- и двухгауссовой аппроксимации (рис.S3) мы пришли к выводу, что одно структурное состояние заселяется в биохимических состояниях апо и M.ADP, а два структурных состояния заселяются связанными ADP.BeF _x и ADP.AlF ₄ . Мольные доли популяций миозина, межзондовые расстояния и распределения расстояний, извлеченные из подгонок, показаны на рис. 4 и в таблице 2.

Изгиб спирали реле разрешен TR-FRET. ( Left ) Флуоресцентные сигналы донорно-акцепторных мутантов миозина в указанных биохимических состояниях.( Right ) Распределения расстояний, полученные путем подбора сигналов флуоресценции. Параметры распределений приведены в таблице 2.

Распределение расстояний, R (FWHM) и мольные доли, наблюдаемые в каждом биохимическом состоянии, обнаруженные TR-FRET (рис. 4)

Обсуждение

Целью данного исследования было определение структуры релейной спирали при динамическом миозин-нуклеотидном взаимодействии в растворе. Релейная спираль, важный элемент области миозина, генерирующей силу, соединяет сайт связывания нуклеотидов и конвертерный домен.Кристаллические структуры миозина демонстрируют две различные конформации релейной спирали, зависящие от связанного аналога нуклеотида. Широко предполагается, что переход между этими конформациями миозина, инициированный взаимодействием миозин-АТФ, является инсультом восстановления. В этом исследовании мы задаем следующие вопросы: сколько структурных состояний принимает релейная спираль в растворе? Есть ли прямая корреляция между состоянием нуклеотид-связывающего кармана и состоянием релейной спирали? Насколько жестка спираль реле? Что инициирует инсульт восстановления миозина, связывание АТФ или гидролиз АТФ? Мы использовали два дополнительных метода спектроскопического зонда, DEER и FRET, оба из которых используют импульсное возбуждение и детектирование с временным разрешением для получения структурного разрешения.Для обоих методов были использованы две пары сайтов мечения для триангуляции положений зонда в различных биохимических состояниях миозина и однозначного определения структурных состояний миозина.

Relay Helix принимает два структурных состояния в миозин-нуклеотидных комплексах.

Данные по DEER и TR-FRET очень хорошо согласуются (Таблица 3). Оба метода показывают наличие двух структурных состояний миозина (M * и M **) в одном биохимическом (миозин-нуклеотидный аналог) состоянии. Эти структурные состояния заселялись по-разному, в зависимости от связанного аналога нуклеотида (ADP.AlF ₄ , ADP.BeF _x ). Апо миозин проявлял одно отчетливое структурное состояние, М. Биохимическое состояние миозин-АДФ проявляло одно структурное состояние, М *. Расстояние между зондами в состоянии M * было всего на ≈0,15 нм короче, чем в состоянии M, что указывает на незначительное изменение структуры релейной спирали после связывания ADP. Только DEER четко определяет структурные изменения между состояниями M и M *, вероятно, из-за его превосходного разрешения по расстоянию и меньшего размера спиновой метки по сравнению с зондами FRET.Разница в межзондовых расстояниях между структурными состояниями M * и M ** гораздо более выражена (≈0,5 нм), что отражает существенное изменение конформации релейной спирали. Мы пришли к выводу, что существует только два различных структурных состояния силогенерирующей области миозина в биохимических состояниях M.ATP и M.ADP.Pi, M * и M **. Это наблюдение разрешает споры, возникшие в результате наблюдения двух разных кристаллических структур одного и того же миозина в комплексе с одним и тем же аналогом нуклеотида (ADP.BeF _x ) (1, 2). Наши результаты показывают, что оба структурных состояния заняты в растворе, поэтому структура, захваченная кристаллизацией, вероятно, зависит от конкретных экспериментальных условий, используемых для приготовления белка и роста кристаллов.

Межзондовые расстояния (нм) в состояниях миозина до восстановления (M *) и после восстановления после инсульта (M **), определяемые различными методами

Генерирующая силу область миозина более упорядочена в структурном состоянии после восстановления.

Анализ распределения межзондовых расстояний в структурных состояниях M * и M ** показывает меньшую ширину в состоянии M ** удара после восстановления, что указывает на больший порядок в генерирующей силу области миозина. В соответствии с этими экспериментальными результатами, моделирование молекулярной динамики миозина (MD) показало уменьшение колебаний основной цепи в релейной спирали при переходе от M * к M ** (рис. 5). Напротив, MD не продемонстрировал значительного влияния этого перехода на колебания остова на других сайтах в нижнем 50К-домене, включая сайты мечения D515 и A639.N-концевая часть релейной спирали является продолжением петли переключателя II, важного структурного элемента нуклеотид-связывающего сайта миозина; переключатель II разомкнут в M * и замкнут в M **. Экспериментально наблюдаемое более узкое распределение расстояний в структурном состоянии M ** (рис. 2 и таблица 1), подтвержденное уменьшением среднеквадратичных колебаний основной цепи в моделировании MD, отражает закрытие переключателя II и более сильное связывание нуклеотидов.

Моделируемые колебания позвоночника в структурных состояниях до восстановления (зеленый) и после восстановления (красный).Существенные различия видны только в релейной спирали (остатки 465–499).

Связывание АТФ инициирует ход восстановления.

Наши результаты показывают, что ретрансляционная спираль реагирует на изменения состояния нуклеотидного связывающего кармана и идентифицирует ретрансляционную спираль как междоменный линкер, который передает изменения от активного сайта к конвертирующему домену миозина. Поразительно, но мы обнаружили, что с аналогом АТФ (ADP.BeF _x ), связанным с активным сайтом, спираль реле миозина может принимать структурные состояния как до восстановления, так и после восстановления.В отличие от классической модели функции миозина, в которой гидролиз АТФ связан с инсультом восстановления и служит его движущей силой, наши наблюдения показывают, что связывание АТФ играет решающую роль в инсульте восстановления. Ход восстановления предшествует гидролизу и происходит при связывании АТФ в активном центре. Следовательно, гидролиз необходим не для подпитки цикла восстановления, а для облегчения выпуска продукта и продолжения цикла. Эта гипотеза была ранее предложена на основе МД-моделирования (17, 18) и кристаллических структур, которые предполагали, что переключатель II в нуклеотидном кармане должен быть закрыт, чтобы миозин находился в каталитически активной форме (5, 19).Эксперименты по релаксации с одиночными мутантами Trp и аналогами нуклеотидов (20) показали изменения собственной флуоресценции миозина после быстрого скачка температуры или давления. Это было связано с наличием равновесия между открытой (до восстановления) и закрытой (после восстановления) конформациями и использовалось для расчета констант равновесия между состояниями. Наши измерения расстояния обеспечивают необходимые размерные детали для разрешения двух сосуществующих структурных состояний и непосредственного определения положения релейной спирали в каждом из состояний.

DEER и TR-FRET дополняют друг друга.

Хотя оба метода используют импульсное возбуждение и детектирование с временным разрешением и одни и те же участки мечения, каждый из них имеет определенные преимущества. По сравнению с относительно простым экспоненциальным затуханием донорной флуоресценции в экспериментах FRET, сложная форма сигналов модулированной интенсивности эха в DEER имеет более отчетливые спектральные особенности, которые можно использовать для оценки качества подбора, обеспечивая более высокое структурное разрешение. Еще одно преимущество DEER заключается в маркировке: меньший размер зонда и возможность использовать один и тот же зонд в обоих местах (по сравнению с парами донор-акцептор в FRET) упрощают подготовку образца и приводят к более надежной интерпретации данных.В частности, только DEER обнаружил незначительные (≈0,1 нм) изменения в структуре при связывании ADP, показал значительное уменьшение ширины распределения в состояниях M.ADP.BeF _x и M.ADP.AlF ₄ , и однозначно разрешили два структурных состояния в комплексах миозин-нуклеотидный аналог. Однако эксперименты TR-FRET могут проводиться при физиологических температурах и иметь на несколько порядков более высокую чувствительность, давая информацию о распределении расстояний в одном 50-нсекундном сигнале, обнаруженном с субнаносекундным разрешением.Таким образом, FRET может обеспечить это структурное разрешение в реальном времени во время биохимического переходного процесса. Кроме того, измерения FRET можно использовать для установления верхнего предела скорости перехода между разрешенными конформациями, которая приблизительно обратно пропорциональна среднему наблюдаемому времени жизни флуоресценции. Например, две конформации, разрешенные в таблице 2, должны обмениваться медленнее, чем ≈10 ⁸ с ^-1 .

Выводы

Мы разработали конструкции миозина для измерения индуцированной нуклеотидами динамики спирали реле миозина, важного структурного элемента в области генерирования силы, соединяющей сайт связывания нуклеотида и плечо рычага.Комбинируя мутагенез белков, сайт-направленное мечение, импульсную ЭПР-спектроскопию с высоким разрешением (DEER) и высокочувствительную флуоресцентную спектроскопию (TR-FRET), мы (–) обнаружили структурные изменения (изгиб и упорядочение) в спирали реле миозина в ответ на связывание аналога нуклеотида, ( ii ) разрешил два структурных состояния (прямое и изогнутое) релейной спирали в единственном биохимическом состоянии миозина со связанным аналогом нуклеотида, и ( iii ) обнаружил изменения порядка и межзондовых расстояний во время взаимодействие миозина с АТФ.Мы заключаем, что ( i ) изгиб (структурное состояние) релейной спирали только слабо связан с идентичностью связанного нуклеотида (биохимическое состояние), и ( ii ) изогнутое состояние релейной спирали частично заселено. сразу после связывания АТФ с миозином, не требуя гидролиза АТФ. Более широкое распределение межзондовых расстояний в состояниях предвосстановительного удара указывает на гибкость N-концевой части релейной спирали, когда петля switch II в сайте связывания нуклеотидов открыта.Эти результаты предоставляют прямую информацию о структурной динамике релейной спирали в миозине в растворе, обеспечивая понимание взаимодействия между активным сайтом миозина и областью, генерирующей силу.

Материалы и методы

Подготовка и маркировка белков.

Мутанты миозина D. discoideum были сконструированы и очищены, как описано (21). Для DEER белок был помечен спиновой меткой 4-малеимидо-2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси (MSL) путем инкубации 100 мкМ миозина с 600 мкМ MSL в течение 12 ч на льду, в результате чего мечение> 90% Cys, как измерено масс-спектрометрией и спектральной интенсивностью.Для FRET белок был помечен в два этапа. Сначала 50 мкМ миозина инкубировали с 45 мкМ донора (IAEDANS) в течение 12 часов. Затем этот белок разбавляли до 25 мкМ и инкубировали со 100 мкМ акцептором (DABCYL). После каждого этапа мечения непрореагировавшая метка удалялась с помощью спин-колонок для исключения размера (Pierce). Степень маркировки FRET, определяемая по поглощению красителя, обычно составляла 30-40% донора и 60-70% акцептора, причем метились практически все цистеины. Буфер для маркировки содержал 20 мМ Mops, 50 мМ KCl, 3 мМ MgCl ₂ и 1 мМ EDTA, pH 7.5. Комплексы миозина с аналогами нуклеотидов получали, как описано (12). Если не указано иное, все эксперименты проводили при 20 ° C в буфере, содержащем 20 мМ N — (2-гидроксиэтил) пиперазин- N ‘ -3-пропансульфоновую кислоту (EPPS), 6 мМ MgCl ₂ и 1 мМ EGTA, pH 8,0.

