Расход лада х рей: какой расход топлива на 100 км автомобиля Лада XRAY, норма расхода комплектаций

Содержание

Расход топлива Лада Х Рей 1.6, 1.8 по паспорту и по отзывам

Содержание статьи

Набирающая популярность модель от АвтоВАЗ Lada Xray появилась на рынке в 2015 году. Она классифицируется как малый кроссовер или хэтчбек с повышенной проходимостью. Машина разработана на платформе Лада Веста, но имеет более высокое качество, что сразу было отмечено специалистами и покупателями. Среди преимуществ модели отмечают:

  1. комфорт и узнаваемый современный дизайн;
  2. качественные отделочные материалы;
  3. мягкая надежная подвеска;
  4. увеличенный клиренс;
  5. удобное управление на любой скорости;
  6. надежные бензиновые двигатели.

Одним из достоинств Лада Х Рей является экономный расход топлива, что выделяет ее среди других компактных автомобилей повышенной проходимости. Автомобиль в разных версиях комплектуется механической и автоматической трансмиссией с передним приводом.

Версия с двигателем 1.6

Самый доступный вариант Лада Х Рей поставляется с 1.6-литровым двигателем ВАЗ-21129, хорошо зарекомендовавшим себя на предыдущих моделях. Он развивает 106 лошадиных сил, разгоняя машину до 172 км/ч, а до первой сотни за 11,7 секунды. Его расход бензина на 100 километров составляет:

  • по городу 9,3 л;
  • в смешанном режиме 7,2 л;
  • на трассе 5,9 л.

На более дорогие модификации устанавливается мотор с таким же объемом 1.6 от партнерской корпорации Renault-Nissan марки h5Mk на 114 лошадей с улучшенной динамикой. Он известен по другим моделям авто, популярным на отечественном рынке. Одной из его привлекательных особенностей является сниженный расход топлива:

  • в городском режиме 8,9 л;
  • средний расход 6,8 л;
  • по шоссе 5,6 л.

Отзывы владельцев Lada Xray

  • Александр, Орел. Брал самую простую комплектацию в 2016 году, могу отметить, что доволен своей Лада Х Рей, несмотря на критику, обрушившуюся на эту машину. Самое главное – она полностью стоит своих денег. Комфортный салон, подготовленная к отечественным реалиям подвеска. Двигатель при обкатке нельзя душить, при этом он очень надежен, хотя тяги иногда не хватает, что касается расхода, по кругу получается 10 литров на 100 километров.
  • Валерия, Нижний Новгород. Муж купил Lada Xray, чтобы избавиться от моих претензий к его внедорожнику. Машина мне сразу понравилась, одинаково хорошо управляется на трассе и проселке, когда я выбираюсь на дачу. Моторчик 1.6 на 106 сил вполне себе бодро тянет, мне вполне хватает. Единственный недостаток – хочется поменять механику на автомат. На свободной дороге расход 7,1 л, в городском режиме до 10-11 литров на 100 км пути, в зависимости от загруженности и сезона.
  • Сергей, Чебоксары. Покупал Хрей в конце 2016, с французским движком 1.6. Такое сочетание мне очень понравилось – качественная машина получилась, она ничем не напоминает предыдущие творения ВАЗа. Нравится спортивное поведение на трассе и повышенная проходимость по плохой дороге, хорошая управляемость. Расход не превышает 9 л даже зимой, на трассе можно спокойно уложиться в 6 л. Это несколько ниже, чем техническом паспорте, но я всем доволен.

Двигатель 1.8 с МКПП

Более динамичная версия автомобиля Lada Xray оборудуется мотором 1.8 ВАЗ-21179, развивающим 122 силы и механической пятиступенчатой коробкой. До первой сотни она разгоняется за 10,4 секунды, а максимальная скорость составляет 185 километров в час. При этом расход топлива, по сравнению с менее мощными версиями, остается на том же уровне:

  • на загруженных улицах 9,3 л;
  • в смешанном цикле 7,4 л;
  • по трассе 5,8 л.

Реальный расход

  • Николай, Екатеринбург. Купил одну из первых Лада Х Рей с двигателем 1.8 на механикой. На данный момент проехал 40 тыс. км, пока никаких проблем не выявил, менял только расходники. Динамика автомобиля на уровне, проходимость тоже, управление для такого высокого автомобиля, на удивление комфортное. Средний расход 9 литров, на скорости 90 км/ч на чистой дороге можно добиться 6 л АИ 95.
  • Иван, Москва. Брал Х Рей на ручке с движком 1.8, поскольку люблю динамичную езду. Очень доволен выбором, машина практичная, удобная и хорошо едет. Единственная проблема – залагала электроника управления стеклоподъемниками, но блок быстро заменили по гарантии. Остальное – на уровне, правда о бездорожье думать не приходится, хотя на грунтовке чувствует себя уверенно. Что касается расхода – на предельных режимах получается до 12 л на сотню, если средняя скорость 90-100 км/ч, модно уложиться в 6 литров.

Видео: расход зимой при низких температурах

Силовой агрегат 1.8 с АКПП

Чтобы расширить круг потенциальный покупателей, разработчики предложили для комплектации с 1.8 роботизированную коробку передач на 5 диапазонов. Она разгоняет машину до 186 км/ч, но динамика оказалась сниженной, разгон до сотни – 12,3 секунды. Это плата за сниженный расход топлива, который составляет:

  • в городе 8,6 л;
  • усредненный показатель 6,8 л;
  • на трассе 5,8 л.

Расход по отзывам

  • Анатолий, Ульяновск. Брал машину в 2016 году, топовый вариант с движком 1.8 и роботом. С удивлением отметил, что автомат действительно потребляет меньше топлива, правда, приходится платить динамикой при расходе. Расход топлива в моей Лада Икс Рей меня вполне устраивает, получается не более 9 л на 100 км, машина комфортна, проходима, легко управляется, правда, этот показатель у Веста СВ Кросс, на мой вкус, получше.
  • Владимир, Краснодар. Модель Лада Х Рей понравилась сразу, поэтому решил брать именно ее. Рассматривая характеристики двигателей, решил остановиться на 1.8, в комплектации с роботом, поскольку гонять не люблю, а бензина он потребляет меньше. Порадовало оснащение салона, превосходящее многих одноклассников. Клиренса достаточно для того, чтобы безопасно ездить по нашим дорогам, выбираться на дачу. Приятная упругая подвеска за 60 тыс. пробега не подвела ни разу, управляемость на уровне. Расход топлива в зависимости от сезона и режима 7-9 л на 100 километров.

 О том, как без особых усилий и затрат дать вторую жизнь автомобилю, второй ресурс, дополнительную мощность и всегда экономить около 1 литра топлива во всех режимах см по ссылке вверху любой страницы сайта.

Или в статье через строку «Поиск»: Вторая жизнь и второй ресурс для любого автомобиля, экономия топлива и дополнительная мощность. Как этого достичь?

Расход топлива Лада Х Рей 1.6, 1.8 (механика и автомат)на 100 км

Хотите приобрести надежный, стильный и современный автомобиль, который бы оправдал ваши ожидания? Считаете, такой изготовляют только за границей? — Совсем нет!

Хорошую машину можно приобрести и у отечественного ваза. Новая Лада Х Рей – отличный вариант. О том, какой расход топлива Лада Х Рей, а также других ее характеристиках, читайте в нашей статье.

Новинка отечественного автопрома

Презентация авто состоялась в 2016 году. Лада xray – это компактный и в то же время вместительный современный хэтчбек. Модель была создана благодаря сотрудничеству альянса Renault-Nissan и ваза. Икс рея – это огромный прорыв для отечественного производителя, который ознаменовал появления новых автомобилей – мощных, качественных, идущих в ногу со временем. Над дизайном авто трудилась группа дизайнеров ваза, которой руководил Стив Маттин.

Двигатель Расход (трасса) Расход (город) Расход (смешанный цикл)
 1.6i 106 MT  5.9 л/100 км  9.3 л/100 км  7.5 л/100 км

 1.6i 114 MT

 5,8 л/100 км  8,6 л/100 км  6.9 л/100 км

 1.8 122 AT

 —  —  7.1 л/100 км

Отметим, что некоторые внутренние и внешние элементы Икс реи были позаимствованы у модели-предшественницы xray – Лады Веста. Что же касается электроники и системы, отвечающей за безопасность, то здесь много чего было взято у альянса Renault-Nissan. Пластик, который используется в строении кузова и, собственно говоря, его верхняя часть изготавливают в Тольятти. Также в авто есть оригинальные вазовские элементы – их насчитывается около полутысячи.

Конечно же, высокое качество всех элементов вынуждает производителя повышать свою ценовую политику. Цена на Ладу Х Рей составляет не менее 12 тысяч долларов.

Благодаря непревзойденному качеству и многим новшествам, воплощенным отечественным производителем в новой марке машины, она получила довольно много хороших отзывов на форумах, где новоиспеченные владельцы также делятся фото своей «ласточки», что говорит о том, что труды дизайнеров не прошли даром.

Кратко о главном

Компания выпустила несколько модификаций авто с двигателем объемом 1,6 л и 1,8 л. рассмотрим их технические характеристики, а также расход топлива у Х Рей на 100 км  более детально.

1,6 л

 Это кроссовер с бензиновым мотором, объем которого составляет 1,6 л. Максимальная скорость, которую может развить автомобиль, – 174 км в час. А до 100 км в час он разгоняется за  11,4 секунды. Бак для топлива кроссовера рассчитан на 50 л. Мощность двигателя – 106 лошадиных сил. Впрыск топлива с электронным управлением.

 Потребление топлива на Лада Х Рей такой модели имеют средние показатели. Убедитесь в этом сами:

  • средний расход топлива у Lada X Ray на трассе – 5,9 литра;
  • в городе, проехав 100 км, расход топлива будет составлять 9,3 литра;
  • при смешанном цикле расход уменьшится до 7,2 литра.

1,8 л

Эта модель более мощная. Технические характеристики:

  • Объем двигателя – 1,8 литра.
  • Мощность – 122 лошадиные силы.
  • Впрыск топлива с электронным управлением.
  • Передний привод.
  • Бак для топлива на 50 л.
  • Максимальная скорость – 186 километров в час.
  • До 100 километров в час разгоняется за 10,9 секунды.
  • Расход бензина на Лада Х Рей (механика) на загородном цикле составляет 5,8 литра.
  • Затраты топлива на Х Рей по городу на 100 км – 8,6 литра.
  • При езде на смешанном цикле расход составляет около 6,8 литра.

Конечно же, данные, приведенные в техническом паспорте, не являются аксиомой. Реальный расход топлива на Lada X Ray в городе, на трассе и по смешанному циклу может немного отклоняться от указанных цифр. Почему? Расход топлива зависит от разных факторов, среди которых – качество бензина и способ вождения.

Итак, мы с вами рассмотрели новинку отечественного автопрома. Лада Х Рей – автомобиль, заслуживающий внимания, который сошел с конвейера благодаря сотрудничеству ваза со всемирно известными автопроизводителями. Это позволяет говорить о том, что новая модель Лады ничуть не хуже ее иностранных аналогов и это подтверждает, в том числе и расход горючего на Lada X Ray.

Расход топлива на Lada Xray

Сейчас трудно установить являлся ли ранее задуманным ходом разработчиков АвтоВаза выпуск Лады Икс Рей в 2021 году с движком в 1.8 литра. Или причиной этого стал их резвый ответ на запросы потребителей, когда сразу после появления первой модели компактного кроссовера в конце 2015 года, автолюбителями были высказаны претензии к пятидверному хетчебеку с мотором в 1,6 литра.

Помимо низкой мощности мотора были «предъявы» к малому диаметру колес, к глюкам роботизированной коробки скоростей и отсутствию кнопки отключения противобуксировочной системы, а также к тому, что модель имеет несоразмерный объему и мощности движка расход бензина.

Поэтому новая модель кроссовера имеет двигатель в 122 конских силы, в отличие от предыдущей в 106 л. с., механический тип коробки, колеса в 17 дюймов и обладает возможностью отключения противобуксировки. Основой этого авто является Renault Sandero, однако внешний дизайн и салон оригинальны, как кстати и подвеска (она была подвергнута модернизации), а также рулевое управление.

Похожие записи

Почему Lada Vesta лишается двигателя 1.8

Характеристики Лада Веста – на что надеятся в 2021 году

В 2021 году появилась высококлиренсная «Лада Икс Рей» с дополнением «Кросс», а вот выпуск с мотором Ниссан в 1,6 литра и 114 л. с. на время остановлен.

Паспортный расход топлива версий Лада Икс Рей

Для пользователя важен не столько паспортный, а реальный расход топлива х Рей, но для понимания отчего зависит потребление автомобилем горючего и для сравнения с реальным потреблением, следует знать данные технической документации:

  • Лада Икс Рей (1.6 л., 106 л. с.) – 7,5 литров на 100 км;
  • промежуточная Лада Икс Рей с движком от Ниссан (1.6 л., 114 л. с.) – 6,9 литров;
  • версия Лада Икс Рей (1.8 л., 122 л. с.) – 7, 1 литра на сотню км.

Исходя из технических характеристик, имеем самый большой расход горючего у первой версии кроссовера, а самый низкий – у авто с ниссановским мотором. Эти параметры установлены в результате лабораторных исследований и поэтому не могут считаться реальной нормой эксплуатации, а служат лишь сравнительными показателями. Совершенно очевидно, что реальные данные расхода горючего выше, чем указывает производитель в паспорте автомобиля.

Лада Х Рей подробно о расходе топлива

Хотите приобрести надежный, стильный и современный автомобиль, который бы оправдал ваши ожидания? Считаете, такой изготовляют только за границей? — Совсем нет! Хорошую машину можно приобрести и у отечественного ваза. Новая Лада Х Рей – отличный вариант. О том, какой расход топлива Лада Х Рей, а также других ее характеристиках, читайте в нашей статье.

Расход бензина в реальных условиях

Горючее при движении автомобиля расходуется непостоянно, и эта вариативность зависит не только от дорожных и климатических условий, но и в немалой степени от квалификации водителя. Если взять за 100 процентов реальные показатели возможной экономии горючего, то согласно отзывам водителей:

  • потребление топлива на 60 процентов зависит от манеры езды водителя;
  • на 15 процентов от режима работы кондиционера;
  • на 12 процентов от езды на недостаточно прогретом движке;
  • на 5 процентов при езде с включенным светом;
  • на 4 процента при езде с не накачанными до нормы, или широкими шинами;
  • на 4 процента, когда открыты окна салона при скорости выше 50 км/час.

Из вышеизложенного видно, на что необходимо обратить внимание водителя, чтобы наиболее эффективно и экономно использовать ресурс топлива.

Лада X Рей – реальный расход топлива

Новая модель автомобиля, выпускаемая российским концерном АвтоВАЗ, «Лада Икс Рей» производится в трёх вариантах комплектации двигателем, рассчитанных как на любителей мощных каров с высокими скоростными характеристиками и хорошей проходимостью, так и на тех, кто отдаёт предпочтение экономичным машинам с умеренными силовыми возможностями.

Все устанавливаемые на «Икс Рей» моторы, независимо от мощности и индивидуальных особенностей, соответствуют требованиям европейских стандартов экологичности.

Показатель расхода топлива при выборе автомобиля занимает оно из первых мест по значимости и не всегда находится в прямой зависимости от мощности мотора. При этом заводские показатели расхода топлива весьма приблизительны и на практике могут отличаться от истинных в обе стороны, так как потребление мотором топлива зависит не только от модели ДВС, но и от условий эксплуатации агрегата, а также индивидуального стиля вождения. Тем не менее, перечислим и рассмотрим все устанавливаемые на «Лада Икс Рей» двигатели в порядке возрастания их мощности и дадим оценку их «прожорливости».

Каков реальный средний расход горючего Лады Икс Рей?

Данные тест-драйва на большие расстояния (пробег 500 км. в реалиях российских дорог, причем как городе, так и за его пределами). В режиме обкатки хетчбек Лада Икс Рей с 1.8 -литровой энергоустановкой показал:

  • в среднем потребление составило 13,1 литра на сотню километров;
  • вне городских улиц средний расход был 7,5, а на улицах города – 14 литров;
  • наибольший показатель расхода на трассе был 9,1 литра;
  • наименьшее потребление на трассе было в 6,5 литра;
  • минимальный расход в режиме езды город-трасса – 9,5 литра.

При езде после обкатки расход топлива х рей может иметь меньшие показатели вплоть до 10 процентов от данных тест-драйва.

Новинка отечественного автопрома

Презентация авто состоялась в 2021 году. Лада xray – это компактный и в то же время вместительный современный хэтчбек. Модель была создана благодаря сотрудничеству альянса Renault-Nissan и ваза.

Икс рея – это огромный прорыв для отечественного производителя, который ознаменовал появления новых автомобилей – мощных, качественных, идущих в ногу со временем. Над дизайном авто трудилась группа дизайнеров ваза, которой руководил Стив Маттин.

ДвигательРасход (трасса)Расход (город)Расход (смешанный цикл)
1.6i 106 MT5.9 л/100 км9.3 л/100 км7.5 л/100 км
5,8 л/100 км8,6 л/100 км6.9 л/100 км
7.1 л/100 км

Отметим, что некоторые внутренние и внешние элементы Икс реи были позаимствованы у модели-предшественницы xray – Лады Веста. Что же касается электроники и системы, отвечающей за безопасность, то здесь много чего было взято у альянса Renault-Nissan. Пластик, который используется в строении кузова и, собственно говоря, его верхняя часть изготавливают в Тольятти. Также в авто есть оригинальные вазовские элементы – их насчитывается около полутысячи.

Конечно же, высокое качество всех элементов вынуждает производителя повышать свою ценовую политику. Цена на Ладу Х Рей составляет не менее 12 тысяч долларов.

Благодаря непревзойденному качеству и многим новшествам, воплощенным отечественным производителем в новой марке машины, она получила довольно много хороших отзывов на форумах, где новоиспеченные владельцы также делятся фото своей «ласточки», что говорит о том, что труды дизайнеров не прошли даром.

Расход топлива Lada XRAY (Лада Иксрей)

Представляем вашему вниманию информацию о расходе топлива модели концерна АвтоВАЗ Лада Иксрей (XRAY). Данный автомобиль является полноценным компактным кроссовером, поступившем в продажу в 2016 году.

Длина кроссовера составляет 4164 миллиметра, ширина 1764 мм, высота – 1570 мм. Колесная база составляет 2592 мм. Объем багажника – от 324 до 770 литров, при сложенных задних сидениях.

Сейчас доступны модификации с двигателем 1.6 литра и мощностью 106 лс, а также 1.6 литра мощностью 110 лс, а также модификация с двигателем 1.8 литра и мощностью 122 лс.

Расход топлива автомобиля Lada XRAY

Модификация 1.6л 106лс 5-МКПП
  • Городской цикл (л/100км): 9.3л
  • Загородный цикл (л/100км): 5.9л
  • Смешанный цикл (л/100км): 7.2л
Модификация 1.6л 110лс 5-МКПП
  • Городской цикл (л/100км): 8.9л
  • Загородный цикл (л/100км): 5.6л
  • Смешанный цикл (л/100км): 6.8л
Модификация 1.8л 122лс 5-АКПП робот
  • Городской цикл (л/100км): 8.6л
  • Загородный цикл (л/100км): 5.8л
  • Смешанный цикл (л/100км): 6.8л

Реальный расход, по отзывам автовладельцев Иксрея, в целом, соответствует заявленному производителем, поэтому беспокоиться о том, что расход автомобиля будет выше, не стоит. С учетом качества заправляемого топлива, в особенности, в регионах, расход может превышать заявленный на 0.5-1 литр, но это является допустимым в рамках стандартной погрешности.

Итак, подытожив, хотим сказать, что расход новой модели АвтоВАЗа является достаточно привлекательным для кроссовера и порадует тех, кто планирует покупать данную модель автомобиля. При замере расходов стоит помнить, какие факторы влияют на расход топлива и как возможно уменьшить расход.

Чтобы вы убедились, что расход топлива у реальных пользователей Лады XRAY совпадает с заявленным производителем, приводим несколько реальных отзывов с форумов и профильных сайтов:

Двигатель 1.6л, Ниссан, 110 лошадей. Расход средний (70% город) – 8,1л. Считаю очень приемлемым.