Анализ АТФазы.

измеряли в физиологическом буфере (Т = 25 ° C в 10 мМ Трис, 3 мМ MgCl ₂ и 5 мМ АТФ, pH 7,5) в присутствии и в отсутствие актина по высвобождению неорганического фосфата ( 22).Зависимость активности миозин-АТФазы от концентрации актина была аппроксимирована уравнением Михаэлиса-Ментен для определения V _max (активность насыщающего актина) и K _m (концентрация актина при V = 0,5 V). _max ) (подробности в таблице S1).

Распределение межзондовых расстояний.

Чтобы отразить гибкость в структуре белка, сигналы DEER и FRET моделировались с использованием набора распределений расстояний, а не набора дискретных расстояний.Предполагалось, что форма каждого распределения является гауссовой: где σ — стандартное отклонение, а FWHM — полная ширина на половине высоты.

ОЛЕНЬ.

Сигналы DEER с временным разрешением были получены с помощью спектрометра Elexsys E580 (Bruker Biospin), оснащенного диэлектрическим резонатором (MD-5; Bruker Biospin), с использованием четырехимпульсной последовательности DEER (23) с π / два импульса длительностью 16 нс. и импульс ELDOR длительностью 40–48 нс. Частота накачки была сосредоточена на центральном резонансе спиновой метки нитроксида, а наблюдаемая частота была установлена ​​на низкополевом резонансе на расстоянии 67 МГц.Температура во время сбора данных была установлена ​​на 65 ° К. Образцы миозина (50–75 мкМ) были мгновенно заморожены в жидком азоте перед помещением в спектрометр. Буфер содержал 20 мМ EPPS, 6 мМ MgCl ₂ , 1 мМ EGTA и 10% глицерина (pH 8,0). Сигналы спинового эха анализировали с помощью программного пакета DeerAnalysis (24), который подбирает моделированные сигналы DEER к данным, предполагая одно или два гауссовых распределения межзондовых расстояний (уравнение -1 ).

TR-FRET.

Флуоресценция AEDANS-миозина возбуждалась с помощью третьей гармоники микрочипового YAG-лазера с пассивной модуляцией добротности (NanoUV-355; JDS Uniphase), работающего с частотой следования импульсов 10 кГц и выбора с помощью длинного прохода 420 нм. стеклянный фильтр.Чтобы избежать эффектов анизотропии, флуоресценцию пропускали через поляризатор, ориентированный под магическим углом. Сигналы флуоресценции регистрировались после каждого лазерного выстрела с помощью модуля фотоумножителя Hamamatsu H5773-20 (время нарастания 0,78 нс) и регистрировались с помощью дигитайзера переходных процессов (Acqiris DC252) с разрешением дискретизации 0,125 нс. Функция отклика прибора (IRF) была получена с помощью рассеянного света при тех же настройках прибора, что и при измерении флуоресценции, за исключением того, что не было фильтра излучения и поляризация излучения была вертикальной.

Анализ данных TR-FRET.

Наблюдаемый сигнал флуоресценции только для донора F _Dobs ( t ) от меченого миозина был подогнан с помощью моделирования F _Dsim ( t ), состоящего из мультиэкспоненциального распада F _{D 90 ( t ), свернутый с IRF: где τ Di — времена жизни только донорной флуоресценции. Мы обнаружили, что две экспоненциальные составляющие ( n = 2 в уравнении. 2 ) было достаточно; т.е. добавление третьего компонента к подгонке не уменьшило остаток или χ ² . Для каждого биохимического состояния был проанализирован сигнал флуоресценции меченного донорно-акцепторным миозином перед сверткой, F DA ( t ), предполагая, что единственное изменение в F D ( t ) было повышенная скорость распада, вызванная переносом энергии k T = ∫ k Di [ρ ( r ) / R 0 i ] ⁻⁶ dr , где ρ ( r ) — распределение донорно-акцепторных расстояний (Ур. 1 ), k Di = 1 / τ Di и R 0 i — расстояние Фёрстера, определяемое (уравнение S1 , рис. S4). Наблюдаемый сигнал донорно-акцепторной флуоресценции до свертки, F D + A ( t ), был принят как сумма трех членов: где X * и X ** ( X * + X ** = 1) — мольные доли миозина в состоянии до восстановления (прямая релейная спираль) и после восстановления (изогнутая ретрансляционная спираль), а X D — мольная доля меченного только донором миозина ( X ^{D + X} DA = 1).}

Наблюдаемые сигналы флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора были согласованы глобально (одновременно) смоделированными выражениями в уравнениях. 3 и 6 . Интенсивности A _i , время жизни τ _i , расстояния R * и R **, ширина FWHM * и FWHM **, а также фракция X _D меченного только донором миозина. связаны и изменяются одновременно. X ** (доля структурного состояния M **) варьировалась независимо для каждого сигнала в глобальной подгонке.

Подробнее см. SI Text .

Благодарности

Благодарим Юнис Сонг и Октавиана Корнеа за техническую помощь. Использованный инструмент флуоресценции с временным разрешением был вдохновлен многочисленными содержательными обсуждениями с Грегори Д. Гиллиспи из Fluorescence Innovations, Inc. Эта работа была поддержана грантами AR32961 (для DDT) и AR53562 (для YEN) Национального института здравоохранения Медицинский фонд Миннесоты (в YEN). Моделирование MD было выполнено с использованием вычислительных ресурсов института суперкомпьютеров Университета Миннесоты.

Сноски

• ¹ Кому может быть адресована корреспонденция. Электронная почта: ddt {at} umn.edu или yn {at} ddt.biochem.umn.edu

• Вклад авторов: R.V.A., D.D.T. и Y.E.N. спланированное исследование; R.V.A., Y.V.T. и Y.E.N. проведенное исследование; I.V.N., S.E.B. и M.A.T. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; Р.В.А. и Ю. проанализированные данные; и R.V.A., D.D.T. и Y.E.N. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/cgi/content/full/07106/DCSupplemental.

Визуализация FRET in vivo выявила регулирующую роль RanGTP в прикреплении кинетохор и микротрубочек через киназу Aurora B

Abstract

При изменяющихся обстоятельствах, обеспечиваемых врожденной динамикой микротрубочек и противоположными напряжениями, возникающими из-за связанных с микротрубочками моторов, жизненно важно гарантировать стабильные прикрепления кинетохор к микротрубочкам для точной сегрегации.Однако полное понимание того, как это регулирование механически достигается, остается труднодостижимым. Используя нашу недавно разработанную покадровую визуализацию FRET живых клеток, мы обнаружили, что пост-метафазный RanGTP имеет решающее значение в поддержании стабильных прикреплений кинетохор и микротрубочек за счет регулирования киназы Aurora B через NES-несущий Mst1. Что еще более важно, наше исследование демонстрирует, что, обеспечивая стабильное выравнивание метафазных хромосом до сегрегации, RanGTP незаменим в управлении целостностью генома и верностью прогрессии клеточного цикла.Наши находки подтверждают дополнительную роль RanGTP помимо его известной функции в сборке митотического веретена во время перехода прометафаза-метафаза.

Образец цитирования: Lee Y-P, Wong C-H, Chan K-S, Lai S-K, Koh C-G, Li H-Y (2012) In Vivo FRET-визуализация выявила регулирующую роль RanGTP в прикреплении кинетохор-микротрубочек через киназу Aurora B. PLoS ONE 7 (9): e45836. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045836

Редактор: Даниэла Чимини, Технологический институт Вирджинии, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 27.03.2012; Одобрена: 24 августа 2012 г .; Опубликовано: 28 сентября 2012 г.

Авторские права: © Lee et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана Академическим исследовательским советом Министерства образования Сингапура (Фонд академических исследований AcRF Tier 1, RG37 / 08) и A * STAR, Советом по биомедицинским исследованиям (грант BMRC 22.08.19 / 568). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Introduction

Ключевой особенностью митоза является сохранение целостности генома от родительских до дочерних клеток. Это особенно важно в метафазе, когда митотические хромосомы выровнены вдоль метафазной пластинки и удерживаются на кинетохорах микротрубочками веретена, готовясь к сегрегации в дочерние клетки. Следовательно, стабильные концевые присоединения кинетохор к микротрубочкам необходимы для достижения амфителических прикреплений и для митотической прогрессии через контрольную точку сборки веретена (SAC) с равным разделением генетических материалов [1].Ранние исследования прикрепления кинетохор и микротрубочек были сосредоточены на консервативной сети KMN (KNL1-Mis12-Ndc80 / Hec1) в установлении начального контакта кинетохора-микротрубочка [2]. Нарушение функции Hec1, в частности, из-за микроинъекции антител или подавления siRNA, приводит к ошибочным присоединениям, нарушению выравнивания хромосом и последующей неправильной сегрегации хромосом [3], [4], [5]. Однако, с возрастающим интересом к сети кинетохор-микротрубочки, было обнаружено множество кинетохорных и центромерных белков, многие из которых функции еще предстоит полностью определить [6], [7].Поскольку компоненты кинетохор составляют непосредственный контакт между хромосомами и микротрубочками, точная регуляция образования и поддержания прикрепления кинетохор к микротрубочкам, таким образом, важна для сохранения точности и точности сегрегации хромосом.

Малая GTPase Ran регулирует несколько ключевых событий для поддержания точности митотической сегрегации хромосом и для правильной митотической прогрессии. Функциональные возможности Ran зависят от его нуклеотидного состояния, при этом GTP-связанная форма и GDP-связанная форма определяются активностью фактора обмена гуанина RCC1 и RanGAP1 / RanBP1 соответственно.Во время митоза существует высокий уровень RanGTP вокруг RCC1-ассоциированных хромосом и прогрессивно снижается к периферии клетки, генерируя градиент RanGTP [8], [9]. Этот градиент RanGTP определяет функции Ran в митозе. Было показано, что высокий уровень RanGTP окружает митотические хромосомы и изолирует импортин альфа / бета, что приводит к высвобождению NLS (сигнал ядерной локализации) -содержащих факторов сборки веретена из импортина для выполнения их функций во время перехода прометафаза-метафаза [10 ], [11], [12].Однако мало что известно о том, как белки, несущие RanGTP, NES (ядерный экспортный сигнал), и экспортин Crm1 регулируют митотическую прогрессию. Мы сообщаем здесь, с применением нашего недавно разработанного in vivo FRET-визуализации, пост-метафазную функцию RanGTP в поддержании стабильных прикреплений кинетохор-микротрубочек после правильной хромосомной конгресса путем регулирования киназы Aurora B через NES-несущий Mst1.

Результаты

RanGTP важен для поддержания правильного выравнивания хромосом на метафазной пластине

Долгое время предполагаемое существование и функции градиента RanGTP во время митоза с тех пор были подтверждены вычислительными / математическими моделями, визуализацией биосенсоров и соответствующими исследованиями in vitro и in vivo [13], [14], [15] .Тем не менее, механистические пути, лежащие в основе регуляторных ролей RanGTP, остаются не полностью выясненными на протяжении митоза из-за ограничений различных используемых систем. Чтобы решить эту проблему, мы сначала решили создать систему, с помощью которой мы можем управлять митотическими уровнями RanGTP и контролировать их в реальном времени с помощью покадровой визуализации. Для этого исследования были выбраны чувствительные к температуре клетки tsBN2. Из-за мутации в гене RCC1 инкубация клеток tsBN2 при недопустимой температуре (39,5 ° C) приводит к истощению белка RCC1 и RanGTP впоследствии [16].Для измерения уровня RanGTP мы использовали биосенсор Rango FRET [8]. Насколько нам известно, данных, отражающих истощение уровня RanGTP в реальном времени, не поступало.

Была выполнена покадровая визуализация с использованием клеток tsBN2, котрансфицированных либо Rango и h3B-mCherry (рис. 1B), либо Rango и тубулином-mCherry (рис. 1C). Поскольку RanGTP был наиболее очевиден и максимально накапливался вокруг метафазных хромосом, трансфицированные клетки tsBN2 были арестованы в метафазе с использованием MG132 в течение 2 часов до инкубации в разрешающей (33.5 ° C) или недопустимая температура (рис. 1A). Соответственно, соотношение FRET для обоих контролей (рис. 1B и 1C, изображения с цветовой кодировкой) оставалось равномерно высоким вокруг метафазных хромосом, тогда как снижение было измерено в клетках, инкубированных при недопустимой температуре, по мере того, как прогрессировал промежуток времени (рис. 1Б и 1С, цветное кодирование изображений). Отношения FRET для клеток, инкубированных как при разрешающей, так и при недопустимой температуре во время покадровых экспериментов, были нанесены на график, как показано на рис. 1D. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что уровнем RanGTP можно манипулировать и контролировать с помощью нашего недавно разработанного метода визуализации in vivo FRET.

Рис. 1. RanGTP истощается при недопустимой температуре и влияет на поддержание выравнивания хромосом в клетках tsBN2.

A) Схематическое изображение условий эксперимента. Клетки задерживали в метафазе с использованием MG132 в течение 2 часов перед инкубацией при разрешающей (33,5 ° C) или недопустимой температуре. Б) клетки tsBN2, экспрессирующие Rango и h3B-mCherry. В) клетки tsBN2, экспрессирующие Rango и тубулин-mCherry. Контрольные эксперименты при 33,5 ° C и эксперименты по изменению температуры при 39.5 ° С. Цветная полоса отображает интенсивность FRET. Шкала шкалы: 10 мкм. D) Линейная диаграмма представляет соотношение Rango FRET (в соответствии с методом Ювана) в различные интервалы времени для контроля, 33,5 ° C (круглые маркеры) и ячейки со сдвигом температуры, 39,5 ° C (квадратные маркеры). Планки погрешностей представляют собой ± стандартное отклонение (s.d.). E) Вестерн-блот-анализ Rango и Ran из митотических клеток tsBN2, инкубированных при разрешающей или недопустимой температуре в различные моменты времени. Актин использовался в качестве контроля нагрузки.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0045836.g001

Интересно, что мы обнаружили, что выровненные по метафазе хромосомы постепенно удалялись от метафазной пластины для клеток tsBN2, инкубированных при недопустимой температуре (рис. 1B). Напротив, контрольные клетки (допустимая температура) обнаруживают нормальное выравнивание метафазных хромосом, когда уровни RanGTP не были нарушены (Fig. 1B). Это было неожиданно, учитывая, что клетки уже достигли стабильного прикрепления кинетохор к микротрубочкам для правильного выравнивания хромосом в метафазной пластине до инкубации при недопустимой температуре.При более тщательном рассмотрении мы исключили возможность того, что изменение температуры может поставить под угрозу целостность митотического веретена как причину этого фенотипа, потому что метафазное веретено остается интактным после повышения температуры (Fig. 1C).

Чтобы убедиться, что изменения в соотношении FRET, наблюдаемые в клетках, инкубированных при недопустимой температуре в течение промежутка времени, не связаны с деградацией зонда Rango или изменениями уровней Ran при повышении температуры, мы исследовали эти белки.Уровни Rango и Ran оставались постоянными как для контрольных лизатов митотических клеток, так и для лизатов с температурным сдвигом. Это показало, что зонд Rango оставался нетронутым после повышения температуры, и любое снижение соотношения FRET объясняется снижением уровня RanGTP.

Далее мы стремились выяснить вклад уменьшенного RanGTP как инициатора наблюдаемого фенотипа смещения хромосом. Хотя Rango широко используется для целей визуализации RanGTP, переизбыток домена связывания importin-β (IBB) потенциально генерирует эффект «importin-β stock», тем самым влияя на последующие регуляции и функции.Следовательно, необходимо исключить возможность того, что наблюдаемый фенотип обусловлен сверхэкспрессией Rango.

Таким образом, эксперименты по визуализации живых клеток были проведены на клетках tsBN2 без трансфекции Rango. Наши результаты показали, что метафазные клетки, инкубированные при непермиссивной температуре, демонстрировали сходное смещение хромосом, как показано на изображениях h3B-GFP хромосом, смещенных из метафазной пластинки (рис. 2А). По мере того, как прогрессировал промежуток времени, больше хромосом ускользало из метафазной пластинки.Важно отметить, что хотя наблюдалось грубое рассогласование хромосом, веретено метафазы оставалось неповрежденным и не нарушалось повышением температуры (Рис. 2A, нижняя панель). Контрольные клетки, инкубированные при разрешающей температуре, продолжали отображать правильно выровненные хромосомы на метафазной пластине до конца промежутка времени (рис. 2А, верхняя панель). Как и предполагалось, инкубация клеток при недопустимой температуре показала серьезное снижение уровней ПКР1, как видно из анализа иммуноблоттинга ПКР1 на рис.2Б. Количественная оценка доли метафазных клеток с покадровой визуализацией во время начала, показывающих смещенный фенотип хромосом, указывает на то, что деградация RCC1 и последующее истощение RanGTP предшествуют возникновению смещенных хромосом (рис. 2C). Важно отметить, что контрольные эксперименты, проведенные на родительской клеточной линии BHK21 (с эндогенным геном RCC1 дикого типа) при недопустимой температуре, также показали, что повышение температуры не влияет на целостность митотического веретена или выравнивание хромосом в метафазе (рис.S1). Следовательно, приписывание наблюдаемого фенотипа смещения хромосом в клетках tsBN2 при недопустимой температуре исключительно с потерей RCC1 и истощением RanGTP.

Рис. 2. Деградация RCC1 ответственна за фенотип смещения хромосом при недопустимой температуре.

A) Покадровая визуализация метафазных клеток tsBN2, экспрессирующих h3B-GFP и тубулин-mCherry. Контрольный эксперимент при разрешении и эксперимент со сдвигом температуры при недопустимой температуре. Стрелки показывают аберрантно выровненные метафазные хромосомы.B) Вестерн-блот-анализ RCC1 для митотических клеток tsBN2, инкубированных при разрешающей или недопустимой температуре и собранных путем механического встряхивания в различные моменты времени. Относительная интенсивность RCC1 показана под каждой полосой. Актин использовался в качестве контроля нагрузки. C) Таблица показывает количественную оценку доли клеток с покадровой визуализацией во время появления смещенных хромосом. D) Покадровая визуализация митотических клеток tsBN2, экспрессирующих RCC1-GFP дикого типа и тубулин-mCherry. Экспрессия RCC1-GFP дикого типа в метафазных клетках tsBN2, инкубированных при недопустимой температуре, аннулировала фенотип несовпадения.Шкала шкалы: 10 мкм. E) Гистограмма показывает процент клеток tsBN2 в метафазе с покадровой визуализацией с смещенными хромосомами. Планки погрешностей показывают ± стандартное отклонение. из трех независимых экспериментов. (T-критерий Стьюдента).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045836.g002

Дальнейший иммуноблоттинг-анализ был проведен на лизатах митотических клеток, собранных в различные моменты времени после инкубации при разрешающей или недопустимой температуре и зондированных антителами, как показано на рис. .S2A. Уровни белков секурина, SMC1 и cdc2 (Thr161) не показали какого-либо снижения, а распространение хромосом показало интактные сестринские хроматиды, что указывает на то, что сестринские хроматиды прикреплены и что клетки были задержаны в метафазе с комплексом, способствующим анафазе (APC). ингибируется (рис. S2A – D). Что наиболее важно, регуляторы Ran, уровни RanGAP1, SUMO-модифицированные уровни RanGAP1 и RanBP1, не показали каких-либо значительных различий как в контрольных лизатах, так и в лизатах с температурным сдвигом (рис. S2A) или в данных иммунофлуоресценции (рис.S2E, F). Таким образом, мы пришли к выводу, что наблюдаемое изменение, вероятно, связано с потерей RCC1.

Чтобы дополнительно подтвердить, что наблюдаемый фенотип является результатом истощения RanGTP во время метафазы, мы дополнили клетки tsBN2 функциональными белками RCC1 дикого типа (WT), чтобы предотвратить аберрантное выравнивание хромосом, даже когда клетки инкубируют при недопустимой температуре. Мы показываем, что 1,5-кратный уровень белка эктопического WT RCC1 по сравнению с эндогенным температурно-чувствительным RCC1 (данные не показаны) необходим и достаточен для восстановления фенотипа смещения при недопустимой температуре (рис.2D – E). Итак, наши наблюдения показывают, что истощение RanGTP вызывает неожиданное смещение хромосом от метафазной пластинки без нарушения структуры веретена в метафазе, указывая тем самым, что RanGTP необходим для поддержания правильного выравнивания хромосом во время метафазы.

Локальное обогащение хромосомным RanGTP регулирует стабильность прикрепления кинетохор к микротрубочкам и предотвращает реактивацию узла веретена. Контрольная точка

Аберрантное смещение хромосом из метафазной пластинки, как показано на Рис. 1 и 2, может быть связано с неправильным прикреплением кинетохор к микротрубочкам или потерей прикрепления к микротрубочкам веретена [17], [18].Чтобы уменьшить эту вероятность, мы окрашивали метафазные клетки, инкубированные при разрешающей или недопустимой температуре, с антицентромерными антигенами (АСА) и антителами к тубулину. Контрольные клетки показали локализацию ACA на хромосомах, выровненных на метафазной пластинке и прикрепленных к микротрубочкам веретена (рис. 3A). Для клеток, инкубируемых при недопустимой температуре, ACA также обнаруживается на смещенных хромосомах, что указывает на то, что эти хромосомы все еще имеют интактные центромеры. Увеличенные изображения показали правильное прикрепление ACA-микротрубочек в контрольных клетках (рис.3A, верхний ряд, вторая панель), тогда как такие крепления были нарушены в ячейках со смещенной температурой (фиг. 3A, нижний ряд, вторая панель).