Москва, езжу много. С 16 февраля пробег 2800км

По трассе получилось уложиться в 6.5 литра, но это я совсем совсем тошнил.

Всем привет. У меня была Гранта Спорт, ниже 8.2 л опустить не получалось, Сейчас поменял на Х-рея с ниссановским мотором езжу в основном по трассе, выставляю дисплей на моментальный расход и держу не выше 7 л, Расход 7.3, но нужны железные нервы скорость варьируется 90-70. Езда тоска. При скорости 100-120 расход вырастает до 8.5 л.

6,5 по трассе.сегодня вечером вернулся из отпуска.2,5 тыс туда и обратно.

Если вас заинтересовали также отзывы о других характеристиках автомобиля и реальный опыт владения Иксреем, рекомендуем почитать отзывы тут: https://www.drom.ru/reviews/lada/xray/

Ну а в конце хотим также порекомендовать посмотреть два видео-обзора этого автомобиля

Какой реальный, средний расход топлива на Lada XRAY

Один из главных моментов, который волнует хозяина автомобиля – это расход бензина. Эти значения сильно меняются, в зависимости от условий и режима эксплуатации транспортного средства. Мы решили выяснить, какой реальный средний расход топлива на Lada XRAY.

Расход топлива Lada XRAY в смешанном цикле (город/траса) заявленный заводом-производителем от 6,9 до 7,5 л/100км:

  • Двигатель ВАЗ-21129 (1,6 л, 106 л.с) с МКПП – 7,5 л/100км;
  • Двигатель ВАЗ-21179 (1,8 л, 122 л.с) с АМТ – 7,1 л/100км;
  • Двигатель Renault-Nissan h5Mk (1,6 л, 110 л.с) с МКПП – 6,9 л/100км.

Получается, что самым экономичным является XRAY с двигателем от Renault-Nissan на «механике». А самый большой расход топлива отмечен у 1,6-литрового ВАЗовского мотора.

Производитель отмечает, что данные по расходу топлива определены в стандартизованных условиях с применением специального измерительного оборудования, в соответствии с требованиями ГОСТ Р41.101–99 (Правила ЕЭК ООН №101). Служат для сравнения автомобилей различных автопроизводителей. Эксплуатационной нормой не являются.

Чаще всего, на практике расход топлива оказываются больше, чем указывает производитель, это подтверждается по первым отзывам владельцев XRAY:

  1. При пробеге 500 км в городском режиме расход топлива составил 13,1 л/100км;
  2. По трассе терпимо кушает, в районе 7.5, а вот в городе 12 л/100км;
  3. Расход по трасе показал – 9,3 л/100км;
  4. На трассе показывает 6,3 – 6.5 л/100км;
  5. Расход бензина по трассе примерно 6.3 л/100км;
  6. Расход в смешанном цикле (город-трасса) примерно 7.4 — 7,8 л/100км;
  7. Смешанный расход 9 – 9.5 л/100км.

Все эти отзывы написаны в период обкатки, после 2000-3000 км пробега эти значения могут немного уменьшиться.

Расход топлива за 11000 км. пробега выложил один из владельцев :

Из-за чего может быть большой расход топлива автомобиля:

  1. Расход увеличивается зимой.
  2. Частые разгоны и торможения.
  3. Использование бензина АИ92, вместо АИ95.
  4. Использование дополнительного электрооборудования в авто (например, работа кондиционера увеличивает расход топлива примерно на 1 л/100 км.).
  5. Неисправности в работе двигателя или его систем.
  6. Другие причины.

А какой средний расход топлива на Вашем автомобиле Lada XRAY? Довольны ли вы этими цифрами? Какой при этом вы заливаете бензин? Участвуйте в опросе и оставляйте комментарии!

Источник: xn--80aal0a.xn--80asehdb

Расход топлива Лада Х-рей: 1.6, 1.8 на 100 км пути |Расход.ру

Номинальный расход топлива является одной из самых информативных и важных для водителя характеристикой автомобиля. Именно ее часто используют производители для рекламы и продвижения той или иной новой автомодели.

Среди владельцев автомобилей с пробегом считается приемлемым расходование бензина или дизеля до 10 литров на 100 километров. В зарубежных странах этот показатель указывается в милях, поэтому часто нужен перерасчет в «родные» единицы. Очень полезными считаются таблицы расхода топлива, доступные в данном разделе сайта.

О чем говорит показатель расхода топлива? Что означает эта характеристика? Речь идет о расходе углеводородного топлива. Например, для внедорожника цифра соответствует 9.5 литрам на 100 км. Она вполне приемлема, прежде всего, за счет веса и мощности автомобиля. Показатель может быть снижен за счет следующего:

  • использования систем рекуперации энергии при торможении;
  • облегчения веса автомобиля при замене элементов кузова и ходовой инновационными материалами;
  • совершенствования двигателя;
  • замены выхлопной системы.

Для новых моделей расход в 6 л/100 км считается вполне «крейсерским» показателем, но он будет выше для тяжелых внедорожников и пикапов и ниже для маленьких гибридов. Необходимую информацию можно найти в размещенных таблицах.

Что делать, если расход топлива выше номинального? Если автомобиль потребляет больше горючего и не соответствует указанному в таблице номинальному показателю, то это означает наличие неисправности. Насколько она серьезная, и как ее можно устранить, подскажут опытные мастера сервисного центра. В отдельных случаях тюнинг позволяет еще более оптимизировать расход топлива, но это обычно обеспечивается за счет облегчения конструкции кузова или при замене двигателя. Конкретные рекомендации могут дать профессиональные автомобильные техники.

Расход топлива Лада Х-рей составляет от 6.8 до 7.2 л на 100 км.

Лада Х-рей выпускается со следующими типами топлива: Бензин АИ-92.

Расход топлива Лада Х-рей 2015, хэтчбек 5 дв., 1 поколение

Объем двигателяМощностьТрансмиссияПриводТопливоРасход
1.8 л122 л.с.роботпередний приводБензин АИ-926,8
1.6 л110 л.с.МКППпередний приводБензин АИ-926,8
1.8 л122 л.с.МКППпередний приводБензин АИ-927,1
1.6 л106 л.с.МКППпередний приводБензин АИ-927,2

расход топлива на 100 км

Новая модель автомобиля, выпускаемая российским концерном АвтоВАЗ, «Лада Икс Рей» производится в трёх вариантах комплектации двигателем, рассчитанных как на любителей мощных каров с высокими скоростными характеристиками и хорошей проходимостью, так и на тех, кто отдаёт предпочтение экономичным машинам с умеренными силовыми возможностями.

Все устанавливаемые на «Икс Рей» моторы, независимо от мощности и индивидуальных особенностей, соответствуют требованиям европейских стандартов экологичности.

Показатель расхода топлива при выборе автомобиля занимает оно из первых мест по значимости и не всегда находится в прямой зависимости от мощности мотора. При этом заводские показатели расхода топлива весьма приблизительны и на практике могут отличаться от истинных в обе стороны, так как потребление мотором топлива зависит не только от модели ДВС, но и от условий эксплуатации агрегата, а также индивидуального стиля вождения. Тем не менее, перечислим и рассмотрим все устанавливаемые на «Лада Икс Рей» двигатели в порядке возрастания их мощности и дадим оценку их «прожорливости».

ДВС ВАЗ-21129

Этим мотором объёмом 1,6 л и мощностью 106 л. с. комплектуется базовая модель «Икс Рей». При разработке мотора ВАЗ-21129 за основу был взят двигатель ВАЗ-21127, устанавливаемый на более ранних моделях «Лады» – «Гранта», «Калина» и «Приора». В обоих ДВС датчики ДМРВ (массы расходуемого воздуха) заменены совмещёнными датчиками ДТВ (температуры воздуха) и ДАД (абсолютного давления), чем оптимизирована система впуска воздуха, обеспечено лучшее качество рабочей смеси и стабилизирована работа мотора на холостом ходу.

Внедрённая в конструкцию впускного коллектора ВАЗ-21129 система заслонок позволяет регулировать его длину, что стабилизирует работу двигателя на малых и больших оборотах.

В результате модернизации двигатель стал соответствовать нормам экологичности «Евро-5», тогда как ВАЗ-21127 тянул только на «Евро-4».

Заводские цифры расхода топлива автомобиля с ВАЗ-21129 в сочетании с 5-ступенчатой механической трансмиссией:

  • в городском режиме – 9,3 л/100 км;
  • на трассе – 5,9 л/100 км;
  • смешанный цикл – 7,2 л/100 км.

После модернизации ДВС ВАЗ-21129 и понижения его степени сжатия до значения 10,45 запрет использования топлива ниже А-95 утратил свою категоричность – применение АИ-92 вполне допустимо.

На практике расход топлива «Lada XRay» с мотором ВАЗ-21129 лишь немногим отличается от цифр, заявленных производителем. Даже при использовании в холодных условиях, нерациональных переключениях передач и динамичном стиле езды в городе потребление горючего возрастает не более чем на 1 л на 100 км.

Двигатель HR16DE и его особенности

Прототипом этого мотора является двигатель Renault К4М. При разработке моторов серии HR производитель Nissan акцентировал внимание на повышении их КПД. Блок цилиндров выполнен из алюминия, что уменьшает время прогрева ДВС, и этим экономит топливо. Повышение класса чистоты обработки поверхностей минимизировало трение, уменьшило износ деталей и, опять же, снизило расход топлива. Производителем были также внедрены новейшие разработки в системы газораспределения и топливных форсунок, чтобы добиться большей эффективности использования энергии сгорания топлива.

В системе привода ГРМ мотора HR16DE объёмом 1,6 л мощностью 110 л. с. с механической коробкой передач используется не привычный для ВАЗа ремень, а цепь, отличающаяся свойственной двигателям Nissan надёжностью и долговечностью – ресурс в 150-200 тыс. км для этой цепи не критичен, признаки растяжения при таком пробеге могут только начать проявляться в виде не свойственного работе этого мотора треска.

При одинаковом с ВАЗ-21129 объёме HR16DE имеет большую (110 л. с.) мощность, но при этом отличается экономичностью – расход топлива на 100 км составляет:

  • в городе — 8,5 л;
  • на трассе – 5,7 л;
  • в смешанном режиме – 7,3 л.

Максимальная скорость, которую развивает «Лада Икс Рей» с этим ДВС, составляет 171 км/час, а 100 км/час достигаются за 10,3 сек.

На автомобиле Lada X Ray двигатель HR16DE устанавливается с французской коробкой передач от Renault и, по уверенным отзывам владельцев машин, при грамотном обслуживании является динамичным и безотказным агрегатом, ресурс которого составляет как минимум 250-300 тыс. км.

Учитывая степень надёжности и разницу в мощности с двигателем ВАЗ-21129, можно с уверенностью утверждать, что мотор HR16DE превосходит его не только по динамике, но и по экономичности.

Мотор ВАЗ-21179

Этот двигатель объёмом 1,8 л и мощностью в 122 л. с. производится АвтоВАЗом и является самым мощным из устанавливаемых на «Лада Икс Рей», однако расход топлива ДВС ВАЗ-21179 нельзя назвать выдающимся. Разработкой агрегата, который внешне мало отличается от ВАЗовских 16-клапанников, занималась компания «СуперАвто» – филиал АвтоВАЗа. По сути это – новый, собственной разработки мотор.

Основные характеристики двигателя:

  • рабочий объем — 1774 см³;
  • число цилиндров – 4;
  • количество клапанов  – 16;
  • диаметр цилиндров – 84 мм;
  • максимальная мощность — 122 л.с.;
  • крутящий момент — 170 Нм при 3750 об/мин.

Увеличение объёма двигателя в этом моторе получено за счёт большего хода поршней вследствие изменения профиля кривошипа и укорочения шатунов, при этом была использована облегчённая шатунно-поршневая группа — от зарубежного брендового производителя Federal-Mogul.

Охлаждение двигателя обеспечивается водяным насосом корейского производства с надёжным подшипником и долговечными уплотнениями, превосходящим ВАЗовские по качеству и производительности.

Масляный насос алюминиевый, также южно-корейского производства (GMB), почти вдвое превосходящий ВАЗовские по производительности при равных оборотах двигателя.

Двигатель ВАЗ-21179 устанавливается на «Лада Икс Рей» с роботизированной коробкой передач. Это сочетание обеспечивает машине не особо резвый разгон до 100 км/час – 10,2 сек.

Расход топлива в зависимости от цикла езды (л/100 км):

  • город — 8,8;
  • шоссе – 6;
  • смешанный цикл — 7,5.

Если сравнить показатели расхода топлива двигателя ВАЗ-21179 с описанными выше моторами, то соотношение прироста мощности к увеличению расхода топлива делает этот двигатель экономичным.

Это подтверждают и отзывы автовладельцев, заявляющие о значительном повышении расхода лишь при использовании топлива сомнительного качества или агрессивном стиле вождения в городских условиях. Лишь устанавливаемый на «Лада Икс Рей Спорт» двигатель ВАЗ-21179, мощность которого за счёт тюнинга доведена до 150 л. с., имеет показатели потребления топлива, значительно превышающие рассмотренные выше ДВС. Но это объяснимо словом «Спорт» в названии модели и вполне уместно.

При выборе автомобиля «Лада Икс Рей» можно, конечно, в целях экономии отдать предпочтение двигателю с максимально скромными показателями расхода горючего. Но не факт, что ресурс такого мотора окажется выше, чем у более мощного агрегата. Кроме того, именно запас мощности под капотом может оказать неоценимую услугу в критической ситуации, когда всё решают доли секунды.

Lada XRAY (Лада Иксрей) — средний расход топлива в литрах на 100 км

Представляем вашему вниманию информацию о расходе топлива модели концерна АвтоВАЗ Лада Иксрей (XRAY). Данный автомобиль является полноценным компактным кроссовером, поступившем в продажу в 2016 году.

Длина кроссовера составляет 4164 миллиметра, ширина 1764 мм, высота – 1570 мм. Колесная база составляет 2592 мм. Объем багажника – от 324 до 770 литров, при сложенных задних сидениях.

Сейчас доступны модификации с двигателем 1.6 литра и мощностью 106 лс, а также 1.6 литра мощностью 110 лс, а также модификация с двигателем 1.8 литра и мощностью 122 лс.

 

 

 

 

Расход топлива автомобиля Lada XRAY

 

Модификация 1.6л 106лс 5-МКПП

  • Городской цикл (л/100км): 9.3л
  • Загородный цикл (л/100км): 5.9л
  • Смешанный цикл (л/100км): 7.2л

 

Модификация 1.6л 110лс 5-МКПП

  • Городской цикл (л/100км): 8.9л
  • Загородный цикл (л/100км): 5.6л
  • Смешанный цикл (л/100км): 6.8л

 

Модификация 1.8л 122лс 5-АКПП робот

  • Городской цикл (л/100км): 8.6л
  • Загородный цикл (л/100км): 5.8л
  • Смешанный цикл (л/100км): 6.8л

 

Реальный расход, по отзывам автовладельцев Иксрея, в целом, соответствует заявленному производителем, поэтому беспокоиться о том, что расход автомобиля будет выше, не стоит. С учетом качества заправляемого топлива, в особенности, в регионах, расход может превышать заявленный на 0.5-1 литр, но это является допустимым в рамках стандартной погрешности.

 

Итак, подытожив, хотим сказать, что расход новой модели АвтоВАЗа является достаточно привлекательным для кроссовера и порадует тех, кто планирует покупать данную модель автомобиля. При замере расходов стоит помнить, какие факторы влияют на расход топлива и как возможно уменьшить расход.

 

Чтобы вы убедились, что расход топлива у реальных пользователей Лады XRAY совпадает с заявленным производителем, приводим несколько реальных отзывов с форумов и профильных сайтов:

Двигатель 1.6л, Ниссан, 110 лошадей. Расход средний (70% город) – 8,1л.
Считаю очень приемлемым.

Москва, езжу много. С 16 февраля пробег 2800км

 

По трассе получилось уложиться в 6.5 литра, но это я совсем совсем тошнил.

 

8,2 литра 50/50 город-трасса

 

Всем привет. У меня была Гранта Спорт, ниже 8.2 л опустить не получалось, Сейчас поменял на Х-рея с ниссановским мотором езжу в основном по трассе, выставляю дисплей на моментальный расход и держу не выше 7 л, Расход 7.3, но нужны железные нервы скорость варьируется 90-70. Езда тоска. При скорости 100-120 расход вырастает до 8.5 л.

 

6,5 по трассе.сегодня вечером вернулся из отпуска.2,5 тыс туда и обратно.

 

Если вас заинтересовали также отзывы о других характеристиках автомобиля и реальный опыт владения Иксреем, рекомендуем почитать отзывы тут: https://www.drom.ru/reviews/lada/xray/

 

Ну а в конце хотим также порекомендовать посмотреть два видео-обзора этого автомобиля

 

Реальный расход топлива у Лада х Рей


Набирающая популярность модель от АвтоВАЗ Lada Xray появилась на рынке в 2020 году. Она классифицируется как малый кроссовер или хэтчбек с повышенной проходимостью. Машина разработана на платформе Лада Веста, но имеет более высокое качество, что сразу было отмечено специалистами и покупателями. Среди преимуществ модели отмечают:
  1. комфорт и узнаваемый современный дизайн;
  2. качественные отделочные материалы;
  3. мягкая надежная подвеска;
  4. увеличенный клиренс;
  5. удобное управление на любой скорости;
  6. надежные бензиновые двигатели.

Одним из достоинств Лада Х Рей является экономный расход топлива, что выделяет ее среди других компактных автомобилей повышенной проходимости. Автомобиль в разных версиях комплектуется механической и автоматической трансмиссией с передним приводом.

Лада X Рей – реальный расход топлива

Новая модель автомобиля, выпускаемая российским концерном АвтоВАЗ, «Лада Икс Рей» производится в трёх вариантах комплектации двигателем, рассчитанных как на любителей мощных каров с высокими скоростными характеристиками и хорошей проходимостью, так и на тех, кто отдаёт предпочтение экономичным машинам с умеренными силовыми возможностями.
Все устанавливаемые на «Икс Рей» моторы, независимо от мощности и индивидуальных особенностей, соответствуют требованиям европейских стандартов экологичности.

Показатель расхода топлива при выборе автомобиля занимает оно из первых мест по значимости и не всегда находится в прямой зависимости от мощности мотора. При этом заводские показатели расхода топлива весьма приблизительны и на практике могут отличаться от истинных в обе стороны, так как потребление мотором топлива зависит не только от модели ДВС, но и от условий эксплуатации агрегата, а также индивидуального стиля вождения. Тем не менее, перечислим и рассмотрим все устанавливаемые на «Лада Икс Рей» двигатели в порядке возрастания их мощности и дадим оценку их «прожорливости».

Плюсы и минусы модели Лада Икс Рей Кросс

  • Весьма привлекательный дизайн машины
  • Большой клиренс и энергоемкая подвеска

  • Система Lada Ride Select реально помогает
  • Улучшена эргономика салона и багажника
  • Инженеры поработали с управляемостью
    • Пока только одна модификация на выбор
    • Все еще много огрехов при нашей сборке
    • Накладка бампера цепляет на неровностях
    • Проблемы с масложором так и не решены
    • Цена авто уже не такая привлекательная

    ДВС ВАЗ-21129

    Этим мотором объёмом 1,6 л и мощностью 106 л. с. комплектуется базовая модель «Икс Рей». При разработке мотора ВАЗ-21129 за основу был взят двигатель ВАЗ-21127, устанавливаемый на более ранних моделях «Лады» – «Гранта», «Калина» и «Приора». В обоих ДВС датчики ДМРВ (массы расходуемого воздуха) заменены совмещёнными датчиками ДТВ (температуры воздуха) и ДАД (абсолютного давления), чем оптимизирована система впуска воздуха, обеспечено лучшее качество рабочей смеси и стабилизирована работа мотора на холостом ходу.

    Внедрённая в конструкцию впускного коллектора ВАЗ-21129 система заслонок позволяет регулировать его длину, что стабилизирует работу двигателя на малых и больших оборотах.

    В результате модернизации двигатель стал соответствовать нормам экологичности «Евро-5», тогда как ВАЗ-21127 тянул только на «Евро-4».