Рис. 3. Митотический RanGTP необходим для правильного прикрепления кинетохор и микротрубочек во время метафазы.

A) Метафазные клетки tsBN2 иммуноокрашивали антицентромерными антигенами (АСА) и антителами к тубулину. На увеличенных изображениях показаны прикрепления микротрубочек к кинетохоре на конце (контроль, верхняя панель) и незакрепленные хромосомы (с температурным смещением, нижняя панель).B) Гистограмма показывает общую интенсивность холодоустойчивых микротрубочек (A.U.) после индуцированной холодом деполимеризации микротрубочек. Планки погрешностей показывают ± стандартное отклонение. (T-критерий Стьюдента). C) Типичные изображения обработанных холодом митотических веретен из митотических клеток tsBN2, инкубированных при разрешающей или недопустимой температуре. Иммуноокрашивание белка контрольной точки веретена BubRI с D) тубулином или E) антицентромерным ACA. Шкала шкалы: 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045836.g003

Стабильные прикрепления кинетохор и микротрубочек придают устойчивость к деполимеризации микротрубочек во время воздействия холода, тогда как несвязанные микротрубочки деполимеризуются во время низкотемпературной обработки [4], [19].Чтобы подтвердить наши предыдущие данные (рис. 3А), мы подвергли клетки обработке холодом для дальнейшего иммуноцитохимического анализа. Количественно определенная относительная интенсивность сигналов микротрубочек показала, что доля устойчивых к холоду микротрубочек была значительно снижена в клетках, инкубированных при недопустимой температуре, по сравнению с контрольными клетками (рис. 3B – C). В соответствии с этим, эта потеря устойчивых к холоду микротрубочек предотвращалась в метафазных клетках, экспрессирующих RCC1 дикого типа (Fig. 3B). Эти результаты показали, что неправильно выровненные хромосомы утратили правильные концевые присоединения кинетохор к микротрубочкам после того, как митотический RanGTP истощается во время метафазы.

Отдельно стоит отметить, что мы исследовали локализацию нескольких моторных или кинетохорных белков, которые могут участвовать в поддержании или перемещении хромосом во время митоза. Результаты иммуноокрашивания показали, что локализация TPX2, Hec1, RanGAP1 и dynactin-p150 не изменилась в метафазных клетках, инкубированных при пермиссивной или непермиссивной температуре, что указывает на то, что эти белки не участвуют в проявлении этого фенотипа (рис. S3).

Поскольку SAC остается активным до тех пор, пока все требования по занятости кинетохор и натяжению кинетохор-веретена не будут удовлетворены, мы рассудили, что любые несвязанные кинетохоры будут демонстрировать постоянную локализацию комплекса checkpoint [20], [21].В соответствии с этим контрольные метафазные клетки, иммуноокрашенные анти-BubR1, показали небольшое количество BubR1 или его отсутствие на кинетохорах. Напротив, клетки с температурным смещением обнаруживают отчетливое присутствие BubR1 как на кинетохорах хромосом, смещенных из метафазной пластинки, так и в меньшей степени на тех, которые остаются на экваторе (Fig. 3D). Совместное иммуноокрашивание с ACA подтвердило, что повторная сборка аппарата контрольных точек веретена происходит в непосредственной близости от центромерных областей хромосомы (рис.3E). Мы пришли к выводу, что митотический RanGTP важен для поддержания стабильных прикреплений кинетохор и микротрубочек и, следовательно, ограничения любой несвоевременной реактивации SAC.

RanGTP-зависимые взаимодействия с Crm1-киназой Mst1-Aurora B поддерживают стабильные прикрепления кинетохор к микротрубочкам метафазы

В разрезе молекулярного пути, в котором RanGTP регулирует стабильные прикрепления кинетохор и микротрубочек, мы исследовали его с точки зрения его роли в регуляции транспорта.Таким образом, мы изучили образование тройного грузового комплекса, несущего RanGTP-Crm1-NES. В нормальных физиологических условиях Crm1 локализуется на кинетохорах метафазных клеток (Fig. S4A-B). Однако, когда клетки tsBN2 инкубировали при недопустимой температуре, Crm1 значительно снижался на кинетохорах. Из различных протестированных белков-кандидатов, несущих NES, мы обнаружили, что Mst1 имитирует локализацию Crm1 в отсутствие и в присутствии митотического RanGTP. Mst1 совместно локализуется с Crm1 на веретене и на кинетохорах.Когда температура повышается до недопустимой, отсутствие Crm1 на кинетохорах ведет к потере Mst1 на этом сайте (Fig. 4B). Чтобы определить, есть ли разница в физическом взаимодействии между Crm1 и Mst1 после повышения температуры, мы провели анализ коиммунопреципитации с использованием антитела против Mst1. Вестерн-блоттинг показал, что, хотя уровни белков Crm1 и Mst1 оставались одинаковыми на входных дорожках, в образцах с температурным смещением было значительно меньше коиммунопреципитированного белка Crm1 (рис.4D – E). Эти результаты показывают, что истощение RanGTP ведет к делокализации Crm1 и последующей неспособности рекрутировать Mst1 на кинетохоры.

Рисунок 4. Ось киназы Crm1-Mst1-Aurora B диктует поддержание стабильных прикреплений кинетохора-микротрубочка.

A) Митотические клетки tsBN2 иммуноокрашивали анти-Crm1 и анти-Mst1 после инкубации при разрешающей или недопустимой температуре. B) Увеличенные изображения областей в рамке, иллюстрирующие окрашивание анти-Crm1 и анти-Mst1 (увеличенное объединенное изображение не включает ДНК).C) Определенные количественные интенсивности Crm1 и Mst1 были нормализованы и представлены как относительное кратное изменение ± стандартное отклонение. (планка ошибок) трех независимых экспериментов. D) Анализ коиммунопреципитации проводили с использованием моноклональных антител против Mst1 на лизатах митотических клеток tsBN2, собранных через 4 часа после инкубации при разрешающей или недопустимой температуре. E) Количественные значения интенсивности Crm1 были нормализованы и представлены как относительное кратное изменение ± стандартное отклонение. (планка ошибок) трех независимых экспериментов. F) Покадровая визуализация метафазных клеток tsBN2, экспрессирующих h3B-GFP и Mst1 WT-mCherry, Mst1 K59R-mCherry или mCherry (положительный контроль).Сверхэкспрессия Mst1 WT устраняет фенотип несовпадения в клетках, инкубированных при недопустимой температуре. Стрелки указывали на смещенные хромосомы. Шкала шкалы: 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045836.g004

Для дальнейшей проверки вклада Mst1 по отношению к уровням RanGTP мы провели эксперименты по спасению путем сверхэкспрессии Mst1 WT или киназы Mst1 мертвого мутанта K59R в клетках tsBN2 и последующая инкубация митотических клеток при недопустимой температуре.Покадровые изображения показали, что клетки со сверхэкспрессией Mst1 WT-mCherry восстанавливали правильно выровненные метафазные хромосомы даже при недопустимой температуре (рис. 4F, верхняя панель). Однако трансфекция мутанта Mst1 K59R-mCherry с мертвой киназой демонстрировала смещение хромосом при отмене RanGTP (фиг. 4F, средняя панель). Следовательно, наши данные показали, что RanGTP-зависимое рекрутирование активного Mst1 необходимо для поддержания стабильных прикреплений кинетохор и микротрубочек.

Активный Mst1 взаимодействует с киназной активностью AURORA B и сокращает ее активность для сохранения стабильных прикреплений кинетохоры и микротрубочек

Затем мы приступили к идентификации нижестоящей мишени Mst1, которая может участвовать в представлении наблюдаемого фенотипа аберрантного выравнивания хромосом.Мы обнаружили, что эндогенная киназа Aurora B коиммунопреципитировалась с Mst1 при разрешающей температуре, но было значительно меньше коиммунопреципитации киназы Aurora B из образцов, инкубированных при недопустимой температуре (рис. 5A-B). Этот результат указывает на то, что киназа Aurora B может быть нижестоящим субстратом Mst1, на активность которого влияет потеря RanGTP. Для дальнейшего изучения участия киназы Mst1 и Aurora B вдоль предложенной нами оси карго, несущей RanGTP-Crm1-NES, были проведены дополнительные анализы коиммунопреципитации с использованием мутантов Mst1.Хотя раскрытие мутанта Mst1 K59R показало некоторое снижение связывания с киназой Aurora B, более важным наблюдением было то, что мутант Mst1 K59R ΔC (аминокислота 1-330, лишенный NES и киназной активности) слабо ассоциируется с киназой Aurora B по сравнению с как к Mst1 WT, так и к Mst1 K59R (рис. 5C – F). Кроме того, иммунофлуоресцентный анализ распространения метафазных хромосом показал, что интактный NES необходим для перемещения Mst1 в непосредственной близости от хромосомы, включая кинетохору, таким образом, облегчая его взаимодействие с киназой Aurora B.Вестерн-блоттинг показывает отчетливую сверхэкспрессию слитых белков Mst1-mCherry (фиг. S5B). В то время как слитый белок Mst1 WT-mCherry может быть обнаружен, Mst1-K59R ΔC-mCherry явно отсутствовал в метафазной хромосомной зоне (Fig. 5G-H). Эти результаты показывают, что присутствие NES на Mst1 является критическим и необходимым для рекрутирования на кинетохоры через ось RanGTP-Crm1.

Рис. 5. Устойчивое взаимодействие функционально активного Mst1 с киназой Aurora B для его ингибирующего действия.