    Заводские цифры расхода топлива автомобиля с ВАЗ-21129 в сочетании с 5-ступенчатой механической трансмиссией:

    • в городском режиме – 9,3 л/100 км;
    • на трассе – 5,9 л/100 км;
    • смешанный цикл – 7,2 л/100 км.

    После модернизации ДВС ВАЗ-21129 и понижения его степени сжатия до значения 10,45 запрет использования топлива ниже А-95 утратил свою категоричность – применение АИ-92 вполне допустимо.

    На практике расход топлива «Lada XRay» с мотором ВАЗ-21129 лишь немногим отличается от цифр, заявленных производителем. Даже при использовании в холодных условиях, нерациональных переключениях передач и динамичном стиле езды в городе потребление горючего возрастает не более чем на 1 л на 100 км.

    Двигатель HR16DE и его особенности

    Прототипом этого мотора является двигатель Renault К4М. При разработке моторов серии HR производитель Nissan акцентировал внимание на повышении их КПД. Блок цилиндров выполнен из алюминия, что уменьшает время прогрева ДВС, и этим экономит топливо. Повышение класса чистоты обработки поверхностей минимизировало трение, уменьшило износ деталей и, опять же, снизило расход топлива. Производителем были также внедрены новейшие разработки в системы газораспределения и топливных форсунок, чтобы добиться большей эффективности использования энергии сгорания топлива.

    В системе привода ГРМ мотора HR16DE объёмом 1,6 л мощностью 110 л. с. с механической коробкой передач используется не привычный для ВАЗа ремень, а цепь, отличающаяся свойственной двигателям Nissan надёжностью и долговечностью – ресурс в 150-200 тыс. км для этой цепи не критичен, признаки растяжения при таком пробеге могут только начать проявляться в виде не свойственного работе этого мотора треска.

    При одинаковом с ВАЗ-21129 объёме HR16DE имеет большую (110 л. с.) мощность, но при этом отличается экономичностью – расход топлива на 100 км составляет:

    • в городе — 8,5 л;
    • на трассе – 5,7 л;
    • в смешанном режиме – 7,3 л.

    Максимальная скорость, которую развивает «Лада Икс Рей» с этим ДВС, составляет 171 км/час, а 100 км/час достигаются за 10,3 сек.

    На автомобиле Lada X Ray двигатель HR16DE устанавливается с французской коробкой передач от Renault и, по уверенным отзывам владельцев машин, при грамотном обслуживании является динамичным и безотказным агрегатом, ресурс которого составляет как минимум 250-300 тыс. км.

    Учитывая степень надёжности и разницу в мощности с двигателем ВАЗ-21129, можно с уверенностью утверждать, что мотор HR16DE превосходит его не только по динамике, но и по экономичности.

    Мотор ВАЗ-21179

    Этот двигатель объёмом 1,8 л и мощностью в 122 л. с. производится АвтоВАЗом и является самым мощным из устанавливаемых на «Лада Икс Рей», однако расход топлива ДВС ВАЗ-21179 нельзя назвать выдающимся. Разработкой агрегата, который внешне мало отличается от ВАЗовских 16-клапанников, занималась – филиал АвтоВАЗа. По сути это – новый, собственной разработки мотор.

    Основные характеристики двигателя:

    • рабочий объем — 1774 см³;
    • число цилиндров – 4;
    • количество клапанов – 16;
    • диаметр цилиндров – 84 мм;
    • максимальная мощность — 122 л.с.;
    • крутящий момент — 170 Нм при 3750 об/мин.

    Увеличение объёма двигателя в этом моторе получено за счёт большего хода поршней вследствие изменения профиля кривошипа и укорочения шатунов, при этом была использована облегчённая шатунно-поршневая группа — от зарубежного брендового производителя Federal-Mogul.

    Какой реальный, средний расход топлива на Lada XRAY

    Один из главных моментов, который волнует хозяина автомобиля — это расход бензина. Эти значения сильно меняются, в зависимости от условий и режима эксплуатации транспортного средства. Мы решили выяснить, какой реальный средний расход топлива на Lada XRAY.

    Расход топлива Lada XRAY в смешанном цикле (город/траса) заявленный заводом-производителем от 6,9 до 7,5 л/100км:

    • Двигатель ВАЗ-21129 (1,6 л, 106 л.с) с МКПП — 7,5 л/100км;
    • Двигатель ВАЗ-21179 (1,8 л, 122 л.с) с АМТ — 7,1 л/100км;
    • Двигатель Renault-Nissan h5Mk (1,6 л, 110 л.с) с МКПП — 6,9 л/100км.

    Получается, что самым экономичным является XRAY с двигателем от Renault-Nissan на «механике». А самый большой расход топлива отмечен у 1,6-литрового ВАЗовского мотора.

    Производитель отмечает, что данные по расходу топлива определены в стандартизованных условиях с применением специального измерительного оборудования, в соответствии с требованиями ГОСТ Р41.101–99 (Правила ЕЭК ООН №101). Служат для сравнения автомобилей различных автопроизводителей. Эксплуатационной нормой не являются.

    Чаще всего, на практике расход топлива оказываются больше, чем указывает производитель, это подтверждается по первым отзывам владельцев XRAY:

    1. При пробеге 500 км в городском режиме расход топлива составил 13,1 л/100км;
    2. По трассе терпимо кушает, в районе 7.5, а вот в городе 12 л/100км;
    3. Расход по трасе показал — 9,3 л/100км;
    4. На трассе показывает 6,3 — 6.5 л/100км;
    5. Расход бензина по трассе примерно 6.3 л/100км;
    6. Расход в смешанном цикле (город-трасса) примерно 7.4 — 7,8 л/100км;
    7. Смешанный расход 9 — 9.5 л/100км.

    Все эти отзывы написаны в период обкатки, после 2000-3000 км пробега эти значения могут немного уменьшиться.

    Расход топлива за 11000 км. пробега выложил один из владельцев :

    Из-за чего может быть большой расход топлива автомобиля:

    1. Расход увеличивается зимой.
    2. Частые разгоны и торможения.
    3. Использование бензина АИ92, вместо АИ95.
    4. Использование дополнительного электрооборудования в авто (например, работа кондиционера увеличивает расход топлива примерно на 1 л/100 км.).
    5. Неисправности в работе двигателя или его систем.
    6. Другие причины.

    А какой средний расход топлива на Вашем автомобиле Lada XRAY? Довольны ли вы этими цифрами? Какой при этом вы заливаете бензин? Участвуйте в опросе и оставляйте комментарии!

    Паспортный расход топлива версий Лада Икс Рей

    Для пользователя важен не столько паспортный, а реальный расход топлива х Рей, но для понимания отчего зависит потребление автомобилем горючего и для сравнения с реальным потреблением, следует знать данные технической документации:

    • Лада Икс Рей (1.6 л., 106 л. с.) – 7,5 литров на 100 км;
    • промежуточная Лада Икс Рей с движком от Ниссан (1.6 л., 114 л. с.) – 6,9 литров;
    • версия Лада Икс Рей (1.8 л., 122 л. с.) – 7, 1 литра на сотню км.

    Исходя из технических характеристик, имеем самый большой расход горючего у первой версии кроссовера, а самый низкий – у авто с ниссановским мотором. Эти параметры установлены в результате лабораторных исследований и поэтому не могут считаться реальной нормой эксплуатации, а служат лишь сравнительными показателями. Совершенно очевидно, что реальные данные расхода горючего выше, чем указывает производитель в паспорте автомобиля.

    Лада Х Рей подробно о расходе топлива

    Набирающая популярность модель от АвтоВАЗ Lada Xray появилась на рынке в 2020 году. Она классифицируется как малый кроссовер или хэтчбек с повышенной проходимостью. Машина разработана на платформе Лада Веста, но имеет более высокое качество, что сразу было отмечено специалистами и покупателями. Среди преимуществ модели отмечают:

    1. комфорт и узнаваемый современный дизайн;
    2. качественные отделочные материалы;
    3. мягкая надежная подвеска;
    4. увеличенный клиренс;
    5. удобное управление на любой скорости;
    6. надежные бензиновые двигатели.

    Одним из достоинств Лада Х Рей является экономный расход топлива, что выделяет ее среди других компактных автомобилей повышенной проходимости. Автомобиль в разных версиях комплектуется механической и автоматической трансмиссией с передним приводом.

    Лада Х-рей Кросс

    • Авто
    • Лада
    • XRAY Cross

    Лада Х-рей Кросс 1-го поколения в кузове пятидверный хэтчбек была представлена в 2020 году и практически сразу сборку кроссовера наладили на предприятии концерна в городе Тольятти. Автомобиль отличается от других моделей компании наличием новой системы Lada Ride Select.

    К семейству X-ray также относят: XRAY.

    • Модификации
    • ТТХ
    • Отзывы
    • Цена

    Версия с двигателем 1.6

    Самый доступный вариант Лада Х Рей поставляется с 1.6-литровым двигателем ВАЗ-21129, хорошо зарекомендовавшим себя на предыдущих моделях. Он развивает 106 лошадиных сил, разгоняя машину до 172 км/ч, а до первой сотни за 11,7 секунды. Его расход бензина на 100 километров составляет:

    • по городу 9,3 л;
    • в смешанном режиме 7,2 л;
    • на трассе 5,9 л.

    На более дорогие модификации устанавливается мотор с таким же объемом 1.6 от партнерской корпорации Renault-Nissan марки h5Mk на 114 лошадей с улучшенной динамикой. Он известен по другим моделям авто, популярным на отечественном рынке. Одной из его привлекательных особенностей является сниженный расход топлива:

    • в городском режиме 8,9 л;
    • средний расход 6,8 л;
    • по шоссе 5,6 л.

    Двигатель 1.8 с МКПП

    Более динамичная версия автомобиля Lada Xray оборудуется мотором 1.8 ВАЗ-21179, развивающим 122 силы и механической пятиступенчатой коробкой. До первой сотни она разгоняется за 10,4 секунды, а максимальная скорость составляет 185 километров в час. При этом расход топлива, по сравнению с менее мощными версиями, остается на том же уровне:

    • на загруженных улицах 9,3 л;
    • в смешанном цикле 7,4 л;
    • по трассе 5,8 л.

    Реальный расход

    • Николай, Екатеринбург. Купил одну из первых Лада Х Рей с двигателем 1.8 на механикой. На данный момент проехал 40 тыс. км, пока никаких проблем не выявил, менял только расходники. Динамика автомобиля на уровне, проходимость тоже, управление для такого высокого автомобиля, на удивление комфортное. Средний расход 9 литров, на скорости 90 км/ч на чистой дороге можно добиться 6 л АИ 95.
    • Иван, Москва. Брал Х Рей на ручке с движком 1.8, поскольку люблю динамичную езду. Очень доволен выбором, машина практичная, удобная и хорошо едет. Единственная проблема – залагала электроника управления стеклоподъемниками, но блок быстро заменили по гарантии. Остальное – на уровне, правда о бездорожье думать не приходится, хотя на грунтовке чувствует себя уверенно. Что касается расхода – на предельных режимах получается до 12 л на сотню, если средняя скорость 90-100 км/ч, модно уложиться в 6 литров.

    Видео: расход зимой при низких температурах

    1,8 л

    Эта модель более мощная. Технические характеристики:

    • Объем двигателя – 1,8 литра.
    • Мощность – 122 лошадиные силы.
    • Впрыск топлива с электронным управлением.
    • Передний привод.
    • Бак для топлива на 50 л.
    • Максимальная скорость – 186 километров в час.
    • До 100 километров в час разгоняется за 10,9 секунды.
    • Расход бензина на Лада Х Рей (механика) на загородном цикле составляет 5,8 литра.
    • Затраты топлива на Х Рей по городу на 100 км – 8,6 литра.
    • При езде на смешанном цикле расход составляет около 6,8 литра.

    Конечно же, данные, приведенные в техническом паспорте, не являются аксиомой. Реальный расход топлива на Lada X Ray в городе, на трассе и по смешанному циклу может немного отклоняться от указанных цифр. Почему? Расход топлива зависит от разных факторов, среди которых – качество бензина и способ вождения.

    Итак, мы с вами рассмотрели новинку отечественного автопрома. Лада Х Рей – автомобиль, заслуживающий внимания, который сошел с конвейера благодаря сотрудничеству ваза со всемирно известными автопроизводителями. Это позволяет говорить о том, что новая модель Лады ничуть не хуже ее иностранных аналогов и это подтверждает, в том числе и расход горючего на Lada X Ray.

    Новая Лада: Калина на холодную заводится и глохнет

    Силовой агрегат 1.8 с АКПП

    Чтобы расширить круг потенциальный покупателей, разработчики предложили для комплектации с 1.8 роботизированную коробку передач на 5 диапазонов. Она разгоняет машину до 186 км/ч, но динамика оказалась сниженной, разгон до сотни – 12,3 секунды. Это плата за сниженный расход топлива, который составляет:

    • в городе 8,6 л;
    • усредненный показатель 6,8 л;
    • на трассе 5,8 л.

    Расход по отзывам

    • Анатолий, Ульяновск. Брал машину в 2020 году, топовый вариант с движком 1.8 и роботом. С удивлением отметил, что автомат действительно потребляет меньше топлива, правда, приходится платить динамикой при расходе. Расход топлива в моей Лада Икс Рей меня вполне устраивает, получается не более 9 л на 100 км, машина комфортна, проходима, легко управляется, правда, этот показатель у Веста СВ Кросс, на мой вкус, получше.
    • Владимир, Краснодар. Модель Лада Х Рей понравилась сразу, поэтому решил брать именно ее. Рассматривая характеристики двигателей, решил остановиться на 1.8, в комплектации с роботом, поскольку гонять не люблю, а бензина он потребляет меньше. Порадовало оснащение салона, превосходящее многих одноклассников. Клиренса достаточно для того, чтобы безопасно ездить по нашим дорогам, выбираться на дачу. Приятная упругая подвеска за 60 тыс. пробега не подвела ни разу, управляемость на уровне. Расход топлива в зависимости от сезона и режима 7-9 л на 100 километров.

    Каков реальный средний расход горючего Лады Икс Рей?

    Данные тест-драйва на большие расстояния (пробег 500 км. в реалиях российских дорог, причем как городе, так и за его пределами). В режиме обкатки хетчбек Лада Икс Рей с 1.8 -литровой энергоустановкой показал:

    • в среднем потребление составило 13,1 литра на сотню километров;
    • вне городских улиц средний расход был 7,5, а на улицах города – 14 литров;
    • наибольший показатель расхода на трассе был 9,1 литра;
    • наименьшее потребление на трассе было в 6,5 литра;
    • минимальный расход в режиме езды город-трасса – 9,5 литра.

    При езде после обкатки расход топлива х рей может иметь меньшие показатели вплоть до 10 процентов от данных тест-драйва.

    Расход топлива Lada XRAY

    Люди создали машины разными, пробки уравняли их!

    Lada Xray – первый кроссовер, который вышел с конвейеров АвтоВАЗа. Концепт был показан на выставке автомобилей в Москве в 2012 году. Серийное производство началось только в 2015.

    Спустя год были показаны концепты будущих модификаций модели. Это версии Спорт и Кросс, которые выделяются более технологичными подвесками, трансмиссиями и моторами.

    Официальные данные (л/100 км)

    ДвигательРасход (город)Расход (трасса)Расход (смешанный)
    1.6 MT 106 л.с. (механика)9.35.97.2
    1.6 MT 110 л.с. (механика)8.95.66.8
    1.8 MT 122 л.с. (механика)9.35.87.1
    1.8 AMT 122 л.с. (робот)8.65.86.8

    Сейчас Лада Х-рей комплектуется двумя бензиновыми моторами. Основной агрегат – 1.6 литра, который может развивать мощность до 106 лошадиных сил. Для него доступна только механическая трансмиссия, работающая в пяти режимах. Расход топлива на 100 км у этой комплектации составляет 9 литров в городе и 6 литров на трассе.

    Второй мотор – 1.8 литра. Его пиковая мощность равняется 122 лошадиным силам. Здесь уже доступен выбор коробки передач: либо пятиступенчатая механика, либо пятиступенчатый автомат. Расход бензина тут на уровне в 7 литров.

    Новинка отечественного автопрома

    Презентация авто состоялась в 2020 году. Лада xray – это компактный и в то же время вместительный современный хэтчбек. Модель была создана благодаря сотрудничеству альянса Renault-Nissan и ваза.

    Икс рея – это огромный прорыв для отечественного производителя, который ознаменовал появления новых автомобилей – мощных, качественных, идущих в ногу со временем. Над дизайном авто трудилась группа дизайнеров ваза, которой руководил Стив Маттин.

    ДвигательРасход (трасса)Расход (город)Расход (смешанный цикл)
    1.6i 106 MT5.9 л/100 км9.3 л/100 км7.5 л/100 км
    5,8 л/100 км8,6 л/100 км6.9 л/100 км
    7.1 л/100 км

    Отметим, что некоторые внутренние и внешние элементы Икс реи были позаимствованы у модели-предшественницы xray – Лады Веста. Что же касается электроники и системы, отвечающей за безопасность, то здесь много чего было взято у альянса Renault-Nissan. Пластик, который используется в строении кузова и, собственно говоря, его верхняя часть изготавливают в Тольятти. Также в авто есть оригинальные вазовские элементы – их насчитывается около полутысячи.

    Конечно же, высокое качество всех элементов вынуждает производителя повышать свою ценовую политику. Цена на Ладу Х Рей составляет не менее 12 тысяч долларов.

    Благодаря непревзойденному качеству и многим новшествам, воплощенным отечественным производителем в новой марке машины, она получила довольно много хороших отзывов на форумах, где новоиспеченные владельцы также делятся фото своей «ласточки», что говорит о том, что труды дизайнеров не прошли даром.

    Резонансный перенос энергии флуоресценции – обзор

    2.1 Разработка зонда FRET для мониторинга активации каспаз

    Технология FRET может предоставить ценную информацию о динамике и характере ферментативной активности. Ранние зонды FRET для активации каспазы использовали гибридный белок, то есть белок с усиленной голубой флуоресценцией (ECFP) в качестве донора FRET и белок с усиленной желтой флуоресценцией (EYFP) в качестве акцептора FRET, связанные пептидами, содержащими расщепление каспазы-3. последовательность, DEVD (Luo, Yu, Pu, & Chang, 2001; Rehm et al., 2002; Тиас и др., 2000). Наиболее важной характеристикой зонда FRET является специфичность к молекуле-мишени. Молярный коэффициент экстинкции акцепторного белка является важным фактором для определения эффективности FRET; однако молярный коэффициент экстинкции EYFP, обычного флуоресцентного белка в акцепторах FRET, демонстрирует высокую чувствительность к протонам и ионам хлора, особенно в физиологических условиях (Jayaraman, Haggie, Wachter, Remington, & Verkman, 2000; Llopis, McCaffery, Miyawaki, Фаркуар и Цзянь, 1998).В нескольких сообщениях предполагается, что подкисление происходит во время апоптоза (Matsuyama, Llopis, Deveraux, Tsien, & Reed, 2000; Perez-Sala, Collado-Escobar, & Mollinedo, 1995; Vincent, TenBroeke, & Maiese, 1999) и что хлорид/ бикарбонатный обменник участвует в апоптотических событиях (Araki et al., 2002; Maeno, Ishizaki, Kanaseki, Hazama, & Okada, 2000). Поскольку изменение концентрации хлорида также происходит в нейронах, было бы крайне важно использовать нечувствительный к хлориду индикатор для мониторинга активации каспазы в нейронах.Из-за этих особенностей исследователи должны с осторожностью использовать EYFP в качестве акцептора FRET, особенно для визуализации апоптоза in vivo .

    Чтобы преодолеть эти ограничения, Венера была использована в качестве акцептора FRET в зонде SCAT3 (рис. 12.1; Takemoto et al., 2003), поскольку она демонстрирует низкую чувствительность к протонам и ионам хлора (Nagai et al., 2002). Действительно, SCAT3 показал высокую стабильность in vitro и в живых клетках по сравнению с ранее описанным зондом ECFP-EYFP (Takemoto et al., 2003). Разработка индикаторов SCAT3 позволила исследователям отслеживать активацию каспазы в живых клетках и in vivo в режиме реального времени (Campbell & Okamoto, 2013; Koto, Kuranaga, & Miura, 2009; Kuranaga et al., 2011; Nakajima, Kuranaga, Sugimura, Miyawaki, & Miura, 2011; Ohgushi et al., 2010; Takemoto et al., 2007; Yamaguchi et al., 2011).

    Сворачивание белка изучено с помощью одиночной молекулы FRET

    Curr Opin Struct Biol. Авторская рукопись; доступно в PMC 2009 1 февраля.

    Опубликовано в окончательной редактированной форме AS:

    PMCID: PMC2323684

    NIHMSID: NIHMS43467

    Benjamin Schuler

    1 Biochemisches Institutute, Universität Zürich, WinterThurerSTR. 190, 8057 Zürich, Switzerland

    William A. Eaton

    2 Лаборатория химической физики, Национальный институт пищеварения, диабета и болезней почек, Национальный институт здоровья, Bethesda, MD, 20892−0520

    1 9029 1 Institut, Universität Zürich, Winterthurerstr.190, 8057 Zürich, Switzerland

    2 Лаборатория химической физики, Национальный институт пищеварения, диабета и болезней почек, Национальный институт здоровья, Bethesda, MD, 20892−0520

    См. другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

    Abstract

    Полное понимание механизма сворачивания белков требует описания распределения микроскопических путей, соединяющих свернутые и развернутые состояния. Это распределение, в принципе, можно описать с помощью компьютерного моделирования и теоретических моделей сворачивания белков, но оно скрыто в обычных экспериментах с большими ансамблями молекул, поскольку измеряются только средние свойства.Долгосрочная цель исследований флуоресценции одиночных молекул состоит в том, чтобы разрешить структурные события во времени, когда отдельные молекулы совершают переходы между свернутым и развернутым состояниями. Хотя такие исследования все еще находятся в зачаточном состоянии, работа до сих пор показывает большие надежды и уже дала новую и важную информацию по текущим проблемам сворачивания белков, которую было невозможно или трудно получить из ансамблевых измерений.

    Введение

    Основным технологическим достижением последних лет стала возможность исследования фолдинга и разворачивания белков на уровне отдельных молекул.В настоящее время используются два основных метода: метод силового зонда и флуоресценция. Эксперименты с использованием атомно-силовой микроскопии и лазерного пинцета дали важную и ранее недоступную информацию о механической стабильности и фолдинге белков, и читатель отсылается к ряду недавних обзоров по этой теме [1-5]. Здесь мы сосредоточимся на исследовании фолдинга одиночных молекул белка с использованием флуоресцентного метода, который дал наиболее важные и интересные результаты на сегодняшний день, резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET) [6-8], впервые продемонстрированной на отдельных молекулах Ha et al. . [9] и применительно к фолдингу белков в пионерских исследованиях Hochstrasser, Weiss и их сотрудников [10-12]. Недавние приложения для укладки белков с использованием других методов флуоресценции одиночных молекул и тесно связанного метода флуоресцентной корреляционной спектроскопии можно найти в другом месте [13,14].

    Захватывающая перспектива наблюдения за свертыванием отдельных молекул была основным мотивирующим фактором для исследований FRET одиночных молекул. Дополнительную мотивацию дает компьютерное моделирование и аналитические модели фолдинга, которые играют все более важную роль в исследованиях механизмов фолдинга белков.Если быть точным, то все, что можно знать о механизме сворачивания белка, содержится в полном наборе траекторий сворачивания из расчетов атомистической молекулярной динамики. Фактически, совсем недавно такие расчеты стали возможными для белков с микросекундной укладкой с использованием распределенных вычислений [15]. Более того, большая часть того, что хотелось бы знать о механизмах, содержится в траекториях крупнозернистых представлений белков [16]. Хотя ансамблевые эксперименты предоставили множество экспериментальных данных для проверки точности теоретических расчетов, сами по себе экспериментальные результаты дают относительно мало информации о реальных механизмах складывания.

    Этот момент можно прояснить, рассмотрев случай белка, проявляющего поведение в двух состояниях (). Каким бы ни был зонд, в кинетических экспериментах будут наблюдаться одни и те же скорости релаксации. Кроме того, измеряемое свойство в любой момент времени будет представлять собой простую линейную комбинацию усредненного свойства свернутого и развернутого состояния, а ход времени будет экспоненциальным. Причина такого простого поведения в том, что существует разделение шкал времени; то есть взаимная конверсия между всеми конформерами в каждом из двух состояний является быстрой по сравнению со скоростью взаимной конверсии между двумя состояниями.Экспериментальная информация о механизме перехода белка между свернутым и развернутым состояниями исходит прежде всего из систематического анализа кинетики сворачивания, в частности значений ϕ [17]. Этот подход использует измерения относительного влияния мутаций на скорость и равновесие и их интерпретацию с помощью внетермодинамических отношений, чтобы сделать вывод о средней структуре, окружающей мутировавший остаток в ансамбле структур, составляющих переходное состояние.За немногими исключениями [18] никакой структурной информации нет ни в одной другой точке вдоль координаты реакции. Таким образом, такие ансамблевые эксперименты дают относительно немного, хотя и важную информацию о механизме, который для фолдинга белка означает описание последовательности структурных событий в микроскопических путях, соединяющих свернутое и развернутое состояния, и распределение этих путей, которое может быть получено из обоих симуляций. [15,19] и решение кинетических уравнений аналитических моделей [20] (Э.Р. Генри и WAE, неопубликованные результаты).

    Динамика сворачивания отдельной белковой молекулы в двух состояниях, показанная как диффузионный процесс на двумерной поверхности свободной энергии (слева) с соответствующей равновесной траекторией сворачивания/разворачивания (белый). Внутримолекулярное расстояние (соответствующее расстоянию между донорным и акцепторным флуорофором в эксперименте FRET с одной молекулой) построено как функция времени (справа), демонстрируя быстрые скачки между свернутым и развернутым состояниями.Конечной целью экспериментов с одиночными молекулами является разрешение этих переходов во времени (увеличенная шкала, вверху справа).

    В отличие от групповых исследований, исследование отдельных молекул обещает прямой доступ к информации о микроскопических путях. Конечной целью исследований FRET с одной молекулой является наблюдение с временным разрешением отдельных событий сворачивания белка, что позволит получить траектории эффективности FRET — и, следовательно, расстояния — в зависимости от времени, когда молекула переходит между развернутым и свернутым состояниями.Такие данные должны дать новое понимание и стать гораздо более требовательными тестами как для симуляционных, так и для аналитических моделей, тем самым ускоряя прогресс в направлении количественного и более полного понимания механизмов сворачивания белков.

    Хотя исследования одиночных молекул FRET все еще находятся в зачаточном состоянии, пошаговое продвижение к цели наблюдения за свертыванием одиночных молекул уже дало новую и важную информацию, которую либо невозможно, либо трудно получить из ансамблевых измерений.Такая информация включает в себя возможность подсчета термодинамических состояний по распределению эффективности FRET, отдельное измерение свойств субпопуляций, таких как распределения расстояний и динамика развернутого состояния при наличии избытка свернутого состояния, а также определение констант равновесия и коэффициентов скорости из траекторий FRET путем измерения среднего времени пребывания в свернутом и развернутом состояниях при равновесии. Будут представлены примеры каждого из них с кратким обсуждением их отношения к текущим проблемам фолдинга белков.

    Точность определения расстояний по одной молекуле FRET

    В отличие от большинства оптических методов FRET предоставляет количественную информацию о межмолекулярных расстояниях 1 . Сразу же возникает вопрос, который возникает при использовании больших хромофоров, необходимых для исследований FRET одиночных молекул: насколько точна эта информация о расстоянии? Этот вопрос был впервые рассмотрен для полипептидов Schuler et al. [22], которые использовали полипролин в качестве спейсера между донорными и акцепторными хромофорами, как и Stryer и Haugland в своем классическом исследовании, установившем FRET в качестве «спектроскопической линейки» в биофизических исследованиях [23].Шулер и др. измерял эффективность FRET молекул, которые производят всплеск фотонов при свободном рассеянии в освещенном объеме конфокального микроскопа и из него (1). Они обнаружили, что средняя эффективность FRET на коротких расстояниях была немного ниже, чем предсказывала теория Фёрстера, но обнаружили, что она была намного выше, чем предсказывалось на расстояниях больше, чем R 0 , предполагая, что полипролин является жестким стержнем во всех транс конформация.Двумя возможными объяснениями небольшого расхождения на малых расстояниях являются отсутствие полного ориентационного усреднения в течение короткого времени жизни донора, что приводит к ориентационному фактору κ 2 < 2/3, и нарушение приближения точечного диполя теории Ферстера. , что требует, чтобы расстояние между хромофорами было большим по сравнению с размером хромофоров. Чтобы объяснить гораздо большее несоответствие для более длинных полипролиновых спейсеров, они провели моделирование молекулярной динамики, используя атомистическое представление полипролина в неявном растворителе (т.е. Langevin), которые показали, что полностью -транс--полипролин не является жестким стержнем, и пришли к выводу, что изгиб для сближения донора и акцептора отвечает за более высокую эффективность. Впоследствии Watkins et al. [24] измерили FRET одиночных иммобилизованных молекул полипролина и обнаружили статическое распределение конформаций, которое они приписали наличию цис пролинов, но не оценили их вклад. Doose и др. .[25] также пришли к выводу, что полипролин содержит цис- изомеров по данным FCS с переносом электронов на короткие расстояния и ансамблевым измерениям. Лучший и др. . [26] использовали комбинацию ЯМР-спектроскопии для определения доли и местоположения цис- -пролинов и траекторий одиночных молекул фотонов с использованием импульсного пикосекундного возбуждения свободно диффундирующих молекул полипролина для получения точной эффективности FRET из коррелированных по времени субпопуляций. гистограммы подсчета одиночных фотонов и расчеты молекулярной динамики, включающие красители и их линкеры в явном растворителе для интерпретации результатов.Эти более реалистичные и точные расчеты показывают, что полностью -транс--форма полипролина менее гибкая, чем в предыдущих моделях, и что перегибы, возникающие из-за внутренних -цис--пролинов в 30% молекул, и гибкость хромофорные линкеры, по-видимому, в первую очередь ответственны за сближение донора и акцептора, что приводит к более высокой средней эффективности FRET. Кроме того, Best и др. . [26] разработали теорию распределения донорных и акцепторных фотонов во вспышке от отдельных молекул для количественного учета дробового шума и широкого распределения эффективности FRET [27,28] из-за большого количества цис- изомеров, с использованием популяций, определенных с помощью ЯМР, и эффективности, рассчитанной на основе моделирования молекулярной динамики.

    Обзор аппаратуры и обработки данных в конфокальной спектроскопии одиночных молекул. На схеме справа показаны основные компоненты 4-канального конфокального прибора для одиночных молекул, такого как имеющийся в продаже [85], который собирает флуоресцентные фотоны, разделенные по поляризации и длине волны, и записывает их индивидуальное время прихода. (а) Образец траектории зарегистрированных фотонов, зарегистрированных от молекул, свободно диффундирующих в растворе (в этом примере Csp Tm в 1.5 M GdmCl [37,38]), где каждый всплеск соответствует отдельной молекуле, пересекающей дифракционно-ограниченный конфокальный объем (см. правый верхний угол схемы). (b) 2-мерная гистограмма времени жизни флуоресценции донора τ D в зависимости от эффективности переноса E , рассчитанная по отдельным вспышкам, в результате чего получаются субпопуляции, которые можно отнести к свернутому и развернутому белку и молекулам без активного акцептора при E ≈ 0 (заштриховано серым цветом). (в) Проекция гистограммы на ось E .(d) Гистограммы подсчета отдельных фотонов с корреляцией по времени для конкретных субпопуляций от донорных и акцепторных фотонов из всех всплесков, отнесенных к развернутым молекулам, которые можно использовать для извлечения распределений расстояний [31,36,38]. ( e ) Функция корреляции интенсивности донора, специфичная для субпопуляции, в этом случае сообщает о наносекундной динамике реконфигурации развернутого белка [58].

    Исследования полипролина служат примером важности молекулярного моделирования для извлечения информации о расстоянии, и в той степени, в которой моделирование является точным, также предполагается, что точные расстояния могут быть получены из одиночной молекулы FRET.Дополнительными доказательствами точности расстояний по одиночной молекуле FRET являются измерения с использованием двухцепочечной ДНК [29, 30], которая является идеально жестким спейсером для определения донорно-акцепторных расстояний. Более прямой тест точности определения расстояния в полипептидах был проведен Merchant et al. . [31], которые изучали распределение расстояний в денатурированном состоянии белка L. Они показали, что затухание времени жизни флуоресценции можно достаточно хорошо объяснить сквозным распределением расстояний гауссовой цепи, которое считается статическим в течение время жизни флуоресценции донора (см. обсуждение динамики развернутой цепи ниже).Это распределение определяется одним параметром 〈 R 2 〉, среднеквадратичным сквозным расстоянием, которое связано с радиусом вращения, R g , посредством 〈 Р 2 〉 = 6〈 Р г 2 〉. Было обнаружено, что R г , рассчитанное по FRET-определенному 〈 R 2 〉 для белка L, полностью денатурированного при 4 М хлорида гуанидиния (GdmCl), равно 2.6 ± 0,1 нм, что очень хорошо согласуется со значением 2,60 ± 0,03 нм, полученным из измерений SAXS в тех же условиях. Кузьменкина и др. . также обнаружили хорошее соответствие между радиусом вращения, рассчитанным по средней эффективности переноса одиночных молекул РНКазы Н в 6 мкМ GdmCl (3,8 нм) и предыдущими результатами SAXS (3,6 нм) [32].

    Подсчет термодинамических состояний

    Простейший эксперимент по сворачиванию белков с одной молекулой состоит в наблюдении за вспышками фотонов от свободно диффундирующих молекул () при различных концентрациях денатуранта.Ограничением этого эксперимента является то, что типичное время пребывания в конфокальном объеме составляет всего около 500 мкс, но большим преимуществом является то, что эксперимент свободен от артефактов от поверхностных взаимодействий, которые могут быть связаны с методами иммобилизации, которые будут обсуждаться позже. Если свернутые, развернутые и частично свернутые субпопуляции взаимопревращаются гораздо медленнее, чем время пребывания, распределение эффективности FRET покажет пики, соответствующие средней эффективности каждой субпопуляции (1).Следовательно, количество пиков в распределении эффективности FRET соответствует количеству термодинамических состояний, а точнее, с учетом вырождений, минимальному числу термодинамических состояний. Хотя это еще не наблюдалось экспериментально, существуют интересные теоретические исследования того, как распределения эффективности FRET изменяются в условиях, когда скорость взаимного преобразования между состояниями FRET не медленна по сравнению со временем наблюдения [33-35].

    Во всех экспериментах по свободной диффузии на белках, которые демонстрируют поведение двух состояний в ансамблевых измерениях и имеют достаточно низкие скорости сворачивания и разворачивания, в распределении эффективности FRET наблюдаются два пика при промежуточных концентрациях денатуранта, соответствующие свернутым и развернутым популяциям. ().Пока примерами являются ингибитор химотрипсина 2 (CI2) [12,36], белок холодового шока Csp Tm [31,37,38], связывающий белок ацил-КоА (ACBP) [36], РНКаза HI [32,39]. , белок L [31,40], домен B белка A [41] и белок иммунитета Im9 [42]. Два состояния кинетики сворачивания белков были продемонстрированы для Csp Tm в неравновесном эксперименте FRET с одной молекулой Lipman et al . [43]. В этой работе микрожидкостное устройство было объединено с обнаружением одиночной молекулы в эксперименте по смешиванию с непрерывным потоком.Эффективность FRET отдельных молекул определяли по мере прохождения молекул через конфокальный объем. Их положение в канале и скорость потока определяли время наблюдения после разбавления химического денатуранта. В самое раннее время после смешивания (100 мс) присутствует единственный пик, соответствующий эффективности FRET развернутых молекул. Амплитуда этого пика уменьшается со временем и связана с одновременным увеличением пика более высокой эффективности, соответствующего свернутой субпопуляции ().Как указывалось выше, именно такое поведение ожидается для системы с двумя состояниями, в которой происходит просто обмен популяциями со временем без изменения среднего свойства любой популяции.

    Кинетика сворачивания белков, измеренная с помощью спектроскопии одиночных молекул в микрожидкостном смесительном устройстве [43]. Начиная с Csp и Tm , развернутого при высокой концентрации денатуранта (вверху), гистограммы эффективности переноса измеряются в разных положениях вдоль канала, соответствующих разным временам после смешивания.Подгонка к гауссианам, имеющим одно и то же положение и ширину пика во все времена, иллюстрирует перераспределение населенностей, ожидаемое для системы с двумя состояниями после первоначального коллапса цепи.

    Интересным применением измерений распределения эффективности FRET может быть проверка так называемого «односостоятельного» сценария сворачивания Муньоса и его сотрудников, в котором отсутствует барьер свободной энергии, разделяющий свернутое и развернутое состояния при любых концентрациях денатуранта [44]. ]. Для этих белков скорость кинетической релаксации будет короче, чем время пребывания, и близка к пределу скорости сворачивания, который оценивается в ∼( N /100) мкс ( N — число остатков) [45].Наблюдался бы только один пик, но для белков, сворачивающихся в такой временной шкале, также наблюдался бы один пик, если бы присутствовал барьер из-за усреднения, которое является результатом множественных переходов сворачивания/развертывания в течение ~500 мкс времени пребывания в конфокальный объем. Однако, если бы можно было замедлить динамику, например, увеличив вязкость без изменения поверхности свободной энергии, папка с «одним состоянием» по-прежнему демонстрировала бы один пик при всех концентрациях денатуранта, но он постоянно смещался бы в сторону более низких значений FRET. эффективность по мере увеличения концентрации денатуранта.Следует отметить, что выявление безбарьерной укладки может быть более проблематичным, если барьер существует при высоком уровне денатурации и исчезает, когда белок стабилизируется за счет снижения концентрации денатуранта [41], как это предусмотрено в первоначальном «нисходящем» сценарии Волайнса и Онучича. [46].

    Структура развернутой субпопуляции

    Уникальность экспериментов по свободной диффузии на одиночных молекулах состоит в том, что структурные и динамические свойства субпопуляции развернутых молекул могут быть исследованы отдельно при равновесии в присутствии большого избытка складчатые молекулы, где в усредненных по ансамблю свойствах преобладает складчатое состояние.Последовательный вывод во всех экспериментах по свободной диффузии заключается в том, что общий размер развернутого белка, полученный из определяемой эффективностью FRET 〈 R 2 〉, непрерывно увеличивается с увеличением концентрации денатуранта. Такое поведение, впервые однозначно продемонстрированное для Csp Tm [37], наблюдалось в ингибиторе химотрипсина 2 (CI2) [12,36], связывающем ацил-КоА белке (ACBP) [36], РНКазе H [32,39] , белок L [31,40], домен B белка A [41], белок иммунитета Im9 [42] и прион-определяющий домен Sup35 [47].Кузьменкина и др. . [32] смогли сопоставить свои данные для РНКазы HI с моделью, в которой развернутое состояние описывается континуумом подсостояний, в то время как Sherman et al . [40] использовали аналитическую полимерную модель для описания изменения размера как перехода клубок-глобула и интерпретировали результаты с точки зрения сольватационных свойств развернутой цепи.

    Средние значения эффективности FRET для развернутого белка L и Csp Tm идентичны при высокой концентрации денатуранта [31], что согласуется с выводами, полученными из измерений малого рассеяния рентгеновских лучей, что размер развернутых белков зависит только от длины полипептида. и не зависит от последовательности [48].Однако они различаются при более низкой концентрации денатуранта, когда также присутствует свернутое состояние, при этом белок L более компактен, возможно, из-за его более гидрофобной последовательности. Было бы крайне сложно надежно обнаружить такие различия в равновесных экспериментах МУРР, где вклад в наблюдаемое рассеяние вносят как свернутые, так и развернутые молекулы [49]. Однако эксперименты с одной молекулой белка L расходятся с экспериментами SAXS с временным разрешением Plaxco et al .[50], которые не обнаружили различий в R g между начальным денатурированным состоянием при 4 М GdmCl и денатурированным состоянием до сворачивания при 1 М GdmCl. Расхождение между ансамблевым SAXS и результатом FRET для одной молекулы еще предстоит объяснить [31], в частности, поскольку непрерывное увеличение количества белка L наблюдается при добавлении мочевины в моделировании молекулярной динамики в явной воде [31,51].