A) Анализ коиммунопреципитации, проводимый с использованием антитела против Mst1 на лизатах митотических клеток tsBN2, собранных через 4 часа после инкубации при разрешающей или недопустимой температуре. B) Количественные значения интенсивности киназы Aurora B были нормализованы и представлены как относительное кратное изменение ± стандартное отклонение. (планка ошибок) трех независимых экспериментов. C) Анализ иммунопреципитации, проводимый с использованием моноклональных антител против FLAG на лизатах клеток HEK, обогащенных метафазами, котрансфицированных плазмидами, как указано. D) Количественные значения интенсивности киназы Aurora B нормализовали против иммунопреципитированной киназы Aurora B, котрансфицированной с FLAG-Mst1 WT (средняя полоса), и представляли в виде относительного кратного изменения ± s.d. (планка ошибок) трех независимых экспериментов. E) Анализ иммунопреципитации, проводимый с использованием моноклональных антител против FLAG на лизатах клеток HEK, обогащенных метафазами, котрансфицированных плазмидами, как указано. F) Количественные интенсивности киназы Aurora B нормализовали против иммунопреципитированной киназы Aurora B, котрансфицированной с FLAG-Mst1 WT (средняя полоса), и представляли как относительное кратное изменение ± стандартное отклонение. (планка ошибок) трех независимых экспериментов. Звездочка (*) указывает неспецифические полосы. G) Метафазное распространение клеток tsBN2, экспрессирующих Mst1 WT или K59R ΔC-mCherry, иммуноокрашивали киназой против Aurora B.Шкала шкалы: 2 мкм. Изображения были получены в режиме фиксированной экспозиции. H) Гистограмма показывает процент метафазных хромосом со слитым белком Mst1-mCherry. Планки погрешностей показывают ± стандартное отклонение. из трех независимых экспериментов. I) Вестерн-блоттинг обогащенных метафазой клеток HEK, котрансфицированных киназой Aurora B и FLAG-Mst1, как указано. Звездочка (**) указывает на эндогенный Mst1. Актин использовался в качестве контроля нагрузки. J) Количественные значения интенсивности киназы Aurora B (pThr232) нормализовали и представляли как относительное кратное изменение ± s.d. (планка ошибок) трех независимых экспериментов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045836.g005

Интересно, что при исследовании уровней активной киназы Aurora B мы обнаружили, что Mst1 дикого типа может отрицательно регулировать аутофосфорилирование киназы Aurora B. Уровни активной киназы Aurora B подавлялись в присутствии сверхэкспрессированного FLAG-Mst1 WT, но оставались высокими для образцов с контрольной плазмидой FLAG или трансфекцией мутантной плазмиды Mst1 K59R ΔC (рис.5I – J). Это предполагает, что Mst1 дикого типа негативно регулирует состояние фосфорилирования киназы Aurora B. Устойчивое взаимодействие между Mst1 и киназой Aurora B позволяет Mst1 оказывать ингибирующее действие на киназу Aurora B. Другими словами, NES-RanGTP-зависимая пространственная регуляция и функционально интактный Mst1 необходимы для связывания Mst1 с киназой Aurora B, чтобы регулировать состояния фосфорилирования киназы Aurora B. Что еще более важно, наши данные подтверждают связь между Mst1, активностью киназы Aurora B и смещением хромосом при истощении RanGTP.

Гиперактивированная активность киназы Aurora B в RanGTP-истощенных клетках приводит к неспособности поддерживать стабильные прикрепления кинетохор к микротрубочкам

Было показано, что активность и влияние киназы Aurora B на динамику прикрепления кинетохор к микротрубочкам зависит от состояния фосфорилирования киназы по треонину 232 [22], [23]. Поэтому мы исследовали уровень активной киназы Aurora B (pThr232) при разрешающей и недопустимой температуре. Иммунофлуоресцентное окрашивание на активную фосфо-Aurora B-киназу показало как качественное, так и количественное усиление интенсивности флуоресценции для клеток с температурным смещением (рис.6A – B и рис. S6A). Иммуноблоттинг-анализ активной киназы Aurora B из митотических клеток, инкубированных при разрешающей или недопустимой температуре, показал, что, хотя общее количество киназы Aurora B остается одинаковым, в митотических клетках, истощенных по RanGTP, наблюдался значительно более высокий уровень активной киназы Aurora B (рис. 6C – D). Чтобы убедиться, что активность киназы Aurora B повышена в клетках, инкубируемых при недопустимой температуре, был проведен анализ киназы in vitro на рекомбинантном гистоне h4 с коиммунопреципитированной киназой Aurora B из митотических клеток, инкубированных при разрешающей или непермиссивной температуре.Киназная активность киназы Aurora B была увеличена в образце с температурным смещением, что очевидно по увеличению фосфорилирования гистона h4 (pSer10) (рис. 6E – F).

Рисунок 6. Аберрантная активация киназы Aurora B при истощении RanGTP приводит к аберрантному выравниванию хромосом.

A) Митотические клетки tsBN2, инкубированные при разрешающей или недопустимой температуре, анализировали иммунофлуоресцентным окрашиванием с киназой против Aurora B и киназой против Aurora B (pThr232). Шкала шкалы: 10 мкм.B) Увеличенные изображения областей в рамке, иллюстрирующие окрашивание киназой Aurora B и киназой Aurora B (pThr232). Увеличенное объединенное изображение не включает ДНК. C) Вестерн-блоттинг митотических клеток tsBN2, инкубированных при разрешающей или недопустимой температуре и собранных путем механического встряхивания. Актин использовался в качестве контроля нагрузки. D) Количественные интенсивности киназы Aurora B (pThr232) были нормализованы и представлены как относительное кратное изменение ± стандартное отклонение. (планка ошибок) 3 независимых экспериментов. E) Анализ киназы Aurora B проводили с использованием белка киназы Aurora B, иммунопреципитированного из митотических клеток tsBN2, инкубированных при разрешающей или недопустимой температуре.Активность киназы определяли путем фосфорилирования известного субстрата киназы Aurora B, гистона h4. F) Количественные значения интенсивности гистона h4 (pSer10) нормализовали и представляли как относительное кратное изменение ± стандартное отклонение. (планка ошибок) 3 независимых экспериментов. G) Покадровая визуализация метафазных клеток tsBN2, экспрессирующих h3B-GFP и тубулин-mCherry. Контрольный эксперимент (верхняя панель), эксперимент по температурному сдвигу (средняя панель) и температурный сдвиг + ZM447439 (нижняя панель). Шкала шкалы: 10 мкм.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0045836.g006

Для дальнейшей проверки влияния активности киназы Aurora B на поддержание метафазного выравнивания хромосом мы использовали известный ингибитор киназы Aurora B (ZM447439), который был добавлен с MG132 для 2 часов до инкубации при допустимой или недопустимой температуре. Покадровые данные и данные иммунофлуоресценции (фиг. 6G и фиг. S6C) показали, что фенотип несовпадения был значительно подавлен, когда клетки обрабатывались ZM447439. Количественная оценка процента клеток с покадровой визуализацией подтвердила, что значительно снизился процент метафазных клеток с смещенными хромосомами при обработке ZM447439 (рис.S6B). Интересно, что мы заметили появление популяции метафазных клеток с более легкой степенью смещения хромосом. Для количественного анализа мы оцениваем большое рассогласование как большие видимые кластеры хромосом, грубо смещенные из метафазной пластинки, тогда как незначительное рассогласование описывает метафазные клетки с менее чем 3 крохотными «отстающими» хромосомными кластерами. Нормальное хромосомное выравнивание обозначается плотно упакованной агрегацией хромосом на экваторе клетки. Количественная оценка более 100 клеток для каждого экспериментального набора показала, что при обработке ZM447439 клеток с температурным сдвигом происходило значительное снижение доли клеток с большим смещением хромосом (рис.S6D). Кроме того, мы показываем, что стабильность микротрубочек веретена сохраняется, когда ZM447439 используется для ограничения активности киназы Aurora B при недопустимых температурах (Fig. S6E-F). Поскольку активная киназа Aurora B делает прикрепление кинетохор к микротрубочкам более лабильным, стабильность правильных концевых прикреплений сильно нарушается и, таким образом, приводит к серьезному смещению хромосом в отсутствие RanGTP.

Обсуждение

С использованием биосенсора Rango и FRET, основанного на методе коррекции-Ювана, мы разработали подход, который позволяет в реальном времени визуализировать изменения уровней RanGTP параллельно с фенотипическими изменениями в клетках tsBN2.С минимальным эффектом фотообесцвечивания наш новый метод позволяет непрерывный мониторинг ориентации хромосом (или теоретически любых интересующих экспериментальных объектов) относительно колебаний в распределении RanGTP на уровне отдельных клеток. Таким образом, этот метод не ограничивается наблюдением за процессами, происходящими в течение короткого промежутка времени. Можно проследить развитие клетки от интерфазы через отдельные фазы митоза и контролировать клеточные процессы, которые могут быть нарушены изменениями уровней RanGTP по мере того, как клетка продвигается по клеточному циклу.

Предыдущие исследования яичных экстрактов Xenopus и эмбрионов C. elegans показали, что нарушение уровней RanGTP может привести к аберрантному выравниванию хромосом. Однако эти исследования проводились в условиях, когда мутанты Ran использовались для нарушения распределения RanGTP, когда клетка входит в митоз или в прометафазу, до достижения метафазы, и наблюдения часто сопровождаются дефектными митотическими веретенами [10], [24], [ 25]. Насколько нам известно, ни одно исследование не сообщало о прямой корреляции между RanGTP и поддержанием прикрепления кинетохор к микротрубочкам в метафазе.В нашей экспериментальной установке клетки были арестованы в метафазе, и в метафазных хромосомах, которые уже достигли правильного прикрепления кинетохор и микротрубочек, должно происходить стабильное выравнивание хромосом в метафазной пластинке. Интересно, что наши результаты показывают, что после истощения RanGTP происходит прогрессивное смещение предварительно выровненных метафазных хромосом от экватора, и, таким образом, подтверждают беспрецедентную регуляторную роль RanGTP в модулировании прикрепления кинетохор к микротрубочкам в метафазе.Имея достаточные подтверждающие доказательства из параллельных экспериментов с использованием контрольных клеток tsBN2, инкубированных при разрешающей температуре, и родительской клеточной линии BHK21, мы можем продемонстрировать, что фенотип аберрантного выравнивания хромосом объясняется только потерей RCC1 и истощением RanGTP.

Хотя мы действительно отмечаем озабоченность по поводу использования лекарства (MG132) для остановки клеток в метафазе, это необходимо для захвата клеток в метафазе, чтобы гарантировать, что истощение RCC1 происходит во время самой метафазы.Специфическая остановка метафазы, таким образом, позволит нам изолировать наблюдаемое событие рассогласования хромосом и исключить любое влияние других RanGTP-зависимых митотических процессов до и после метафазы. Это особенно важно, так как деградация RCC1 и последующее истощение RanGTP занимает 2–3 часа (Fig. 2B). Кроме того, использование MG132 не влияет на динамику микротрубочек или истощение RCC1 при недопустимой температуре. Поэтому MG132 считается подходящим инструментом для остановки клеток tsBN2 в этом исследовании.Хотя о подобном фенотипе смещения / рассеяния хромосом сообщалось в недавно обнаруженном явлении, называемом «усталость сплоченности» после длительного ареста SAC [26], [27], мы можем исключить вероятность возникновения этого феномена в нашем наблюдаемом фенотипе, поскольку мы смогли наблюдать интактные сестринские хроматиды с близко спаренными кинетохорами из наших трехмерных проекционных изображений, а также из изображений с разбросом хромосом (Fig. S2B-D). Кроме того, мы смогли спасти фенотип рассогласования хромосом с гиперэкспрессией RCC1 дикого типа.Это дополнительно подтверждает участие митотического RanGTP в поддержании правильного выравнивания хромосом.

Хотя предыдущие исследования RanGTP установили его роль в формировании веретена [10], [28], [29], участие RanGTP в поддержании прикрепления кинетохор к микротрубочкам в метафазе еще предстоит установить. Наши результаты описывают новую роль RanGTP, которая ликвидирует молекулярный хронологический разрыв между хромосомной конгрегацией и хромосомной сегрегацией. Мы предполагаем, что истощение RanGTP во время метафазы ведет к неспособности Crm1 рекрутировать Mst1 на кинетохоры.Впоследствии неограниченное гиперфосфорилирование киназы Aurora B способствует дестабилизации прикрепления кинетохора-микротрубочка и стимуляции беспорядочной переориентации прикрепления кинетохора-микротрубочка (Рис. 7). В соответствии с этим, Crm1 значительно снижается на кинетохорах, когда митотический RanGTP истощается. Аберрантно выровненные хромосомы также были обнаружены, когда Leptomycin B использовали для ингибирования функции Crm1 (Fig. S4D-F) [30].