    Интересно, что приближение гауссовой цепи, которое объясняет обсуждавшееся выше затухание флуоресценции для белка L при концентрациях GdmCl, при которых он полностью денатурирован [31], также применимо при более низких концентрациях денатуранта как для белка L, так и для развернутых субпопуляций Csp Tm .Этот вопрос был рассмотрен более подробно для Csp Tm Хоффманном и др. . [38], которые исследовали варианты белка с метками красителя, расположенными так, что можно было исследовать разные сегменты цепи. Комбинированный анализ гистограмм эффективности FRET () и времени жизни флуоресценции для конкретных субпопуляций () дал хорошее согласие с распределением внутримолекулярных расстояний гауссовой цепи для всех вариантов, даже при низких концентрациях денатуранта, где цепь компактна.Это указывает на то, что любая остаточная структура может затрагивать только короткие сегменты и, вероятно, является высокодинамичной. Кинетические эксперименты по круговому дихроизму синхротронного излучения фактически свидетельствовали о наличии некоторой β-структуры в компактном развернутом состоянии [38], а кинетические ансамблевые FRET-эксперименты, исследующие короткий сегмент, образующий β-тяж в свернутом состоянии, указывают на локальное образование вытянутой структуры в компактном развернутом состоянии близкородственного белка холодового шока, Csp Bc [52].Однако есть и примеры отклонений от поведения цепи Гаусса. Маккарни и др. . [53] обнаружили небольшие, но, возможно, значительные сайт-специфические отклонения от поведения гауссовой цепи в экспериментах FRET с одной молекулой домена FynSh4, полностью развернутого в GdmCl и трифторэтаноле. Лоуренс и др. [36] использовали субпопуляционно-специфический анализ времени жизни флуоресценции для исследования структурных распределений при коллапсе CI2 и ACBP и сделали вывод о наличии временной остаточной структуры в развернутом состоянии.

    Эти исследования FRET одиночных молекул вместе с ансамблевыми исследованиями SAXS и ЯМР развернутых белков [54-56] позволяют предположить, что развернутые белки ведут себя по существу как гомополимеры при самой высокой концентрации денатуранта, о чем, в частности, свидетельствует открытие, что R g зависит от длины цепи и не зависит от последовательности [48]. Но разнообразие наблюдений за одиночной молекулой FRET, касающихся структуры коллапсированных развернутых белков, подчеркивает важность аминокислотной последовательности в условиях, способствующих сворачиванию.

    Динамика развернутой субпопуляции

    Динамика развернутой субпопуляции может быть исследована в различных временных режимах – от наносекундного временного масштаба времени жизни флуоресценции до миллисекундного временного масштаба времени пребывания в конфокальном объеме, а также для более длительного времени с иммобилизованные молекулы. Динамика в миллисекундном режиме часто оценивалась на основе анализа ширины развернутого пика эффективности FRET, а Гопич и Сабо провели всесторонний теоретический анализ различных вкладов в ширину в экспериментах по свободной диффузии [33,35].Как видно из их расчетов для гауссовой цепочки (), ширина очень чувствительна к соотношению между временем корреляции донорно-акцепторного расстояния и временем наблюдения, изменяясь от очень широкого распределения в пределе медленной динамики до δ- функции (при отсутствии дробового шума) в пределе быстрой динамики. Анализ ширины развернутой субпопуляции широко обсуждался [37, 57] после первых экспериментов Хохштрассера, Вайса и их коллег по сворачиванию одиночных молекул, в которых ширина, превышающая ширину, создаваемую дробовым шумом, была приписана медленная динамика развернутых молекул [10,12].Недавно Merchant et al. [31] показали, что избыточная ширина развернутых пиков белка L и Csp Tm не является инструментальным, оптическим или сигнальным артефактом, поскольку время жизни донора не является постоянным при оценке по фотонам, принадлежащим высокому и низкому сторона эффективности развернутых пиков FRET. Кроме того, было обнаружено, что ширина не зависит от времени наблюдения, что позволяет предположить, что структуры, ответственные за добавленную дисперсию, взаимопреобразовываются медленнее, чем размеры бина 1-2 мс.Однако они не смогли определить, отражает ли избыточная ширина различные R 0 из-за несовершенной очистки двух возможных пермутантов, внутренне медленной динамики белка или в результате медленной динамики взаимодействия белок-краситель.

    Распределение эффективности передачи P ( E | T ) Для гауссовской цепи с различными соотношениями времени наблюдения T и цепочка Reconfigure Time τ R , с T / τ R = 0 (темно-синий), 0.1 (голубой), 1 (зеленый), 5 (желтый) и 10 (красный) (при условии, что R 0 = 〈 r 2 〉), иллюстрирующие чувствительность распределения эффективности передачи к динамике цепи . Гопич и Сзабо [33] показали, что для гауссовской цепи и T >> τ R , ≈ 10 R ≈ 10 T Σ 2 , с σ2 = σobs2-σnoise2, где σobs2 — наблюдаемая дисперсия E , а σnoise2 — дисперсия из-за шума и других эффектов, не зависящих от межкрасочного расстояния.

    Понимание динамики развернутых полипептидных цепей в быстром временном режиме приобрело особую важность, поскольку обнаруживается, что все большее число белков сворачивается в микросекундном масштабе. В этом режиме барьер свободной энергии для сворачивания считается чрезвычайно низким или даже отсутствующим, а диффузионная цепная динамика становится доминирующим фактором в кинетике сворачивания [45]. Динамика в этом временном масштабе была изучена Неттлзом и др. . [58], которые проанализировали статистику фотонов одиночных молекул флуктуаций интенсивности донорных и акцепторных флуорофоров, которые являются результатом флуктуаций расстояния в развернутой субпопуляции Csp Tm .Основная идея их эксперимента заключается в следующем: если, например, донорный фотон испускается в момент времени τ = 0, то концы цепи в этот момент, вероятно, будут далеко друг от друга, что соответствует низкой скорости передачи энергии. Через очень короткое время концы все еще будут далеко друг от друга, и вероятность испускания еще одного донорного фотона все еще будет высока. Однако на временах, значительно превышающих время реконфигурации цепи, молекула будет терять «память» о своей исходной конфигурации, и вероятность эмиссии донора будет определяться средней эффективностью переноса.Таким образом, ожидается, что автокорреляция интенсивности излучения будет затухать примерно на временной шкале реконфигурации цепи (). Имея информацию о размерах развернутого состояния, доступную из предыдущих экспериментов [38], и используя модель, которая описывает цепную динамику как диффузионный процесс на одномерной поверхности свободной энергии [58-61], можно выделить очень быстрое время реконфигурации. Это время уменьшается примерно с 60 нс до 20 нс между 0 и 6 М GdmCl после поправки на вязкость растворителя.Таким образом, добавление денатуранта не только расширяет цепочку, но и снижает кратковременные внутримолекулярные взаимодействия, уменьшая вклад внутреннего трения в цепную диффузию. Корреляционная спектроскопия показывает, что на временах менее ~100 мкс в развернутом Csp Tm отсутствует дополнительная дальнодействующая динамика [62]. Более того, поскольку меченный красителем белок сворачивается за 12 мс в отсутствие денатуранта с экспоненциальным течением времени [37], требование быстрой динамики развернутого состояния по сравнению со временем фолдинга указывает на отсутствие более медленной динамики развернутого состояния.

    Результаты этого исследования уже получили три важных применения. Во-первых, это оправдывает аппроксимацию Merchant и др. . [31] и Хоффманн и др. . [38] показали, что развернутый Csp Tm является статическим в течение времени жизни флуоресценции донора 1-2 нс в их анализе распределения времени жизни развернутой субпопуляции с использованием различных моделей для сквозного распределения расстояний. Во-вторых, обнаружение увеличения коэффициента цепной диффузии с ростом денатуранта напрямую связано с аналитическими теоретическими моделями, в которых кинетика сворачивания белка описывается диффузией на низкоразмерной поверхности свободной энергии [63-65].Моделирование сворачивания с использованием упрощенного представления решетки белка показало, что коэффициент сквозной диффузии близко соответствует коэффициенту диффузии для движения вдоль координаты реакции сворачивания [63]. Это описание кинетики складывания Крамерса было использовано Cellmer et al . [66] для расчета скоростей релаксации в зависимости от денатуранта для небольшого сверхбыстро сворачивающегося белка – субдомена виллина. В результате расчетов был получен шевронный график зависимости скорости релаксации от концентрации денатуранта, хотя и с очень небольшим наклоном, в отличие от экспериментального результата скорости релаксации, не зависящей от денатуранта.Однако введение в расчет зависимости коэффициента диффузии, найденного для Csp Tm , от денатурации компенсировало увеличение высоты барьера для складывания, сглаживая шеврон, как это наблюдалось экспериментально.

    Третье приложение – оценка высоты свободного энергетического барьера , Δ G , разделяющего свернутое и развернутое состояния (в отличие от энтальпии активации , которая непосредственно получается из температурной зависимости сворачивания время).Предполагая равные коэффициенты диффузии и кривизну в денатурированной яме и на (перевернутой) вершине барьера для зависимости свободной энергии от координаты реакции, уравнение Крамерса для времени свертывания сводится к (Δ G / K B T ) [63], где k B — постоянная Больцмана, T — температура. С τ r = 60 нс в качестве времени реконфигурации, полученного Неттлзом и др. .[58] для развернутой субпопуляции в отсутствие денатуранта и τ f = 12 мс для времени фолдинга, измеренного для меченого красителем белка [37], расчетный барьер свободной энергии для фолдинга составляет 10 k Б Т [58]. Это следует рассматривать как верхний предел, поскольку ожидается, что коэффициент диффузии на вершине барьера будет ниже по мере того, как белок становится более компактным [58,66] (интересно, что предэкспоненциальный множитель >2π τ r , дает оценку ≳0.4 мкс для ограничения скорости для этого белка, что приближается к предсказанию ∼0,1 N мкс = 0,7 мкс, сделанному Kubelka et al. [45]). Высота свободного энергетического барьера была рассчитана теоретически для двух близкородственных белков холодового шока, которые сворачиваются примерно с одинаковой скоростью (CspB и CspA), с использованием крупнозернистых представлений как в аналитической модели, подобной Изингу [20, 67, 68], так и в в моделировании Ланжевена с представлением полипептида в виде шариков [68,69]. В моделировании отсутствует барьер свободной энергии в условиях складывания [69], в то время как изинговские модели [20, 67, 68] дают барьеры, сравнимые с оценками из экспериментов (т.g., 7−8 k B T , с учетом неупорядоченных петель [20]).

    Траектории сворачивания/разворачивания одиночных молекул

    Как указывалось во введении к этой статье, основная цель исследований одиночных молекул состоит в наблюдении за фактическими переходами между свернутым и развернутым состояниями. Первым требованием для таких экспериментов является получение траекторий белков, претерпевающих переходы сворачивания и разворачивания, как в . Из-за короткого времени пребывания в конфокальном объеме эксперименты до сих пор были сосредоточены на иммобилизации белка.Однако первые эксперименты Хохштрассера и его сотрудников [10, 11] показали, что техническая проблема при прикреплении белка к поверхности стекла состоит в том, чтобы избежать артефактов, возникающих в результате временного прилипания к поверхности. Роудс и др. . [70,71] решили эту проблему, инкапсулировав белок в липидные везикулы и прикрепив везикулы к поверхности. Они получили траектории сворачивания/разворачивания двух белков, аденилаткиназы и Csp Tm . Траектории для аденилаткиназы [70] показали широкое распределение размеров шагов и времени перехода, что указывает на большую степень сложности, которую трудно интерпретировать количественно, тогда как Csp Tm [71] показал траектории для отдельных молекул, близкие к ожидаемым. для белка с двумя состояниями (): быстрые скачки между высоким и низким состояниями FRET, соответствующие свернутому и развернутому состояниям молекулы, с распределением времени пребывания, ожидаемым от времени разворачивания и сворачивания ансамбля соответственно.Скачки между состояниями, которые соответствуют реальным событиям пересечения барьера свободной энергии, не могли быть разрешены и, по оценкам, происходили в течение <100 мкс. Оценки времени пересечения барьера [64] и предела скорости складывания из экспериментов [45, 58] показывают, что скачки между сложенным и развернутым состояниями должны происходить менее чем за микросекунду. Таким образом, одной из основных задач в этой области будет улучшение экспериментального временного разрешения.

    Иммобилизация белков путем их прикрепления к поверхности была пересмотрена Ниенхаусом и его коллегами.Кузьменкина и др. . [32,39] иммобилизовали РНКазу Н с помощью биотина и стрептавидина на поверхности сшитого полиэтилена («звездчатый ПЭГ») [72] и показали, что равновесие сворачивания/развертывания в зависимости от концентрации денатуранта является полностью обратимым и дает термодинамический эффект. параметры для иммобилизованного на поверхности белка в хорошем согласии с ансамблевыми экспериментами для немеченого белка. Однако, аналогично исследованиям аденилаткиназы Rhoades et al . [70], траектории флуоресценции оказались сложными и показали флуктуации в широком диапазоне эффективности FRET.Колебания с изменениями FRET>0,05 интерпретировались как изменения расстояния и с использованием процедуры, аналогичной Rhoades et al . [70], были классифицированы в соответствии с начальными и конечными значениями эффективности FRET как переходы сворачивания, переходы развертывания, переходы между свернутыми состояниями и переходы между развернутыми состояниями. Из среднего времени пребывания в свернутом и развернутом состояниях они получили коэффициенты скорости (0,01/с), очень близкие к найденным в ансамблевых экспериментах для немеченого белка.В то время как поляризационные эксперименты указывали на отсутствие ориентационного усреднения красителей в свернутом состоянии, что могло бы объяснить переходы между эффективностью свернутого состояния, для развернутых молекул не наблюдалось стационарной анизотропии, из чего авторы сделали вывод, что их медленная динамика (0,4 перехода /s) возникают из-за больших барьеров свободной энергии, вызванных вещественной структурой в денатурированном состоянии. Чтобы исследовать динамику развернутого состояния в более быстром временном масштабе, была рассчитана донорно-акцепторная взаимная корреляционная функция, которая выявила релаксацию 20 мкс.

    Интересный результат этого исследования заключается в том, что реконфигурация денатурированного белка, по-видимому, происходит в широком диапазоне временных масштабов, от микросекунд (или менее) до секунд, в отличие от результатов Csp Tm , в которых не было заявлено ни одного развернутого белка. динамика может быть выявлена ​​выше режима десятков наносекунд (см. выше) [58,62]. Хотя известно, что и РНКаза H [73], и аденилаткиназа [74] заселяют промежуточные продукты укладки, что может способствовать сложности, наблюдаемой в экспериментах с одиночными молекулами, существует интересная возможность того, что более грубый энергетический ландшафт, обнаруженный в траекториях одиночных молекул, способствует этому. к более медленной скорости фолдинга таких более крупных белков за счет замедления диффузии по координате реакции.

    Заключительные замечания

    Из предыдущего обсуждения должно быть ясно, что исследования FRET одной молекулы уже способствовали лучшему пониманию фолдинга белков, особенно структуры и динамики развернутого состояния. Чтобы достичь цели измерений FRET с временным разрешением, в то время как отдельная молекула складывается и разворачивается, потребуется преодолеть несколько технических проблем, включая повышение эффективности сбора за пределы ∼10% существующих инструментов, устранение фотодеструкции и уменьшение количества темных и триплетных частиц. состояний хромофоров, все из которых могут способствовать увеличению скорости испускаемых фотонов до предела времени жизни обратной флуоресценции (несколько наносекунд).Кроме того, скорее всего, потребуются альтернативные методы иммобилизации. Многообещающий метод, не требующий прикрепления к поверхности или шарику, недавно был разработан Коэном и Мёрнером [75], которые быстро изменяют направление электрического поля в микрофлюидной ячейке, чтобы предотвратить диффузию молекулы за пределы конфокальной области. объем. В качестве способа избежать поверхностной иммобилизации было также предложено визуализировать одиночные молекулы, когда они стекают по капилляру [76].

    Другим важным достижением будет одновременное измерение нескольких расстояний путем прикрепления нескольких донорных и акцепторных хромофоров.Осуществимость этого подхода была продемонстрирована для ДНК [77-79], и его можно также применить к белкам, несмотря на более сложную химию мечения [80]. Одновременное измерение даже нескольких расстояний с временным разрешением наложило бы значительные ограничения на эволюцию естественной складки и обеспечило бы критические проверки теоретических моделей и симуляций. Анализ корреляции между этими расстояниями также может напрямую дать информацию о широте распределения микроскопических путей [81].Наконец, существует вероятность того, что одиночная молекула FRET может быть использована для исследования механизмов сворачивания белков в более сложных условиях. Наиболее очевидным применением является влияние клеточных факторов, начиная от рибосом и молекулярных шаперонов [82,83] и заканчивая транслокацией белков и фолдингом мембранных белков, разворачиванием и деградацией белков протеазами или неправильным фолдингом и агрегацией белков [84]. Для большинства этих процессов механизмы молекулярного механизма были в центре внимания исследования, но мало что известно об их влиянии на структуру белка или динамику и механизм сворачивания.

    Резонансный перенос энергии Фёрстера

    Благодарность

    Наши исследования FRET одиночной молекулы получили огромную пользу от теоретической работы Ирины Гопич и Аттилы Сабо. Мы также хотели бы поблагодарить их за сотрудничество и множество полезных дискуссий с тех пор, как мы инициировали наше исследование в этой области, а также за комментарии к этой рукописи. BS поддерживается Schweizerische Nationalfonds, Национальным центром компетенций в области исследований в области структурной биологии, Human Frontier Science Program, VolkswagenStiftung и Deutsche Forschungsgemeinschaft.WAE поддерживается Программой внутренних исследований NIDDK, Национальных институтов здравоохранения.

    Сноски

    Отказ от ответственности издателя: Это PDF-файл неотредактированной рукописи, которая была принята к публикации. В качестве услуги нашим клиентам мы предоставляем эту раннюю версию рукописи. Рукопись будет подвергнута редактированию, набору текста и рецензированию полученного доказательства, прежде чем она будет опубликована в ее окончательной цитируемой форме. Обратите внимание, что в процессе производства могут быть обнаружены ошибки, которые могут повлиять на содержание, и все правовые оговорки, применимые к журналу, относятся к нему.

    1 (включая рисунок): Фёрстер [21] показал, что скорость передачи энергии возбуждения k ET между донорными и акцепторными хромофорами обратно пропорциональна 6 th степени расстояния Разделяя их, k et = K D ( R 0 / R ) 6 , где K D -1 — это время жизни донора в отсутствие акцептора, R — расстояние между донором и акцептором и R 0 — константа пропорциональности, зависящая от переходного диполь-дипольного взаимодействия между донором и акцептором.Вероятность того, что фотон, поглощенный донором, приведет к передаче энергии возбуждения акцептору, называемая эффективностью FRET, E , равна ), что определяется экспериментально либо путем подсчета количества испущенных донорных и акцепторных фотонов, E = n A /( n A + n D

    0/ 1 + ( R / R 0 ) 6 ) или путем измерения времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора: ).Прелесть теории Фёрстера в том, что R 0 можно получить непосредственно, без каких-либо теоретических расчетов, из легко измеряемых спектроскопических величин — квантового выхода донора и спектра флуоресценции, спектра поглощения акцептора и показателя преломления среды между их. За дополнительными экспериментальными и теоретическими концепциями, связанными с методом, читатель отсылается к ряду подробных обзоров.

    Ссылки

    1. Fisher TE, Oberhauser AF, Carrion-Vazquez M, Marszalek PE, Fernandez JM.Изучение механики белков с помощью атомно-силового микроскопа. Тенденции биохимических наук. 1999; 24: 379–384. [PubMed] [Google Scholar]2. Zhuang X, Rief M. Сворачивание одиночных молекул. Curr Opin Struct Biol. 2003; 13:88–97. [PubMed] [Google Scholar]3. Бустаманте С., Чемла Ю.Р., Форде Н.Р., Ижаки Д. Механические процессы в биохимии. Анну Рев Биохим. 2004; 73: 705–748. [PubMed] [Google Scholar]4. Форман Дж. Р., Кларк Дж. Механическое разворачивание белков: понимание биологии, структуры и складывания. Curr Opin Struct Biol.2007; 17:58–66. [PubMed] [Google Scholar]5. Хаммер Г., Сабо А. Поверхности свободной энергии из силовой спектроскопии одиночных молекул. Счета химических рез. 2005; 38: 504–513. [PubMed] [Google Scholar]6. Харан Г. Флуоресцентная спектроскопия биомолекулярной укладки одиночных молекул. J Phys-Конденсирует Материю. 2003; 15: Р1291–Р1317. [Google Академия]7. Шулер Б. Флуоресцентная спектроскопия фолдинга белков одиночных молекул. Химфиз. 2005; 6: 1206–1220. [PubMed] [Google Scholar]8. Michalet X, Weiss S, Jäger M. Флуоресцентные исследования одиночной молекулы фолдинга белка и конформационной динамики.Chem Rev. 2006; 106:1785–1813. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]9. Ха Т., Эндерле Т., Оглтри Д. Ф., Чемла Д. С., Селвин П. Р., Вайс С. Исследование взаимодействия между двумя отдельными молекулами: резонансная передача энергии флуоресценции между одним донором и одним акцептором. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 6264–6268. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]10. Jia YW, Talaga DS, Lau WL, Lu HSM, DeGrado WF, Hochstrasser RM. Динамика складывания одиночных пептидов GCN4 с помощью флуоресцентной резонансной конфокальной микроскопии с переносом энергии.хим. физ. 1999; 247:69–83. [Google Академия] 11. Talaga DS, Lau WL, Roder H, Tang J, Jia Y, DeGrado WF, Hochstrasser RM. Динамика и укладка одиночных двухцепочечных спиральных пептидов изучены с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии с переносом энергии. Proc Natl Acad Sci USA. 2000;97:13021–13026. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]12. Дениз А.А., Лоуренс Т.А., Белижер Г.С., Дахан М., Мартин А.Б., Чемла Д.С., Доусон П.Е., Шульц П.Г., Вайс С. Сворачивание одиночных молекул белка: исследования переноса энергии резонансной флуоресценции диффузии денатурации ингибитора химотрипсина 2.Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97: 5179–5184. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]13. Neuweiler H, Sauer M. Использование фотоиндуцированных реакций переноса заряда для изучения конформационной динамики биополимеров на уровне одной молекулы. Карр Фарм Биотехнолог. 2004; 5: 285–298. [PubMed] [Google Scholar] 14. Фриден С., Чаттопадьяй К., Элсон Э.Л. Adv Protein Chem. Том. 62. 2002. Что может сказать нам флуоресцентная корреляционная спектроскопия о развернутых белках. стр. 91–109. Достижения в области химии белков. [PubMed] [Google Scholar] 15.Сноу КД, Сорин Э.Дж., Ри Ю.М., Панде В.С. Насколько хорошо моделирование может предсказывать кинетику и термодинамику сворачивания белка? Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2005; 34:43–69. [PubMed] [Google Scholar] 16. Леви Ю., Онучич Дж. Н. Механизмы сборки белков: уроки минималистских моделей. Acc Chem Res. 2006; 39: 135–142. [PubMed] [Google Scholar] 17. Фершт АР. Структура и механизм в науке о белках. В.Х. Фриман и компания; Нью-Йорк: 1998. [Google Scholar]18. Оливберг М., Волинс П.Г. Экспериментальное исследование белково-складывающих энергетических ландшафтов.Q Rev Biophys. 2005; 38: 245–288. [PubMed] [Google Scholar] 19. Фершт А.Р., Даггетт В. Сворачивание и разворачивание белков с атомарным разрешением. Клетка. 2002; 108: 573–582. [PubMed] [Google Scholar] 20. Генри Э.Р., Итон В.А. Комбинаторное моделирование кинетики сворачивания белков: профили и скорости свободной энергии. Химическая физика. 2004; 307: 163–185. [Google Академия] 21. Förster T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Аннален дер Physik. 1948; 6: 55–75. [Google Академия] 22. Шулер Б., Липман Э.А., Штайнбах П.Дж., Кумке М., Итон В.А.Полипролин и «спектроскопическая линейка» в свете флуоресценции одиночной молекулы. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102: 2754–2759. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]24. Уоткинс Л.П., Чанг Х.И., Ян Х. Количественные конформационные распределения одиночных молекул: тематическое исследование с поли-(L-пролином). J Phys Chem A. 2006;110:5191–5203. [PubMed] [Google Scholar] 25. Doose S, Neuweiler H, Barsch H, Sauer M. Изучение структуры и динамики полипролина с помощью фотоиндуцированного переноса электронов свидетельствует об отклонениях от правильной спирали полипролина типа II.Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104:17400–17405. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]26. Бест Р., Мерчант К., Гопич И.В., Шулер Б., Бакс А., Итон В.А. Влияние гибкости и цис-остатков в исследованиях FRET одной молекулы полипролина. Proc Natl Acad Sci USA. в прессе. Комбинация измерений интенсивности отдельных молекул и времени жизни субпопуляций, ЯМР и моделирования молекулярной динамики полипролина, включая красители и их линкеры к полипептиду, показывает, что перегибы, возникающие из-за внутренних цис-пролинов, в первую очередь ответственны за среднюю эффективность FRET выше. чем предсказано для полностью транс-полипролина с жесткими стержнями.Теоретический анализ также показывает, что ширина, превышающая дробовой шум, в наблюдаемых гистограммах эффективности и распределениях времени жизни донорной флуоресценции объясняется наличием нескольких видов с эффективностью, согласующейся с моделированием и популяциями с помощью ЯМР.* [Google Scholar]27. Нир Э., Мишалет X, Хамадани К.М., Лоуренс Т.А., Нойхаузер Д., Ковчегов Ю., Вайс С. Гистограммы FRET одной молекулы с ограничением дробового шума: сравнение теории и экспериментов. J Phys Chem B. 2006;110:22103–22124.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]28. Антоник М, Фелекян С, Гайдук А, Зайдель САМ. Отделение структурных неоднородностей от стохастических вариаций в распределении передачи энергии флуоресцентного резонанса с помощью анализа распределения фотонов. J Phys Chem B. 2006;110:6970–6978. [PubMed] [Google Scholar] 29. Капанидис А.Н., Ли Н.К., Лоуренс Т.А., Дуз С., Маргит Э., Вайс С. Сортировка молекул с помощью флуоресценции: анализ структуры и взаимодействий путем возбуждения одиночных молекул переменным лазером.Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101:8936–8941. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]30. Lee NK, Kapanidis AN, Wang Y, Michalet X, Mukhopadhyay J, Ebright RH, Weiss S. Точные измерения FRET в отдельных диффундирующих биомолекулах с использованием переменного лазерного возбуждения. Биофиз Дж. 2005; 88: 2939–2953. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]31. Торговец К.А., Бест Р.Б., Луи Дж.М., Гопич И.В., Итон В.А. Характеристика развернутых состояний белков с использованием спектроскопии FRET одиночных молекул и молекулярного моделирования.Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104:1528–1533. Развернутые субпопуляции белка L и CspTm сравнивают в диапазоне концентраций денатуранта по эффективности FRET, определенной из измерений как интенсивности, так и продолжительности жизни. Интерпретация основана на моделировании Ланжевена упрощенного представления полипептида, которое также предполагает, что коллапс может быть результатом либо увеличения притяжения между остатками, либо уменьшения исключенного объема. * [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]32.Кузьменкина Е.В., Хейес К.Д., Ниенхаус Г.Ю. Одномолекулярное исследование FRET индуцированного денатурантом разворачивания РНКазы H. J Mol Biol. 2006; 357: 313–324. [PubMed] [Google Scholar] 33. Гопич И.В., Сабо А. Резонансный перенос энергии флуоресценции одиночной макромолекулы и профили свободной энергии. J Phys Chem B. 2003;107:5058–5063. [Google Академия] 34. Гопич И.В., Сабо А. Теория фотонной статистики в одномолекулярном резонансном переносе энергии Фёрстера. J Chem Phys. 2005; 122:1–18. [PubMed] [Google Scholar] 35. Гопич И.В., Сабо А.Одномолекулярный FRET с диффузионной и конформационной динамикой. J Phys Chem B. 2007;111:12925–12932. Представлена ​​всесторонняя теория для анализа измерений FRET одной молекулы на свободно диффундирующих и иммобилизованных молекулах, включая вклад различных процессов в распределение и дисперсию эффективности FRET.** [PubMed] [Google Scholar]36. Лоуренс Т.А., Конг XX, Джагер М., Вайс С. Исследование структурных неоднородностей и колебаний нуклеиновых кислот и денатурированных белков.Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102:17348–17353. Эта работа содержит первое использование субпопуляционно-специфического анализа времени жизни флуоресценции для исследования распределения расстояний в развернутых белках и делает вывод о наличии переходной структуры развернутого состояния в CI2 и ACBP. * [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]37 . Шулер Б., Липман Э.А., Итон В.А. Исследование поверхности свободной энергии для сворачивания белков с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул. Природа. 2002; 419: 743–747. [PubMed] [Google Scholar] 38.Хоффманн А., Кейн А., Неттелс Д., Герцог Д.Е., Баумгартель П., Ленгефельд Дж., Райхардт Г., Хорсли Д.А., Секлер Р., Бакаджин О., Шулер Б. Картирование коллапса белка с помощью спектроскопии кругового дихроизма флуоресценции одной молекулы и кинетического синхротронного излучения. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104:105–110. Путем изменения положения донора и акцептора в цепи исследуются различные сегменты развернутого CspTm, что указывает на изотропный коллапс и хорошее соответствие с поведением гауссовой цепи даже в коллапсированном развернутом состоянии.Синхротронная спектроскопия кругового дихроизма показывает образование некоторой бета-структуры, сопровождающей коллапс.* [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]39. Кузьменкина Е.В., Хейес К.Д., Ниенхаус Г.Ю. Одномолекулярное исследование переноса энергии резонанса Форстера динамики белка в денатурирующих условиях. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102:15471–15476. Траектории сворачивания/развертывания получаются из измерений эффективности FRET иммобилизованной на поверхности РНКазы Н и предполагают динамику развернутого состояния во временных масштабах от микросекунд до секунд.* [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]40. Шерман Э., Харан Г. Переход клубок-глобула в денатурированном состоянии небольшого белка. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103:11539–11543. Средняя эффективность FRET и гидродинамический радиус от FCS указывают на коллапс субпопуляции развернутого белка L при снижении концентрации денатуранта. Коллапс анализируется с точки зрения перехода клубок-глобула для получения информации о сольватационных свойствах развернутого состояния.* [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]41.Хуанг Ф., Сато С., Шарп Т.Д., Ин Л.М., Фершт А.Р. Различие между кооперативным и унимодальным нисходящим фолдингом белков. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104: 123–127. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]42. Тэдзука-Каваками Т., Гелл С., Брокуэлл Д.Дж., Рэдфорд С.Е., Смит Д.А. Индуцированное мочевиной разворачивание иммунного белка Im9, контролируемое с помощью spFRET. Биофиз Дж. 2006; 91: L42–L44. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]43. Липман Э.А., Шулер Б., Бакаджин О., Итон В.А. Одномолекулярное измерение кинетики сворачивания белка.Наука. 2003; 301:1233–1235. [PubMed] [Google Scholar]44. Муньос В. Конформационная динамика и ансамбли в фолдинге белков. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2007; 36: 395–412. [PubMed] [Google Scholar]45. Кубелка Дж., Хофрихтер Дж., Итон В.А. «Ограничение скорости» свертывания белка. Curr Opin Struct Biol. 2004; 14:76–88. [PubMed] [Google Scholar]46. Брюнгельсон Д.Д., Онучич Д.Н., Соччи Н.Д., Волинс П.Г. Воронки, пути и энергетический ландшафт сворачивания белков: синтез. Белки. 1995; 21: 167–195. [PubMed] [Google Scholar]47.Мухопадхьяй С., Кришнан Р., Лемке Э.А., Линдквист С., Дениз А.А. Естественно развернутый мономер дрожжевого приона принимает ансамбль коллапсированных и быстро флуктуирующих структур. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104: 2649–2654. Показано, что определяющий прион NM-домен дрожжевого прионного белка Sup35 подвергается непрерывной экспансии, а не кооперативному переходу разворачивания при добавлении денатуранта. Колебания интенсивности флуоресценции в субмикросекундном диапазоне связывают с цепной динамикой, приводящей к быстрому внутримолекулярному тушению тирозином.* [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]48. Кон Дж. Э., Миллет И. С., Джейкоб Дж., Загрович Б., Диллон Т. М., Сингель Н., Дотагер Р. С., Зайферт С., Тиягараджан П., Сосник Т. Р. и соавт. Поведение случайной спирали и размеры химически развернутых белков. Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101:12491–12496. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]49. Просо И.С., Таунсли Л.Е., Чити Ф., Дониач С., Пласко К.В. Нарушение равновесия и кинетическая «складываемость» белков. Биохимия. 2002; 41: 321–325. [PubMed] [Google Scholar]50.Plaxco KW, Millett IS, Segel DJ, Doniach S, Baker D. Коллапс цепи может происходить одновременно с лимитирующей стадией фолдинга белка. Nat Struct Biol. 1999; 6: 554–556. [PubMed] [Google Scholar]51. Беннион Б.Дж., Даггетт В. Молекулярная основа химической денатурации белков мочевиной. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100:5142–5147. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]52. Мэгг С., Кубелка Дж., Холтерманн Г., Хаас Э., Шмид Ф.Х. Специфика начального коллапса при сворачивании белка холодового шока.Дж Мол Биол. 2006; 360:1067–1080. [PubMed] [Google Scholar]53. Маккарни Э.Р., Вернер Дж.Х., Бернштейн С.Л., Ручинский И., Макаров Д.Е., Гудвин П.М., Пласко К.В. Сайт-специфические размеры сильно денатурированного белка; исследование одной молекулы. Дж Мол Биол. 2005; 352: 672–682. [PubMed] [Google Scholar]54. Дайсон Х.Дж., Райт ЧП. Взгляд на структуру и динамику развернутых белков с помощью ядерного магнитного резонанса. Adv Protein Chem. 2002; 62: 311–340. [PubMed] [Google Scholar]55. Миллет И.С., Дониач С., Пласко К.В.На пути к таксономии денатурированного состояния: исследования рассеяния под малым углом развернутых белков. Adv Protein Chem. 2002; 62: 241–262. [PubMed] [Google Scholar]56. Ши З., Вуди Р.В., Калленбах Н.Р. Является ли полипролин II основной конформацией остова в развернутых белках? Adv Protein Chem. 2002; 62: 163–240. [PubMed] [Google Scholar]57. Дениз А.А., Лоуренс Т.А., Дахан М., Чемла Д.С., Шульц П.Г., Вайс С. Ратиометрические исследования одиночных молекул свободно диффундирующих биомолекул. Annu Rev Phys Chem. 2001; 52: 233–253. [PubMed] [Google Scholar]58.Неттелс Д., Гопич И.В., Хоффманн А., Шулер Б. Сверхбыстрая динамика коллапса белка на основе статистики фотонов одной молекулы. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104: 2655–2660. Динамика реконфигурации глобальной цепи в масштабе времени 50 нс измеряется для развернутого CspTm в экспериментах по корреляции для конкретных субпопуляций. Динамика замедляется в более компактном денатурированном состоянии при низкой денатурации из-за повышенного внутреннего трения. Это открытие может объяснить плоский шеврон, наблюдаемый для сверхбыстро сворачивающегося белка [66], и повышает возможность родственных эффектов на кинетику сворачивания других белков.** [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]59. Ван ЗС, Макаров ДЭ. Наносекундная динамика одиночных полипептидных молекул, выявленная с помощью фотоэмиссионной статистики резонансного переноса энергии флуоресценции: теоретическое исследование. J Phys Chem B. 2003;107:5617–5622. [Google Академия] 60. Гопич И.В., Сабо А. Теория статистики кинетических переходов в приложении к одномолекулярному ферментативному катализу. J Chem Phys. 2006;124:154712. [PubMed] [Google Scholar]61. Сабо А., Шультен К., Шультен З. Подход первого времени прохождения к реакциям, контролируемым диффузией.J Chem Phys. 1980; 72: 4350–4357. [Google Академия] 62. Неттелс Д., Хоффманн А., Шулер Б. Динамика развернутых белков и пептидов, исследованная с помощью корреляционной спектроскопии, от пикосекунд до секунд. J Phys Chem B. (представлено) [PubMed] [Google Scholar]63. Socci ND, Onuchic JN, Wolynes PG. Диффузионная динамика координаты реакции для воронок сворачивания белков. J Chem Phys. 1996; 104: 5860–5868. [Google Академия]64. Бест Р.Б., Хаммер Г. Диффузионная модель динамики сворачивания белка с оборотом Крамерса в скорости.Phys Rev Lett. 2006; 96 [PubMed] [Google Scholar] 65. Chahine J, Oliveira RJ, Leite VBP, Wang J. Диффузия, зависящая от конфигурации, может изменить кинетическое переходное состояние и высоту барьера сворачивания белка. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104:14646–14651. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]66. Селлмер Т., Генри Э.Р., Кубелка Дж., Хофрихтер Дж., Итон В.А. Скорость релаксации сверхбыстро сворачивающегося белка не зависит от концентрации химического денатуранта. J Am Chem Soc. в прессе. [PubMed] [Google Scholar]67.Муньос В., Итон В.А. Простая модель для расчета кинетики сворачивания белков из трехмерных структур. Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96:11311–11316. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]68. Караниколас Дж., Брукс CL. Важность явного представления цепи в моделях сворачивания белков: исследование моделей, подобных Изингу. Белки. 2003; 53: 740–747. [PubMed] [Google Scholar]69. Ши JE, Брукс CL. От теорий сворачивания к сворачиванию белков: обзор и оценка исследований моделирования сворачивания и разворачивания белков.Annu Rev Phys Chem. 2001; 52: 499–535. [PubMed] [Google Scholar]71. Роудс Э., Коэн М., Шулер Б., Харан Г. Складывание в двух состояниях, наблюдаемое в отдельных белковых молекулах. J Am Chem Soc. 2004; 126:14686–14687. [PubMed] [Google Scholar]72. Groll J, Amirgoulova EV, Ameringer T, Heyes CD, Rocker C, Nienhaus GU, Moller M. Биофункционализированные ультратонкие покрытия из сшитого звездообразного поли(этиленоксида) обеспечивают обратимую укладку иммобилизованных белков. J Am Chem Soc. 2004; 126:4234–4239. [PubMed] [Google Scholar]73.Raschke TM, Marqusee S. Промежуточный продукт кинетического сворачивания рибонуклеазы H напоминает расплавленную кислотой глобулу и частично развернутые молекулы, обнаруженные в нативных условиях. Nat Struct Biol. 1997; 4: 298–304. [опубликованная опечатка появляется в Nat. Структура биол. 1997 июнь;4(6):505]. [PubMed] [Google Scholar]74. Руан К., Руан К., Бальный К., Глейзер М., Мантулин В.В. Пути сворачивания белка аденилаткиназы из E. coli: исследования гидростатического давления и остановки потока. Биохимия. 2001;40:14706–14714. [PubMed] [Google Scholar]75.Коэн А.Е., Мёрнер В.Е. Подавление броуновского движения отдельных биомолекул в растворе. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103:4362–4365. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]76. Киношита М., Камагата К., Маэда А., Гото Ю., Комацудзаки Т., Такахаши С. Разработка метода исследования динамики сворачивания отдельных белков в течение длительных периодов времени. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104:10453–10458. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]78. Кламм Дж. П., Дениз А. А. Трехцветная одномолекулярная резонансная передача энергии флуоресценции.ХимФизХим. 2005; 6: 74–77. [PubMed] [Google Scholar]79. Ли Н.К., Капанидис А.Н., Кох Х.Р., Корланн Ю., Хо С.О., Ким Ю., Гассман Н., Ким С.К., Вайс С. Трехцветное возбуждение одиночных молекул переменным лазером: мониторинг множественных взаимодействий и расстояний. Биофиз Дж. 2007; 92: 303–312. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]80. Капанидис А.Н., Вайс С. Флуоресцентные зонды и химические реакции биоконъюгации для одномолекулярного флуоресцентного анализа биомолекул. J Chem Phys. 2002; 117:10953–10964. [Google Академия]81.Онучич Дж. Н., Ван Дж., Волинс П.Г. Анализ траекторий одиночных молекул на сложных энергетических ландшафтах с использованием функций корреляции реплик. Химическая физика. 1999; 247: 175–184. [Google Академия]82. Уэно Т., Тагучи Х., Тадакума Х., Йошида М., Фунацу Т. GroEL опосредует сворачивание белка с помощью двух последовательных таймеров. Мол Ячейка. 2004; 14: 423–434. [PubMed] [Google Scholar]83. Ямасаки Р., Хосино М., Вадзава Т., Исии Й., Янагида Т., Кавата Й., Хигураши Т., Сакаи К., Нагаи Дж., Гото Й. Одно молекулярное наблюдение за взаимодействием GroEL с белками-субстратами.Дж Мол Биол. 1999; 292:965–972. [PubMed] [Google Scholar]85. Валь М., Коберлинг Ф., Паттинг М., Ран Х., Эрдманн Р. Система конфокальной флуоресцентной визуализации и спектроскопии с временным разрешением с чувствительностью к одной молекуле и субмикрометровым разрешением. Карр Фарм Биотехнолог. 2004; 5: 299–308. [PubMed] [Google Scholar]

    Зависимая от ориентации система FRET выявляет различия в структуре и гибкости дуплексов ДНК с разрывами и разрывами | Исследование нуклеиновых кислот

    Аннотация

    Различия в структуре и гибкости дуплексов ДНК играют важную роль в распознавании ДНК-связывающими белками.Здесь мы описываем новый метод структурного анализа дуплексов ДНК с использованием ориентационной зависимости резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET). Сначала мы проанализировали канонический дуплекс B-формы, и были получены правильные структурные параметры. Экспериментальные значения эффективности FRET прекрасно согласуются со значениями, теоретически рассчитанными с использованием определенных параметров. Затем мы исследовали дуплексы ДНК с разрывами и разрывами, которые являются ключевыми промежуточными продуктами в системах репарации ДНК. Было успешно выявлено влияние размера зазора на структуры и гибкость.Поскольку наш метод прост и чувствителен, его можно широко использовать для анализа структур ДНК, содержащих повреждения и неприродные молекулы.