Рисунок 7. Модель, иллюстрирующая роль митотического RanGTP в поддержании стабильного хромосомного выравнивания во время метафазы.

В присутствии митотического RanGTP с высоким содержанием Crm1 локализуется в кинетохорах. Затем Mst1 рекрутируется как часть тройного комплекса RanGTP-Crm1-Mst1. Присутствие Mst1 ограничивает аутофосфорилирование киназы Aurora B и, таким образом, стабилизирует прикрепление кинетохор к микротрубочкам, что приводит к стабильному выравниванию хромосом в метафазной пластинке (A). Когда RanGTP истощается, Crm1 не может связываться и нацеливать Mst1 на кинетохоры. Впоследствии киназа Aurora B становится гиперактивируемой, что способствует переориентации кинетохор и микротрубочек.Потеря правильного амфителического прикрепления приводит к смещению метафазных хромосом от экватора (B).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045836.g007

Хотя Mst1 является установленным грузом Crm1 во время интерфазы, его локализация в митозе еще не сообщается. Наше открытие о новой локализации Mst1 в кинетохорах вдоль оси RanGTP-Crm1-Mst1 согласуется с зависимым от RanGTP-Crm1 рекрутированием белков NES для зарождения микротрубочек кинетохор и последующей сегрегации хромосом в анафазе [30], [31] .Кроме того, результаты совместной иммунопреципитации и иммунофлуоресценции показывают, что локализация и взаимодействие Mst1 с киназой Aurora B зависят от присутствия функционального NES на Mst1. Это согласуется с более ранними сообщениями, подчеркивающими важность NES-несущей регуляторной области на Mst1 для его локализации и для регуляции его субстратов, таких как FOXO1 и h3B [32].

На сегодняшний день установлено, что роль киназы Aurora B в кинетохоре как протагониста для исправления ошибочного прикрепления кинетохоры к микротрубочкам, а не как инициатора аберрантного прикрепления и ориентации хромосом [23], [33].Однако важно отметить, что, хотя предварительно установленный датчик натяжения и роль исправления ошибок необходимы во время процесса поиска и захвата для формирования и стабилизации прикрепления кинетохор и микротрубочек, вполне вероятно, что после формирования правильного метафазного хромосомного выравнивания, эта роль киназы Aurora B становится менее заметной, поскольку она смещается в сторону регуляции передачи сигналов SAC и начала анафазы [34], [35]. В контексте этого исследования правильное выравнивание хромосом уже сформировалось до истощения RanGTP и последующего появления хромосом, смещенных от экватора.Следовательно, вероятно, что на этом переходном этапе между хромосомной конгрегацией и сегрегацией неограниченное гиперфосфорилирование киназы Aurora B из-за потери RanGTP в метафазе непреднамеренно приводит к тому, что киназа Aurora B способствует беспорядочной переориентации кинетохора-микротрубочки, что приводит к наблюдаемой неправильной ориентации хромосом. . Поскольку фенотип рассогласования хромосом при недопустимой температуре можно исправить с помощью ZM447439 (ингибитор киназы Aurora B) и сверхэкспрессии Mst1, вероятно, что роль киназы Aurora B в кинетохоре отрицательно изменяется в отсутствие RanGTP.Неудивительно, что усиление активности киназы Aurora B было связано с геномной нестабильностью и онкогенными трансформациями в клетках человека. Учитывая роль киназы Aurora B в установлении правильного прикрепления кинетохор к микротрубочкам и обеспечении равного разделения генетического материала на дочерние клетки, точное регулирование активности киназы Aurora B имеет решающее значение для предотвращения образования анеуплоидных или эуплоидных клеток, которое приводит к раку [36], [37]. Следовательно, наше исследование здесь показало, что RanGTP является объединяющей системой позиционирования, которая связывает пространственную регуляцию взаимодействия Mst1-Aurora B киназы, чтобы контролировать активность киназы Aurora B, тем самым поддерживая целостность генома во время деления клетки.

В заключение, мы показали, что присутствие митотического RanGTP действительно критично для поддержания прикрепления кинетохор к микротрубочкам. Способствуя стабильному выравниванию хромосом и, таким образом, обеспечивая равное сегрегацию хромосом, эта регуляторная роль RanGTP управляет точным процессом разделения хромосом.

Материалы и методы

Культуры клеток и лекарственные препараты

tsBN2 [38] и клетки BHK21 выращивали в среде DMEM (Gibco, Invitrogen, США), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone) и 1% пенициллина / стрептомицина (Gibco), в увлажненной атмосфере с 5% углекислого газа при температуре 33 ° C. .5 ° C (допустимая температура). Используемая недопустимая температура составляла 39,5 ° C. Клетки НЕК культивировали в аналогичных условиях, но при 37 ° C. Для обработки MG132 20 мМ MG132 (Sigma, США) в исходной смеси диметилсульфоксида (ДМСО) разводили в среде до рабочей концентрации 10 мкМ. Клетки обрабатывали 10 мкМ MG132 перед инкубацией при 33,5 ° C или 39,5 ° C в экспериментах. Ингибитор киназы Aurora B, ZM447439 (Tocris Biosciences, США), растворяли в ДМСО до исходной концентрации 100 мМ и разбавляли в DMEM до рабочей концентрации 500 нМ.Лептомицин B (Sigma) растворяли в ДМСО до исходной концентрации 5 мкг / мл и разбавляли в DMEM до рабочей концентрации 5 нг / мл. Трансфекция ранго, гистона h3B (h3B) -mCherry, h3B-GFP, тубулина-mCherry, RCC1-GFP дикого типа (WT), киназы Aurora B-GFP, Mst1 WT-mCherry, Mst1 K59R-mCherry, FLAG, FLAG- Mst1 WT, FLAG Mst1 K59R и / или FLAG-Mst1 K59R ΔC проводили с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Для анализа деполимеризации, вызванной холодом, клетки на покровных стеклах инкубировали в ледяной среде DMEM при 4 ° C в течение 1 часа, затем проводили иммунофлуоресценцию, как описано ниже.

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Клетки, высеянные на покровные стекла диаметром 22 мм, фиксировали 100% ледяным метанолом при –20 ° C в течение 10 мин. После трехкратной промывки TBST клетки инкубировали с первичным антителом, разведенным в TBST (50 мМ Трис, pH 7,6, 150 мМ NaCl, 0,1% Твин-20) плюс 4% бычий сывороточный альбумин (BSA; Sigma, США) при комнатной температуре. (RT) в течение 1,5 часа. После промывок TBST клетки инкубировали с соответствующими вторичными антителами и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа в темноте.Клетки помещали на предметные стекла с использованием реагента ProLong Gold Antifade, содержащего DAPI (Invitrogen).

Для иммунофлуоресцентного анализа Crm1 клетки пермеабилизировали 40 мкг / мл дигитонина в транспортном буфере (20 мМ HEPES, 110 мМ ацетат калия, 5 мМ ацетат натрия, 2 мМ ацетат магния, 1 мМ EGTA, 2 мМ DTT) при 4 °. C в течение 6 мин и фиксировали 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 15 мин. После трехкратной промывки PBS клетки окрашивали антителами и помещали на предметные стекла, как описано выше.

Для окрашивания хромосомы Mst1-mCherry клетки инкубировали в гипотоническом буфере (0,075 M KCl) при 37 ° C в течение 30 минут перед центрифугированием на покровных стеклах при 900 об / мин в течение 4 минут в цитоцентрифуге (Cytospin 2, Thermo / Shandon). Клетки сначала пермеабилизировали 0,2% Triton X-100 в PBS при комнатной температуре в течение 3 минут, а затем фиксировали 2% параформальдегидом в PBS в течение 10 минут. После двух промывок PBS клетки инкубировали со специфическими первичными антителами, а затем с флуоресцентно меченными вторичными антителами и помещали на предметные стекла.

Изображения были получены и проанализированы с использованием инвертированного микроскопа Axiovert 200 M (Carl Zeiss, Германия) и программного обеспечения Axiovision 4.6.

Распространение хромосомы

Митотические клетки собирали механическим встряхиванием и инкубировали в гипотоническом буфере при 37 ° C в течение 20 мин. После гипотонического набухания клеток клетки осаждали центрифугированием при 2000 об / мин в течение 5 минут. После этого клетки промывали один раз, а затем фиксировали в течение ночи ледяным фиксирующим раствором (метанол: уксусная кислота при 3∶1) при 4 ° C.На следующий день набухшие фиксированные клетки наносили на предметные стекла, сушили и окрашивали реагентом ProLong gold Antifade, содержащим DAPI (Invitrogen). Изображения распределения хромосом были получены и проанализированы с использованием инвертированного микроскопа Axiovert 200 M (Carl Zeiss, Германия) и программного обеспечения Axiovision 4.6.

Покадровая съемка

Влияние повышения температуры до недопустимой температуры (39,5 ° C) на клетки tsBN2 или трансфицированные клетки tsBN2, экспрессирующие Rango, h3B-mCherry, h3B-GFP, тубулин-mCherry, Mst1 WT-mCherry и / или Mst1 K59R-mCherry. с последующей покадровой микроскопией.Клетки высевали на чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм или предметные стекла с 8-луночной камерой Ibidi и помещали на термостатируемый столик микроскопа Zeiss Axiovert 200 M. Температуру поддерживали на уровне 33,5 ° C или повышали до 39,5 ° C, а уровни CO ₂ поддерживали на уровне 5% с использованием контроллера CTI 3700 (Carl Zeiss). Фазовый контраст и флуоресцентные изображения записывали (камера AxioCam и программное обеспечение Axiovision 4.6) с использованием объектива 40 × каждые 10 минут. Для покадровой визуализации клеток BHK21 клетки трансфицировали тубулином-mCherry с последующей покадровой визуализацией с использованием 20-кратного объектива через каждые 10 минут.Для покадровой визуализации клеток tsBN2, обработанных лептомицином B, клетки окрашивали красителем Hoechst (Molecular Probes, США) и отображали с объективом 20 × каждые 5 минут.

FRET и анализ изображений

С использованием биосенсора Rango уровни RanGTP были определены методом флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET). Клетки поддерживали при 33,5 ° C или 39,5 ° C и 5% CO ₂ в терморегулируемой камере на микроскопе во время экспериментов FRET. Были записаны физиологические изображения FRET (камера AxioCam и Axiovision FRET 4.6) с использованием 40-кратного объектива, и FRET-анализ выполняли с использованием метода коррекции Axiovision FRET-Youvan. Метод коррекции-Ювана измеряет значение FRET для изображения и выполняет «коррекцию» значения FRET, вычитая любые перекрестные помехи от донора и акцептора. (Gv = интенсивность как значение серого, bg = интенсивность фона, Cf = коэффициент коррекции, FRET = изображение FRET, don = изображение донора, acc = изображение акцептора) [39].