    ВВЕДЕНИЕ

    Структурные аномалии в двойных спиральных структурах ДНК играют важную роль в биологических процессах, позволяя, например, ферментам репарации ДНК находить поврежденные участки среди огромного числа неповрежденных пар оснований. Недавние исследования показали, что ДНК-связывающие белки могут распознавать различия в структуре и гибкости дуплексов ДНК (1,2).Рентгеновская кристаллография и ядерно-магнитный резонанс (ЯМР) являются мощными инструментами для анализа структур ДНК, но эти методы требуют большого количества образцов и отнимают много времени. Кроме того, выявленные в рентгеновских лучах кристаллические структуры могут не отражать структуры, обнаруженные в биологической среде. Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) является универсальным инструментом для структурного анализа нуклеиновых кислот, поскольку его эффективность чувствительно зависит от относительного расстояния и ориентации между донором и акцептором (3–13).В большинстве исследований ДНК, основанных на FRET, была проанализирована только зависимость от расстояния, поскольку ориентацию красителя трудно контролировать, хотя нескольким группам удалось наблюдать зависимость от ориентации с помощью ДНК-скаффолдов (14–18). Ранее мы сообщали о новой системе FRET, в которой донор и акцептор встраиваются в ДНК через линкеры d-треонинола (19). Используя каркас d-треонинола, различные красители были включены в ДНК в фиксированных ориентациях (20). Наблюдаемая эффективность FRET показала зависимость от ориентации, которая согласовывалась с теоретическими значениями, рассчитанными на основе зарегистрированных параметров для дуплекса B-формы, хотя разница все еще оставалась из-за изгиба, вызванного последовательностями A-тракта.Здесь мы применили эту систему FRET для анализа двойных спиральных структур ДНК. В отличие от предыдущего исследования, мы определили структурные параметры различных структур ДНК на основе экспериментально определенной эффективности FRET. Сначала мы проанализировали каноническую двойную спираль B-формы с помощью зависимого от ориентации FRET, а затем оценили дуплексы ДНК с разрывами и разрывами, которые являются ключевыми промежуточными продуктами в системах репарации ДНК (21,22). С помощью ориентационно-зависимого FRET были выявлены не только структуры, но и гибкость ДНК в растворе.Насколько нам известно, различия между структурами и гибкостью дуплексов с зазорами/разрывами выявлены впервые.

    Последовательности олигонуклеотидов, использованных в этом исследовании, показаны на рисунке 1. Пирен и перилен были включены в ДНК через d-треонинол в качестве донора и акцептора соответственно. Было трудно контролировать ориентацию красителя, потому что красители обычно вводили в концевые или внеспиральные положения ДНК. Напротив, молекулы могут интеркалировать между парами оснований, когда они вводятся в средние положения ДНК через d-треонинол (23).Следовательно, их ориентацию можно строго контролировать посредством стэкинг-взаимодействия с соседними парами оснований. В противоположные положения красителей не вводились абазические сайты, поскольку нами установлено, что дополнительное включение красителей не приводит к искажению структуры ДНК. Мы варьировали количество пар оснований между донором пирена и акцептором перилена и измеряли эффективность FRET. Затем график FRET зависимости эффективности от количества пар оснований согласовывали со структурными параметрами, полученными на основе цилиндрической модели дуплекса B-формы.У нашего метода есть несколько преимуществ; (i) подробные структурные параметры в растворе можно легко получить, используя не только зависимость от расстояния, но и зависимость от ориентации FRET. (ii) Поскольку ориентация строго контролируется в нашей системе FRET, экспериментальные значения эффективности FRET показали превосходное соответствие с теоретически рассчитанными значениями ( см. ниже ). Следовательно, даже изгиб и гибкость дуплекса ДНК можно оценить, отслеживая отклонения от модели цилиндра.(iii) В нашем методе можно использовать пары красителей с относительно большим радиусом Ферстера, чтобы можно было анализировать большие структуры ДНК.

    Рисунок 1.

    ( A ) Химические структуры донора и акцептора. ( B ) Последовательности олигонуклеотидов, использованные в этом исследовании. Также показаны схематические иллюстрации канонических дуплексов и дуплексов с надрезами/зазорами.

    Рисунок 1.

    ( A ) Химические структуры донора и акцептора. ( B ) Последовательности олигонуклеотидов, использованные в этом исследовании.Также показаны схематические иллюстрации канонических дуплексов и дуплексов с надрезами/зазорами.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Олигонуклеотиды

    Все стандартные фосфорамидитные мономеры, колонки с контролируемым пористым стеклом (CPG), реагенты для синтеза ДНК и картриджи Poly-Pak II были приобретены у Glen Research. Другие реагенты для синтеза фосфорамидитных мономеров были закуплены у компаний Tokyo Chemical Industry, Wako и Aldrich. Нативные олигодезоксирибонуклеотиды (ODN) были приобретены у Integrated DNA Technologies.

    ODN, конъюгированные с красителем, были синтезированы на автоматическом синтезаторе ДНК (H-8-SE, Gene World), как мы сообщали ранее (24, 25). ОДН очищали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой и характеризовали с помощью MALDI-TOF MS (Autoflex II, Bruker Daltonics) и ВЭЖХ.

    Данные MALDI-TOFMS для модифицированной ДНК были следующими: RnP1: Obsd. 10220 (рассчитано для [RnP1+H + ]: 10220). RnP2: Obsd. 10219 (Рассчитано для [RnP2+H+]: 10220). RnP3: Obsd. 10220 (рассчитано для [RnP3 +H + ]: 10220).RnP4: Obsd. 10220 (Рассчитано для [RnP4 +H + ]: 10220). cRnE1: Obsd. 10257 (Рассчитано для [cRnE1+H +]: 10257). cRnE2: Obsd. 10257 (Рассчитано для [cRnE2 + H + ]: 10257). cRnE3: Obsd. 10257 (Рассчитано для [cRnE3 + H + ]: 10257). cRnE4: Obsd. 10257 (Рассчитано для [cRnE4 + H + ]: 10257). AtP1: ​​Obsd. 10297 (Рассчитано для [AtP1+H + ]: 10300). AtP2: Obsd. 10300 (рассчитано для [AtP2 + H + ]: 10300). AtP3: Obsd. 10298 (Рассчитано для [AtP3 + H + ]: 10300).AtP4: Obsd. 10299 (рассчитано для [AtP4 +H + ]: 10300). AtP5: Obsd. 10300 (рассчитано для [AtP5 +H + ]: 10300). CATE1: Obsd. 10168 (Рассчитано для [cAtE1+H+]: 10170). CATE2: Obsd. 10169 (Рассчитано для [cAtE2 + H + ]: 10170). CATE3: Obsd. 10169 (Рассчитано для [cAtE3+H+]: 10170). cRnE1s: Obsd. 3184 (рассчитано для [cRnE1s + H + ]: 3184). cRnE2s: Obsd. 3487 (рассчитано для [cRnE2s + H + ]: 3488). cRnE3s: Obsd. 3816 (Расчет для [cRnE3s + H + ]: 3817).cRnE4s: Obsd. 4130 (рассчитано для [cRnE4s + H + ]: 4130).

    Спектроскопические измерения

    Спектры флуоресценции были измерены на моделях JASCO FP-6500 и FP-8500. Длина волны возбуждения составляла 345 нм. Ширина полосы составляет 3 нм (FP-6500) или 2,5 нм (FP-8500) для возбуждения и излучения. Перед измерением растворы образцов, содержащие дуплекс ДНК, нагревали до 80°С, затем медленно охлаждали до 20 или 0°С со скоростью 2,5°С мин -1 . Растворы образцов содержали 100 мМ NaCl, 10 мМ фосфатного буфера, рН 7.0 и 0,2 мкМ донорной нити (RnP1-4 или AtP1-5) и 0,4 мкМ акцепторной нити (cRnE1-4 или cAtE1-3). Для анализа дуплексов с разрывами и разрывами использовали 0,2 мкМ донорной цепи (RnP1-4), 0,4 мкМ акцепторной цепи (cRnE1s-4s) и 0,6 мкМ Nt23-17.

    Измерение температуры плавления

    Кривые плавления были измерены с помощью UV-1800 (Shimadzu) путем контроля поглощения при 260 нм в зависимости от температуры. Для дуплекса с надрезом или зазором кривую плавления получали с помощью модели JASCO FP-6500 путем измерения интенсивности излучения при 500 нм при возбуждении на 345 нм.Температуру плавления ( T m ) определяли по максимуму первой производной кривой плавления. Были измерены кривые нагрева и охлаждения, и расчетные значения T м с совпали в пределах 1,0°C. Изменение температуры составляло 0,5°C мин -1 для поглощения или 1,0°C мин -1 для испускания. Растворы образцов для анализа плавления по абсорбции содержали 100 мМ NaCl, 10 мМ фосфатного буфера, pH 7, 1,0 мкМ каждой ДНК.Растворы образцов для анализа плавления из эмиссии содержали 100 мМ NaCl, 10 мМ фосфатного буфера, pH 7, 0,2 мкМ донорной цепи (RnP1-4), 0,4 мкМ акцепторной цепи (cRnE1s-4s) и 0,6 мкМ Nt23-17.

    Расчет эффективности FRET

    Эффективность FRET (Φ T ) определялась экспериментально по уменьшению эмиссии доноров:

    \begin{equation*}{\Phi _T} = 1 — {I_{DA}}/{I_D}\end{equation*}

    где I DA — интенсивность излучения дуплекса, содержащего донор и акцептор, при 405 нм, а I D — интенсивность излучения дуплекса, содержащего только донор, при 405 нм.2}\end{equation*}

    , где R — расстояние между донором и акцептором, а R 0 — радиус Фёрстера (расстояние, где Φ T = 0,5). J (λ) представляет собой интеграл спектрального перекрытия между излучением донора и поглощением акцептора при λ нм. n представляет собой показатель преломления, который обычно принимается равным 1,4 для биомолекул (26), а Φ D представляет собой квантовый выход донора. Фактор ориентации, κ 2 , был рассчитан из приведенного выше уравнения, где θ T — угол между переходными диполями донора и акцептора, а – углы между этими диполями и вектором разделения.2}{\theta _T}\end{equation*}

    Используя эти уравнения, можно рассчитать эффективность FRET по расстоянию ( R ) и углу ( θ T ) между красителями.

    Для анализа двойных спиральных структур мы использовали три переменные: подъем на пару оснований ( и в Å), угол на пару оснований ( b в °) и угол между красителями и фланкирующими парами оснований ( c в градусах). °). Следовательно, расстояние и угол можно выразить, используя количество пар оснований ( n ) между донором и акцептором следующим образом:

    \begin{equation*}R = a \times (n + 1)\end{equation *}

    \begin{equation*}{\theta _T} = b \times (n — 1) + c\end{equation*}

    Эти три переменные были определены путем подгонки экспериментальной эффективности FRET со значениями, рассчитанными по этим уравнениям .Значения были определены методом наименьших квадратов с использованием инструмента «Решатель» в Microsoft Excel. Ошибки оценивали по стандартным ошибкам, рассчитанным с помощью KaleidaGraph (программное обеспечение Synergy).

    При анализе дуплекса с надрезами мы исходили из предположения о равновесии между штабелированными и нештабелированными структурами. В стопочной структуре предполагалась такая же структура, как и у дуплекса без зарубки. В дуплексе без стопки предполагалась рандомизированная ориентация ( κ 2 = 2/3).Процентное соотношение сложенных и несложенных структур было оценено с использованием метода наименьших квадратов с использованием инструмента «Решатель» в Excel.

    Для анализа дуплексов с промежутками в 3 нт мы предполагали, что ориентация не фиксирована и, таким образом, коэффициент ориентации ( κ 2 ) равен 2/3. Расстояние ( R ) было рассчитано по следующему уравнению: на пару оснований в дуплексной части структуры с гэпом из 3 нуклеотидов.А, e (в Å) — это длина 3-нуклеотидного промежутка (т. е. расстояние между участками дуплекса).

    РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

    Сначала мы проанализировали структуру канонического дуплекса, чтобы проверить точность нашего метода. Мы синтезировали четыре цепи, связывающие пирен (RnP1-4), и четыре комплементарные цепи, связывающие перилен (cRnE1-4), показанные на рисунке 1. Две пары оснований, фланкирующие пирен, были идентичными во всех дуплексах, и это привело к квантовым выходам пирена, которые находились в пределах экспериментальных значений. ошибка для всех дуплексов (дополнительный рисунок S1).Количество пар оснований между двумя красителями может варьироваться от 4 до 19 п.н. путем соответствующего объединения этих нитей (дополнительная таблица S1). Мы измерили спектры флуоресцентного излучения дуплексов (дополнительная фигура S2) и рассчитали эффективность FRET по уменьшению излучения донора. Эффективность FRET между красителями в канонических дуплексах как функция расстояния в парах оснований не является монотонной, а периодической, демонстрируя зависимость FRET от ориентации (рис. 2B). Для расчета эффективности FRET использовались три переменные: подъем, вращение и сумма углов между красителями и соседними парами оснований (рис. 2А).Параметры определялись методом наименьших квадратов. Теоретически рассчитанная эффективность FRET с использованием этих параметров показана линией на рисунке 2B.

    Рис. 2.

    Анализ структурных параметров канонического дуплекса ДНК. ( A ) Уравнения, используемые для расчета расстояния и угла между красителями. ( B ) График FRET канонического дуплекса ДНК. По оси абсцисс отложено количество пар оснований между донором и акцептором. Экспериментальные данные показаны кружками.Линия представляет собой эффективность FRET, теоретически рассчитанную с использованием определенных параметров, показанных на вставке.

    Рис. 2.

    Анализ структурных параметров канонического дуплекса ДНК. ( A ) Уравнения, используемые для расчета расстояния и угла между красителями. ( B ) График FRET канонического дуплекса ДНК. По оси абсцисс отложено количество пар оснований между донором и акцептором. Экспериментальные данные показаны кружками. Линия представляет собой эффективность FRET, теоретически рассчитанную с использованием определенных параметров, показанных на вставке.

    Следует отметить, что большая ошибка от теоретически рассчитанного значения наблюдалась на 8 п.н. Хотя мы рассчитали эффективность FRET, предполагая, что относительный угол между красителями имеет гауссово распределение, все же наблюдались большие различия при разделении пар оснований, отличных от 8 пар оснований (дополнительная фигура S3). Поэтому мы пришли к выводу, что разница в 8 п.н. не была вызвана неполной фиксацией ориентации красителя. На основе теоретического анализа сообщалось, что приближение точечного диполя не работает, когда расстояние между молекулами мало.Следовательно, фактор ориентации не может быть равен нулю, даже если молекулы перпендикулярны (27). Мы полагаем, что большая разница между экспериментально определенной эффективностью FRET при 8 п.н. и эффективностью, ожидаемой на основе цилиндрической модели, связана с ненулевым фактором ориентации, вызванным несостоятельностью дипольного приближения. По этим причинам мы не использовали эффективность FRET на уровне 8 п.н. для определения структурных параметров. Для других разделений пар оснований экспериментальные значения хорошо согласовывались с кривой, построенной на основе модели ДНК B-формы (рис. 2B), ясно демонстрируя, что ориентация красителей строго контролируется в нашей системе.Подъем на пару оснований, рассчитанный на основе данных FRET, составил 3,6 ± 0,03 Å, а поворот на пару оснований составил 32 ± 1°, что почти идентично таковым для канонического дуплекса ДНК B-формы (3,4 Å и 34° соответственно). Разницу подъема можно объяснить показателем преломления. Между подъемом и показателем преломления существует обратно пропорциональная зависимость. Если показатель преломления установлен на 1,5, повышение на пару оснований уменьшается до 3,4 Å. Разница подъема на пару оснований указывает на то, что показатель преломления естественных пар оснований выше 1.4. Напротив, угол поворота не зависит от физических параметров. Рентгеновская кристаллография показала, что угол поворота сильно зависит от последовательности, хотя средний угол обычно составляет 34–36° (28–30°). Следовательно, отличие от типичного угла поворота может быть связано с его сильной зависимостью от последовательности. Насколько нам известно, ранее не сообщалось о системе FRET, зависящей от ориентации, демонстрирующей такое превосходное согласие с теорией на большом расстоянии.

    Мы также проанализировали дуплекс, содержащий А-тракт, с использованием аналогичной системы (дополнительная фигура S4).В случае дуплекса A-тракта наблюдались большие различия между экспериментальной эффективностью FRET и расчетными значениями, основанными на модели цилиндра B-формы. В частности, наблюдаемая эффективность на больших расстояниях оказалась выше ожидаемой. Как сообщалось ранее, А-тракт индуцирует изгиб ДНК (31–33), так что фактическое расстояние между донором и акцептором короче, чем ожидалось от модели цилиндра. Хотя для выяснения подробной структуры А-тракта требуется более подробное исследование, изгиб был четко обнаружен с помощью нашей системы FRET.