Измерение интенсивности микротрубочек веретена (A.U.) и относительной интенсивности флуоресценции

Изображения были получены с одинаковым временем экспозиции с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 200 M (Carl Zeiss) и проанализированы с помощью Axiovision 4.6 программное обеспечение.

(CI = интенсивность ячеек, CA = площадь ячейки, SA = площадь веретена).

Относительная интенсивность флуоресценции киназы Aurora B = pAurora Intensity _средн. / общая интенсивность киназы Aurora B _средн.

(окрашивание, специфичное для центросом, было исключено из измерений).

Вестерн-блоттинг

Митотические клетки собирали механическим встряхиванием, промывали PBS и лизировали 2 × буфером для образцов (62,5 мМ Трис-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 25% глицерин, 5% 2-меркаптоэтанол, 0.01% бромфенолового синего), содержащий 10% полный коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА (Roche, Швейцария) и 0,1% коктейль ингибиторов фосфатазы 1 и 2 (Sigma, США). Митотический лизат кипятили 10 мин. Равные количества белка разделяли на SDS-полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Biorad Laboratories, США). Мембраны зондировали специфическими первичными антителами, разведенными в 10% обезжиренном молоке в TBST при 4 ° C в течение ночи. Мембраны трижды промывали TBST перед инкубацией с конъюгированными с пероксидазой хрена вторичными антителами против мышиного IgG, кроличьего IgG или козьего IgG (Invitrogen, США).После промывки TBST иммунореактивные белки детектировали с помощью реагента усиленной хемилюминесценции (Amersham Biosciences, США).

Коиммунопреципитация

Гранулы белка G-сефарозы (Zymed), указанные антитела и клеточные лизаты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Иммунопреципитаты трижды промывали PBS, а затем добавляли 2 × буфер для образцов, кипятили при 100 ° C для денатурирования белков и отделения их от гранул. Иммунопреципитированный белок анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.

Иммунопреципитация для анализа киназы

Через 24 часа после трансфекции киназой-GFP Aurora B клетки tsBN2 обрабатывали MG132 в течение 2 часов перед инкубацией при разрешающей или недопустимой температуре в течение 4 часов. Затем клетки промывали PBS и лизировали в буфере C (20 мМ HEPES, pH 7,5, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl ₂ и 0,5% заменитель Nonidet P-40), содержащем 10% полный коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА ( Roche, Швейцария) и 0,1% ингибитор 1 и 2 смеси фосфатаз (Sigma).Лизаты инкубировали с шариками протеина G-сефарозы (Zymed) и мышиным моноклональным антителом против киназы Aurora B (BD Pharmigen) при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Иммунопреципитаты трижды промывали буфером C и один раз буфером D (10 мМ HEPES, pH 7,5, 10 мМ KCl, 1 мМ DTT и 10 мМ MgCl ₂ ). Образцы ресуспендировали в 20 мкл смеси киназ (20 мМ HEPES, pH 7,5, 10 мМ KCl, 1 мМ DTT, 10 мМ MgCl ₂ и 100 мкМ АТФ). К каждой реакционной смеси добавляли 6 мкг гистона h4 (New England Biolabs) и реакционные смеси инкубировали при 30 ° C в течение 30 минут.Реакции останавливали инкубацией на льду, образцы элюировали 2 ± буфером для образцов и анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.

Антитела

В качестве первичных используемых антител были козьи поликлональные против актина (Santa Cruz Biotechnology), использованные в 1–3000, кроличьи поликлональные анти-RanGAP1, поликлональные козьи анти-Ran (Santa Cruz Biotechnology), моноклональные антитела против секурина мыши, поликлональные кроличьи антитела против GFP. (Abcam), мышиный моноклональный анти-Crm1 (BD Pharmingen), мышиный моноклональный анти-FLAG (Sigma), анти-фосфо-Aurora A (Thr288) / Aurora B (Thr232) / Aurora C (Thr198) и кроличий поликлональный анти-Mst1 антитело (Cell Signaling), используемое при 1-1000 для иммуноблоттинга, кроличьи поликлональные анти-RanGAP1, кроличьи поликлональные анти-TPX2, кроличьи поликлональные анти-Crm1 (Santa Cruz Biotechnology), моноклональные антитела против BubR1 мыши, моноклональные антитела мыши против Crm1, анти- Киназа Aurora B / AIM мышиная моноклональная, мышиная моноклональная антитела против Hec1, мышиная моноклональная антитела против динактина-p150 (BD Pharmingen), используемые при 1-500, антитела против центромерных антигенов человека (антитела Incorporated), используемые в 1-10, кролик против Mst1 поликлональные (Genetex, Incorporated), используемые в 1-500, анти-Phospho-Aurora A (Thr288) / Aurora B (Thr232 ) / Aurora C (Thr198) (Cell Signaling) и FITC-конъюгат клону α-тубулина DM1α (Sigma), используемые при 1-1000 для иммунофлуоресценции.Вторичные антитела, используемые для иммунофлуоресценции, представляли собой конъюгированные с родамином Red-X ослиные античеловеческие IgG (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.), используемые в 1-500, козий анти-кроличий IgG Alexa Fluor 594, козий антимышиный IgG Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594 козьих антимышиных IgG (Invitrogen) использовали в концентрации 1-1000.

Вспомогательная информация

Рисунок S1.

Выравнивание митотического веретена и метафазной хромосомы не нарушается в родительской клеточной линии BHK21 при недопустимой температуре. A) Покадровая визуализация метафазных клеток BHK21 (с эндогенным геном RCC1 дикого типа), трансфицированных тубулином-mCherry и окрашенных красителем Hoechst (для ДНК). B) Метафазные клетки BHK21, иммуноокрашенные тубулином, демонстрирующие интактное митотическое веретено как при разрешающей, так и при недопустимой температуре. Шкала шкалы: 10 мкм. C) Количественная гистограмма, иллюстрирующая пропорции метафазных клеток с интактным митотическим веретеном. (n = 30). Планки погрешностей показывают ± стандартное отклонение. из трех независимых экспериментов.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0045836.s001

(TIF)

Рисунок S2.

Регуляторы Ran и когезия сестринских хроматид не нарушаются разрушением RanGTP. A) Вестерн-блоттинг митотических клеток tsBN2, инкубированных при разрешающей или недопустимой температуре и собранных путем механического встряхивания в различные моменты времени. Актин использовался в качестве контроля нагрузки. Б) Изображения распространения хромосом митотических клеток tsBN2, инкубированных при разрешающей или недопустимой температуре. Увеличенное изображение метафазной хромосомы, отмеченное звездочками (*), показано на вставке, на которой изображена плотно конденсированная метафазная хромосома с интактными сестринскими хроматидами.Шкала шкалы: 10 мкм. C) Количественная гистограмма, иллюстрирующая пропорции метафазных хромосом с интактными сестринскими хроматидами. (n = 30). Планки погрешностей показывают ± стандартное отклонение. из трех независимых экспериментов. (T-критерий Стьюдента). D) Трехмерные проекционные изображения метафазных хромосом клеток tsBN2, инкубированных при недопустимой температуре. Неверно выровненные хромосомы обладают интактными сестринскими хроматидами с парным окрашиванием кинетохор (Hec1). E) Количественная гистограмма относительной интенсивности флуоресценции RanGAP1 (серый) и BubR1 (белый) для клеток tsBN2, инкубированных при разрешающей или недопустимой температуре.(n = 30, 3 независимых эксперимента). F) Репрезентативные изображения метафазных клеток tsBN2, инкубированных при разрешающей или недопустимой температуре и совместно иммуноокрашенных с BubR1 и RanGAP1. Шкала шкалы: 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045836.s002

(TIF)

Рисунок S3.

Локализация белка веретена TPX2, кинетохорных белков Hec1 и RanGAP1 и моторного динактина-p150 веретена не изменяется при разрушении RanGTP. Клетки иммуноокрашивали A) анти-TPX2 и тубулином B) анти-Hec1 и тубулином C) анти-RanGAP1 и тубулином D) анти-динактином-p150 и тубулином.Шкала шкалы: 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045836.s003

(TIF)

Рисунок S4.

Crm1 значительно снижается из кинетохор после разрушения RanGTP, а ингибирование Crm1 лептомицином B приводит к смещению хромосом. клеток tsBN2 иммуноокрашивали A) анти-Crm1 и анти-Hec1 B) анти-Crm1 и тубулином. Увеличенные изображения показаны справа. Шкала шкалы: 10 мкм. C) Схематическое изображение условий эксперимента.Клетки tsBN2 задерживали в метафазе с использованием MG132 в течение 2 часов перед обработкой лептомицином B и визуализировали для покадрового анализа или инкубировали еще 2 часа перед фиксацией для иммунофлуоресцентного анализа. D) Количественная гистограмма доли фиксированных метафазных клеток с смещенными хромосомами с обработкой лептомицином B или без нее при разрешающей температуре. (n = 30, 3 независимых эксперимента). E) Репрезентативные изображения метафазных клеток с смещенными хромосомами с лечением лептомицином B или без него.Шкала шкалы: 10 мкм. F) Покадровая визуализация метафазных клеток tsBN2, окрашенных красителем Hoechst (для ДНК) и обработанных лептомицином B при допустимой температуре. Стрелки указывают на неправильно выровненные хромосомы. Шкала шкалы: 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045836.s004

(TIF)

Рисунок S5.

Mst1 с преобладанием NES исключен из ядра. A) Интерфазные клетки, экспрессирующие Mst1 WT или K59R ΔC-mCherry, фиксировали и подвергали иммунофлуоресцентному анализу.Mst1 K59R ΔC мутант, лишенный NES, обнаруживает отчетливое накопление в ядре. Шкала шкалы: 10 мкм. B) Параллельный вестерн-блот-анализ Mst1 и mCherry (DsRed) из митотических клеток tsBN2, трансфицированных Mst1 WT-mCherry или Mst1 K59R ΔC-mCherry (рис. 5G), демонстрирующий многократное увеличение уровней Mst1 в клетках, трансфицированных Mst1-mCherry. C) Параллельный вестерн-блоттинг Mst1 и mCherry (DsRed) из митотических клеток tsBN2, трансфицированных контрольным mCherry, Mst1 WT-mCherry или Mst1 K59R-mCherry, как показано на рис.4F. Актин использовался в качестве контроля нагрузки. D) Гистограмма показывает процент метафазных клеток с покадровой визуализацией с смещенными хромосомами из фиг. 4F (n = 25, 3 независимых эксперимента). Планки погрешностей показывают ± стандартное отклонение. из трех независимых экспериментов. (T-критерий Стьюдента).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045836.s005

(TIF)

Рисунок S6.

ZM447439 сдерживает активность киназы Aurora B для поддержания стабильности прикрепления кинетохор к микротрубочкам. A) Гистограмма, отображающая количественную оценку интенсивности флуоресценции относительной киназы Aurora B (pThr232), нормированной по отношению к общей интенсивности флуоресценции киназы Aurora B как среднее ± стандартное отклонение. из трех независимых экспериментов для клеток, изображенных и представленных на фиг. 6A и 6B. (n = 100). Изображения были получены с фиксированным временем экспозиции. (T-критерий Стьюдента). B) Гистограмма показывает процент метафазных клеток с покадровой визуализацией с смещенными хромосомами из фиг. 6G. Планки погрешностей показывают ± стандартное отклонение. из трех независимых экспериментов.(T-критерий Стьюдента). C) Митотические клетки tsBN2, подвергнутые указанному лечению. Затем клетки фиксировали и окрашивали тубулином. Стрелки указывают на смещенные хромосомы. Шкала шкалы: 10 мкм. D) Количественная гистограмма, показывающая долю метафазных клеток с нормальным выравниванием, незначительным смещением (<3 крошечных «отстающих» кластеров хромосом) и большим смещением (> 3 сильно смещенных кластеров хромосом). E) Гистограмма показывает общую интенсивность холодоустойчивых микротрубочек (A.U.) после обработки деполимеризацией микротрубочек, индуцированной холодом, как указано.Планки погрешностей показывают ± стандартное отклонение. (T-критерий Стьюдента). F) Репрезентативные изображения обработанных холодом митотических веретен из митотических клеток tsBN2, инкубированных при разрешающей или недопустимой температуре. Шкала шкалы: 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045836.s006

(TIF)

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: HY YP CH. Проведены эксперименты: Ю.П. Ч. КС. Проанализированы данные: HY YP CH KS SK CG. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты для анализа: HY YP CH KS SK CG.Написал статью: YP KS HY.

Ссылки

1. 1. Maiato H, DeLuca J, Salmon ED, Earnshaw WC (2004) Динамический интерфейс кинетохора-микротрубочка. Журнал клеточной науки 117: 5461–5477.
2. 2. Cheeseman IM, Chappie JS, Wilson-Kubalek EM, Desai A (2006) Консервативная сеть KMN составляет основной сайт связывания микротрубочек кинетохоры. Ячейка 127: 983–997.
3. 3. ДеЛука Дж. Г., Галл В.Е., Чиферри С., Чимини Д., Мусаккио А. и др.(2006) Динамика микротрубочек кинетохор и стабильность прикрепления регулируются Hec1. Cell 127: 969–982.
4. 4. Sundin LJ, Guimaraes GJ, Deluca JG (2011) Белки комплекса NDC80 Nuf2 и Hec1 вносят особый вклад в прикрепление кинетохор к микротрубочкам в митозе. Молекулярная биология клетки 22: 759–768.
5. 5. McCleland ML, Kallio MJ, Barrett-Wilt GA, Kestner CA, Shabanowitz J, et al. (2004) Комплекс Ndc80 позвоночных содержит гомологи Spc24 и Spc25, которые необходимы для установления и поддержания прикрепления кинетохор к микротрубочкам.Современная биология: CB 14: 131–137.
6. 6. Акиёси Б., Сарангапани К.К., Пауэрс А.Ф., Нельсон С.Р., Рейчоу С.Л. и др. (2010) Натяжение напрямую стабилизирует воссозданные прикрепления кинетохор и микротрубочек. Природа 468: 576–579.
7. 7. Гайтанос Т.Н., Сантамария А., Джеяпракаш А.А., Ван Б., Конти Е. и др. (2009) Стабильные взаимодействия кинетохора-микротрубочка зависят от комплекса Ska и его нового компонента Ska3 / C13Orf3. Журнал EMBO 28: 1442–1452.
8. 8. Kalab P, Pralle A, Isacoff EY, Heald R, Weis K (2006) Анализ регулируемого RanGTP градиента в митотических соматических клетках.Природа 440: 697–701.
9. 9. Kalab P, Heald R (2008) Градиент RanGTP — GPS для митотического веретена. Журнал клеточной науки 121: 1577–1586.
10. 10. Wilde A, Lizarraga SB, Zhang L, Wiese C, Gliksman NR, et al. (2001) Ран стимулирует сборку веретена, изменяя динамику микротрубочек и баланс двигательной активности. Природа клеточной биологии 3: 221–227.
11. 11. Ciciarello M, Mangiacasale R, Lavia P (2007) Пространственный контроль митоза с помощью GTPase Ran.Клеточные и молекулярные науки о жизни: CMLS 64: 1891–1914.
12. 12. Clarke PR, Zhang C (2008) Пространственная и временная координация митоза с помощью Ran GTPase. Обзоры природы Молекулярная клеточная биология 9: 464–477.
13. 13. Kalab P, Weis K, Heald R (2002) Визуализация градиента Ran-GTP в интерфазных и митотических экстрактах яиц Xenopus. Наука 295: 2452–2456.
14. 14. Li HY, Ng WP, Wong CH, Iglesias PA, Zheng Y (2007) Координация выравнивания хромосом и митотической прогрессии с помощью сигнала Ran на основе хромосом.Клеточный цикл 6: 1886–1895.
15. 15. Арнаутов А., Дассо М. (2003) Ran GTPase регулирует функцию кинетохор. Клетка развития 5: 99–111.
16. 16. Нишитани Х., Оцубо М., Ямасита К., Иида Х., Пайнс Дж. И др. (1991) Потеря RCC1, ядерного ДНК-связывающего белка, отделяет завершение репликации ДНК от активации протеинкиназы cdc2 и митоза. Журнал EMBO 10: 1555–1564.
17. 17. Lampson MA, Renduchitala K, Khodjakov A, Kapoor TM (2004) Исправление неправильного прикрепления хромосомы к веретену во время деления клетки.Природа клеточной биологии 6: 232–237.
18. 18. Биггинс С., Северин Ф.Ф., Бхалла Н., Сассун И., Хайман А.А. и др. (1999) Консервативная протеинкиназа Ipl1 регулирует связывание микротрубочек с кинетохорами у почкующихся дрожжей. Гены и развитие 13: 532–544.
19. 19. Бринкли Б.Р., Картрайт-младший (1975) Холодолабильные и холодоустойчивые микротрубочки в митотическом веретене клеток млекопитающих. Анналы Нью-Йоркской академии наук 253: 428–439.
20. 20. Musacchio A, Hardwick KG (2002) Контрольная точка веретена: структурное понимание динамической передачи сигналов.Nat Rev Mol Cell Biol 3: 731–741.
21. 21. Kulukian A, Han JS, Cleveland DW (2009) Неприкрепленные кинетохоры катализируют выработку ингибитора анафазы, которому требуется матрица Mad2 для примирования Cdc20 для связывания BubR1. Dev Cell 16: 105–117.
22. 22. Фуллер Б.Г., Лэмпсон М.А., Фоли Е.А., Росаско-Нитчер С., Ле К.В. и др. (2008) Активация средней зоны полярного сияния B в анафазе вызывает внутриклеточный градиент фосфорилирования. Природа 453: 1132–1136.
23. 23. Santaguida S, Tighe A, D’Alise AM, Taylor SS, Musacchio A (2010) Анализ роли MPS1 в биориентации хромосомы и контрольной точки веретена с помощью низкомолекулярного ингибитора реверсина.Журнал клеточной биологии 190: 73–87.
24. 24. Silverman-Gavrila RV, Wilde A (2006) Ran необходим перед метафазой для сборки веретена и выравнивания хромосом и после метафазы для сегрегации хромосом и организации среднего тела веретена. Молекулярная биология клетки 17: 2069–2080.
25. 25. Bamba C, Bobinnec Y, Fukuda M, Nishida E (2002) GTPase Ran регулирует позиционирование хромосом и сборку ядерной оболочки in vivo. Современная биология: CB 12: 503–507.
26. 26. Stevens D, Gassmann R, Oegema K, Desai A (2011) Некоординированная потеря сплоченности хроматид — частый результат длительной остановки метафазы. PloS one 6: e22969.
27. 27. Даум Дж. Р., Потапова Т. А., Сивакумар С., Даниэль Дж. Дж., Флинн Дж. Н. и др. (2011) Усталость от когезии вызывает разделение хроматид в клетках, задержанных в метафазе. Современная биология: CB 21: 1018–1024.
28. 28. Carazo-Salas RE, Gruss OJ, Mattaj IW, Karsenti E (2001) Ran-GTP координирует регуляцию зарождения и динамики микротрубочек во время сборки митотического веретена.Природа клеточной биологии 3: 228–234.
29. 29. Funabiki H, Murray AW (2000) Хромокинезин Xenopus Xkid необходим для выравнивания метафазных хромосом и должен деградировать, чтобы обеспечить движение анафазных хромосом. Ячейка 102: 411–424.
30. 30. Арнаутов А., Азума Ю., Риббек К., Джозеф Дж., Боярчук Ю. и др. (2005) Crm1 является митотическим эффектором Ran-GTP в соматических клетках. Природа клеточной биологии 7: 626–632.
31. 31. Torosantucci L, De Luca M, Guarguaglini G, Lavia P, Degrassi F (2008) Локализованное накопление RanGTP способствует зарождению микротрубочек на кинетохорах в соматических клетках млекопитающих.Молекулярная биология клетки 19: 1873–1882.
32. 32. Ананд Р., Ким А.Ю., Брент М., Марморштейн Р. (2008) Биохимический анализ киназы MST1: выяснение С-концевой регуляторной области. Биохимия 47: 6719–6726.
33. 33. Cimini D, Wan X, Hirel CB, Salmon ED (2006) Aurora kinase способствует обороту микротрубочек кинетохор, чтобы уменьшить ошибки сегрегации хромосом. Современная биология: CB 16: 1711–1718.
34. 34. Santaguida S, Vernieri C, Villa F, Ciliberto A, Musacchio A (2011) Доказательства того, что Aurora B участвует в передаче сигналов контрольной точки шпинделя независимо от исправления ошибок.Журнал EMBO 30: 1508–1519.
35. 35. Maia AF, Feijao T, Vromans MJ, Sunkel CE, Lens SM (2010) Киназа Aurora B взаимодействует с CENP-E, чтобы способствовать своевременному наступлению анафазы. Хромосома 119: 405–413.
36. 36. Тацука М., Катаяма Х., Ота Т., Танака Т., Одашима С. и др. (1998) Многоядерность и повышенная плоидность, вызванные сверхэкспрессией митотической киназы, ассоциированной с полярным сиянием и Ipl1-подобным средним телом, в раковых клетках человека. Исследования рака 58: 4811–4816.
37. 37.Дичфилд С., Джонсон В.Л., Тайге А., Элстон Р., Хаворт С. и др. (2003) Aurora B связывает выравнивание хромосом с анафазой, направляя BubR1, Mad2 и Cenp-E на кинетохоры. Журнал клеточной биологии 161: 267–280.
38. 38. Nishitani H, Kobayashi H, Ohtsubo M, Nishimoto T (1990) Клонирование кДНК Xenopus RCC1, гомолога гена RCC1 человека: комплементация мутации tsBN2 и идентификация продукта. Журнал биохимии 107: 228–235.
39. 39.

    No related posts.