    Затем мы проанализировали дуплексы ДНК с разрывами и пробелами, используя нашу систему FRET. Дуплексы с разрывами и разрывами были получены путем гибридизации коротких цепей, содержащих акцептор (cRnE1s-4s), и цепей, содержащих донор (RnP1-4), с более длинной ДНК (Nt17-23), как показано на рисунке 1. Эффективность FRET дуплексов с разрывами показала немонотонная зависимость от числа пар оснований между донорными и акцепторными красителями (рис. 3). Это указывало на то, что относительная ориентация между донором и акцептором не усреднялась.Положения минимумов и максимумов на графике FRET были такими же, как и у канонического дуплекса, показывая, что, несмотря на разрыв, дуплекс сохраняет каноническую геометрию дуплекса B-формы. Однако никированный дуплекс имел более низкий максимум и более высокий минимум по сравнению с каноническим дуплексом. Эта ослабленная ориентационная зависимость явно указывала на то, что надрез придает гибкость. Более высокая гибкость никелированного дуплекса также наблюдалась при использовании других методологий, таких как гель-электрофорез и ЯМР (34–37).Мы проанализировали конформационную гибкость дуплекса с разрывами, просто предполагая равновесие между конформациями дуплекса в стопке и без стопки (36,38). Наши расчеты показали, что, когда 26% дуплексов приняли неуложенную структуру на разрыве, расчетная эффективность лучше согласовывалась с экспериментальными значениями. Это грубый расчет, потому что трудно оценить точные факторы ориентации несложенной структуры. Однако мы считаем, что это предположение полезно для оценки относительной гибкости различных структур ДНК.На основании этих результатов мы пришли к выводу, что дуплекс с разрывом имеет более высокую конформационную гибкость, чем канонический дуплекс. Рентгеновская кристаллография показала, что никелированный дуплекс принимает дуплекс В-формы (39). Наше исследование также показывает, что дуплекс с разрывом принимает конформацию B-формы в растворе и может обеспечить меру повышенной гибкости дуплекса ДНК с разрывом по сравнению с интактным дуплексом.

    Рисунок 3.

    FRET-график никированных (синий) и канонических (красный) дуплексов.Кривая синей линии была получена при допущении, что 26% дуплексов имеют неналоженную структуру.

    Рис. 3.

    FRET-график никированных (синий) и канонических (красный) дуплексов. Кривая синей линии была получена при допущении, что 26% дуплексов имеют неналоженную структуру.

    Затем мы исследовали структуру дуплексов с зазорами. График FRET дуплекса с одним нуклеотидным зазором показан на рисунке 4A. Минимумы на графиках FRET различались для дуплексов с разрывами и дуплексов с разрывами в 1 нт; минимум наблюдался на уровне 8 п.н. с дуплексом с разрывом и на уровне 6 нуклеотидов с дуплексом с разрывом в 1 нт.Этот сдвиг явно указывал на то, что вставка промежутка изменила ориентацию между двумя красителями. Поскольку ориентационная зависимость эффективности FRET наблюдалась с дуплексами с промежутком в 1 нт, две области дуплекса, разделенные промежутком в 1 нт, складываются. Отличие ориентации красителя от дуплекса с надрезом, вероятно, связано с вращением и/или изгибом в зазоре. На самом деле анализ ЯМР показал, что существуют две конформации с 1-нуклеотидным дуплексом с разрывом; один близок к В-ДНК, а другой перекручен (37).Интересно, что снижение эффективности FRET наблюдалось на 6, 10 и 14 нт в случае дуплекса с гэпом в 1 нт. Поскольку мы использовали четыре типа последовательностей с гэпом, как показано в дополнительной таблице S4, этот результат показал, что структура дуплекса ДНК с гэпом в 1 нуклеотид зависит от его последовательности.

    Рисунок 4.

    ( A ) Графики FRET дуплекса с разрывом и дуплекса с зазором в 1 нт. Красная линия показывает кривую подгонки, используемую для определения структурных параметров канонического дуплекса.Пунктиром показана теоретическая кривая в предположении усредненной ориентации красителей в каноническом дуплексе. ( B ) Графики FRET дуплексов с промежутками в 2 и 3 нуклеотида. Кривая оранжевого цвета была рассчитана в предположении, что эффективность FRET дуплексов с гэпом из 3 нуклеотидов зависит не от ориентации, а от расстояния между красителями. Определенные структурные параметры дуплекса с зазором в 3 нт при 20°С показаны на вставке. См. Дополнительный рисунок S7 для структурных параметров, определенных по эффективности FRET при 0 ° C.

    Рисунок 4.

    ( A ) Графики FRET дуплекса с разрывом и дуплекса с зазором в 1 нт. Красная линия показывает кривую подгонки, используемую для определения структурных параметров канонического дуплекса. Пунктиром показана теоретическая кривая в предположении усредненной ориентации красителей в каноническом дуплексе. ( B ) Графики FRET дуплексов с промежутками в 2 и 3 нуклеотида. Кривая оранжевого цвета была рассчитана в предположении, что эффективность FRET дуплексов с гэпом из 3 нуклеотидов зависит не от ориентации, а от расстояния между красителями. Определенные структурные параметры дуплекса с зазором в 3 нт при 20°С показаны на вставке.См. Дополнительный рисунок S7 для структурных параметров, определенных по эффективности FRET при 0 ° C.

    График FRET структуры с зазором в 2 нт показал меньшую ориентационную зависимость. Эффективность FRET монотонно снижалась по мере увеличения количества нуклеотидов между красителями (рис. 4В, зеленые кружки). Таким образом, стэкинг-взаимодействия между двумя дуплексами очень слабы, когда имеется зазор в 2 нуклеотида. Почти никакой зависимости от ориентации не наблюдалось, когда зазор составлял 3 нт (рис. 4В, оранжевые кружки), что свидетельствует о небольшом суммировании и усредненной ориентации красителя.Аналогичные результаты были получены при использовании гель-электрофореза, когда электрофоретическая подвижность уменьшалась при вставке двух или более нуклеотидных промежутков (36,40). Мы оценили длину 3-нуклеотидного промежутка и комплекса из трех олигонуклеотидов, предполагая случайную ориентацию. Эффективность FRET дуплексов с промежутками в 3 нт превосходно согласовывалась с моделью, основанной на этом предположении (рис. 4В, оранжевые кружки и линия). Длина разрыва в 3 нуклеотида оценивалась в 23 ± 1 Å, что указывает на то, что основания с разрывом растянуты.Масуко и др. . Ранее сообщалось об уравнении для расчета длины зазора с использованием системы FRET, зависящей от расстояния (6). Согласно их уравнению длина щели в 3 нт была рассчитана как 19,1 Å, что меньше нашего результата. Мы также измерили спектры излучения и определили эффективность FRET при 0 ° C (дополнительная фигура S7). Суммарно 3-нуклеотидные дуплексы с гэпом при 0°С показали более высокую эффективность FRET, чем дуплексы при 20°С, а длина 3-нт гэп-дуплекса при 0°С была оценена как 19 ± 2 Å.Эти результаты показали, что эффект дыхания акцепторной цепи или высокая подвижность 3-нуклеотидного промежутка могут способствовать растяжению ДНК. Напротив, длина участка двойной спирали увеличивается на 2,8 ± 0,2 Å на пару оснований, что намного короче канонического дуплекса (3,6 ± 0,03 Å). Увеличение представляет собой усредненное увеличение расстояния между донором и акцептором, а уменьшение, вероятно, связано с перемещением щели из 3 нуклеотидов, вставленной между двойными спиралями. На основании этих результатов мы пришли к выводу, что два дуплекса свободно перемещаются, когда между областями вставляется промежуток в 3 нуклеотида.

    Для дальнейшего исследования стэкинг-взаимодействия между двумя двойными спиралями температуры плавления ( Т м с) дуплексов были определены с помощью FRET. Кривые плавления были получены путем мониторинга интенсивности излучения при 500 нм с длиной волны возбуждения 345 нм, так что отслеживалась только гибридизация короткой цепи, содержащей перилен (дополнительная фигура S8). Это позволило оценить стекинг-взаимодействие между двумя спиралями, поскольку температура плавления периленсодержащей нити зависит от того, складываются ли два дуплекса друг в друга. Т м с дуплексов с разрывами были намного выше, чем у дуплексов с разрывами, что подтверждает нашу гипотезу о том, что в дуплексах с разрывами происходит стабильное стекинговое взаимодействие (рис. 5). Т м с дуплексов с 1- и 2-нуклеотидными промежутками были в пределах ошибки эксперимента, хотя Т м cRnE3 немного уменьшились. Этот результат указывает на то, что стекинговое взаимодействие между двумя дуплексами, разделенными промежутком в 1 нт, слабое, тогда как его сила частично зависит от его последовательности (41).Кроме того, дуплексы с гэпом из 3 нуклеотидов показали те же T m с, что и дуплексы с гэпом из 2 нуклеотидов, подтверждая, что два дуплекса больше не уложены в стопку в этих структурах. В целом, анализ плавления подтверждает выводы, сделанные из FRET, что дуплексы не сильно укладываются друг в друга, если они разделены промежутком в 2 нт.

    Рисунок 5.

    Температуры плавления нити, содержащей перилен, в контексте дуплекса с надрезами или зазорами. Эти температуры плавления определяли по кривым плавления, полученным путем наблюдения за эмиссией на длине волны 500 нм с возбуждением на длине волны 345 нм, так что наблюдается только плавление цепи, содержащей перилен.

    Рисунок 5.

    Температуры плавления нити, содержащей перилен, в контексте дуплекса с надрезами или зазорами. Эти температуры плавления определяли по кривым плавления, полученным путем наблюдения за эмиссией на длине волны 500 нм с возбуждением на длине волны 345 нм, так что наблюдается только плавление цепи, содержащей перилен.

    В заключение мы разработали новый метод анализа структур ДНК с использованием системы FRET, зависящей от ориентации. С помощью этой системы были точно получены структурные параметры канонического дуплекса B-формы.Большое отклонение от модели цилиндра, вероятно, из-за изгиба, наблюдалось при дуплексе А-тракта. Кроме того, были подробно выявлены различия в структуре и гибкости между дуплексами с надрезами и дуплексами с разрывами. Хотя дуплекс с зарубками обладает высокой гибкостью, он поддерживает каноническую геометрию B-формы. Однако вставка щели в 1 нт изменила ориентацию красителя, хотя ориентационная зависимость все еще наблюдалась. Дуплексы из 2-х и 3-х нуклеотидов с промежутком практически не показали зависимости от ориентации на графике FRET, что указывает на слабую укладку между двумя дуплексами, разделенными промежутком.Ферменты репарации ДНК, такие как лигазы и ДНК-полимеразы, могут распознавать дуплексы с разрывами или гэпами, хотя распознавание гэпов зависит от размера гэпа (42-45). Различия в структуре и гибкости, которые были обнаружены в этом исследовании, вероятно, способствуют распознаванию этими ферментами. Важно отметить, что наши результаты показали, что ориентация красителей строго контролируется в нашей системе FRET. Кроме того, другие пары красителей могут быть включены в ДНК через d-треонинол. Мы считаем, что наша система FRET окажется простым и универсальным инструментом для анализа структур ДНК в растворе.Эта система может быть использована, например, для анализа структур дуплексов ДНК с различными типами повреждений, такими как радиационно-индуцированные поражения, эпигенетически модифицированные нуклеооснования и неприродные молекулы (46,47). Кроме того, с помощью этой системы FRET можно анализировать структурные изменения в дуплексах ДНК, вызванные связыванием белка.

    ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

    Дополнительные данные доступны на сайте NAR Online.

    ФИНАНСИРОВАНИЕ

    PRESTO от Японского агентства науки и технологий; JSPS KAKENHI [JP16H05925, JP25248037]; Фонд стекла Асахи.Финансирование платы за открытый доступ: The Asahi Glass Foundation.

    Заявление о конфликте интересов . Ни один не заявил.

    ССЫЛКИ

    1.

    Ян

    В.

    Структура и механизм распознавания повреждений ДНК

    .

    Сотовые Res.

    2008

    ;

    18

    :

    184

    197

    .2.

    Германн

    МВт

    ,

    Джонсон

    К.Н.

    ,

    Весна

    А.М.

    Распознавание поврежденной ДНК: структурные и динамические маркеры

    .

    Мед. Рез.

    2012

    ;

    32

    :

    659

    683

    .3.

    Клегг

    р.М.

    [18] Резонансный перенос энергии флуоресценции и нуклеиновые кислоты

    .

    Методы Фермент.

    1992

    ;

    211

    :

    353

    388

    .4.

    Преус

    С.

    ,

    Вильгельмссон

    Л. М.

    Достижения в количественных методах исследования нуклеиновых кислот на основе FRET

    .

    Чембиохим

    .

    2012

    ;

    13

    :

    1990

    2001

    .5.

    Норман

    Д.Г.

    ,

    Грейнджер

    Р.Дж.

    ,

    Урин

    Д.

    ,

    Лилли

    Д.М.Дж.

    Расположение цианина-3 на двухцепочечной ДНК: важность для исследований переноса энергии флуоресцентного резонанса

    .

    Биохимия

    .

    2000

    ;

    39

    :

    6317

    6324

    .6.

    Масуко

    М.

    ,

    Охучи

    С.

    ,

    Содэ

    К.

    ,

    Охтани

    Х.

    ,

    Шимадзу

    А.

    Резонансный перенос энергии флуоресценции от пиреновых меток к периленовым для анализа гибридизации нуклеиновых кислот в условиях гомогенного раствора

    .

    Рез. нуклеиновых кислот.

    2000

    ;

    28

    :

    e34

    .7.

    Виденгрен

    Дж.

    ,

    Schweinberger

    E.

    ,

    Berger

    S.

    ,

    Seidel

    C.A.M.

    Две новые концепции измерения переноса энергии флуоресцентного резонанса с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии: теория и экспериментальные реализации

    .

    J. Phys. хим. А

    .

    2001

    ;

    105

    :

    6851

    6866

    .8.

    Дитрих

    А.

    ,

    Buschmann

    V.

    ,

    Müller

    C.

    ,

    Sauer

    M.

    Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) и конкурирующие процессы в донорно-акцепторных замещенных цепях ДНК: сравнительное исследование ансамблевых и одиночных молекул

    .

    Ред. Мол. Биотехнолог.

    2002

    ;

    82

    :

    211

    231

    .9.

    Ли

    С.

    ,

    Ли

    Дж.

    ,

    Хонг

    С.

    Одномолекулярный трехцветный FRET с незначительным спектральным перекрытием и длительным временем наблюдения

    .

    PLoS Один

    .

    2010

    ;

    5

    :

    e12270

    .10.

    Ди Фиори

    Н.

    ,

    Меллер

    А.

    Влияние взаимодействий между красителями на пространственное разрешение измерений FRET одной молекулы в нуклеиновых кислотах

    .

    Биофиз. Дж.

    2010

    ;

    98

    :

    2265

    2272

    .11.

    Купстат

    А.

    ,

    Ритшель

    Т.

    ,

    Кумке

    М.У.

    ДНК-олигонуклеотиды, конъюгированные с оксазиновым красителем: резонансный перенос энергии Фёрстера с учетом взаимодействия молекулярного красителя и ДНК

    .

    Биоконъюг. хим.

    2011

    ;

    22

    :

    2546

    2557

    .12.

    Форстер

    Т.

    Energiewanderung und Fluoreszenz

    .

    Naturwissenschaften

    .

    1946

    ;

    33

    :

    166

    175

    .13.

    Возняк

    А.К.

    ,

    Шредер

    Г.Ф.

    ,

    Grubmüller

    H.

    ,

    Seidel

    C.A.M.

    ,

    Остерхельт

    Ф.

    Одномолекулярный FRET измеряет изгибы и перегибы в ДНК

    .

    Проц. Натл. акад. науч. США

    2008

    ;

    105

    :

    18337

    18342

    .14.

    Льюис

    Ф.Д.

    ,

    Чжан

    Л.

    ,

    Цзо

    Х.

    Ориентационный контроль резонансной передачи энергии флуоресценции с использованием ДНК в качестве спирального каркаса

    .

    Дж. Ам. хим. соц.

    2005

    ;

    127

    :

    10002

    10003

    .15.

    Икбал

    А.

    ,

    Арслан

    С.

    ,

    Окумус

    Б.

    ,

    Уилсон

    Т.Дж.

    ,

    Жиро

    Г.

    ,

    Норман

    Д.Г.

    ,

    Га

    Т.

    ,

    Лилли

    Д.М.Дж.

    Ориентационная зависимость переноса флуоресцентной энергии между Cy3 и Cy5, присоединенными на конце к двухцепочечным нуклеиновым кислотам

    .

    Проц. Натл. акад. науч. США

    2008

    ;

    105

    :

    11176

    11181

    .16.

    Берьессон

    К.

    ,

    Pruus

    S.

    ,

    EL-SAGHEER

    A.H.

    ,

    BROWN

    T.

    ,

    ALBINSSON

    B.

    ,

    Wilhelmsson

    L.M.

    Аналог основания нуклеиновой кислоты FRET-пара, облегчающая детальные структурные измерения в системах, содержащих нуклеиновые кислоты

    .

    Дж. Ам. хим. соц.

    2009

    ;

    131

    :

    4288

    4293

    .17.

    Преус

    С.

    ,

    Kilså

    K.

    ,

    Miannay

    F.-A.

    ,

    Альбинссон

    Б.

    ,

    Вильхельмссон

    Л.М.

    FRETmatrix: общая методология моделирования и анализа FRET в нуклеиновых кислотах

    .

    Рез. нуклеиновых кислот.

    2013

    ;

    41

    :

    e18

    .18.

    Фессл

    Т.

    ,

    Лилли

    Д.М.Дж.

    Измерение изменения крутки на спиральном соединении в РНК с использованием ориентационной зависимости FRET

    .

    Биофиз. Дж.

    2013

    ;

    105

    :

    2175

    2181

    .19.

    Като

    Т.

    ,

    Kashida

    H.

    ,

    kishida

    ,

    H.

    ,

    Yada

    H.

    ,

    okamoto

    H.

    ,

    asanuma

    H.

    Разработка надежной модельной системы FRET с использованием заменителей оснований, связывающих флуорофоры для строгого контроля их положения и ориентации в дуплексе ДНК

    .

    Дж. Ам. хим. соц.

    2013

    ;

    135

    :

    741

    750

    .20.

    Кашида

    Г.

    ,

    Лян

    X.G.

    ,

    Асанума

    Х.

    Рациональный дизайн функциональной ДНК с нерибозным ациклическим каркасом

    .

    Курс. Орг. хим.

    2009

    ;

    13

    :

    1065

    1084

    .21.

    Санкар

    А.

    ,

    Lindsey-Boltz

    L.A.

    ,

    Ünsal-Kaçmaz

    K.

    ,

    Linn

    S.

    Молекулярные механизмы репарации ДНК млекопитающих и контрольные точки повреждения ДНК

    .

    год. Преподобный Биохим.

    2004

    ;

    73

    :

    39

    85

    .22.

    Линдал

    Т.

    ,

    Дерево

    Р.Д.

    Контроль качества путем репарации ДНК

    .

    Наука

    .

    1999

    ;

    286

    :

    1897

    1905

    .23.

    Лян

    Х.

    ,

    Асанума

    Х.

    ,

    Кашида

    Х.

    ,

    Такасу

    А.

    ,

    Сакамото

    Т.

    ,

    Каваи

    Г.

    ,

    Комияма

    М.

    ЯМР Исследование светочувствительной ДНК, связывающей азобензол. Присвоение абсолютной конфигурации двух диастереомеров и определение структуры их дуплексов в трансформе

    .

    Дж. Ам. хим. соц.

    2003

    ;

    125

    :

    16408

    16415

    .24.

    Асанума

    Х.

    ,

    Akahane

    M.

    ,

    Kondo

    N.

    ,

    osawa

    T.

    ,

    Kato

    T.

    ,

    Kashida

    H.

    Линейный зонд без гасителя с несколькими флуорофорами на ациклическом каркасе

    .

    Хим. науч.

    2012

    ;

    3

    :

    3165

    3169

    .25.

    Дои

    Т.

    ,

    Sakakibara

    T.

    ,

    Kashida

    H.

    ,

    Araki

    Y.

    ,

    WADA

    T.

    ,

    Asanuma

    H.

    Гетероселективный ДНК-подобный дуплекс, стабилизированный донорно-акцепторными взаимодействиями

    .

    Хим. Евро. Дж.

    2015

    ;

    21

    :

    15974

    15980

    .26.

    Лакович

    Дж.

    р.

    Основы флуоресцентной спектроскопии

    .

    2006

    ;

    Нью-Йорк

    :

    Springer

    .27.

    Муньос-Лоса

    А.

    ,

    Curutchet

    C.

    ,

    Krueger

    B.P.

    ,

    Хартселл

    Л.Р.

    ,

    Меннуччи

    Б.

    Беспокойство по поводу FRET: провал приближения идеального диполя

    .

    Биофиз. Дж.

    2009

    ;

    96

    :

    4779

    4788

    .28.

    Дикерсон

    Р.Э.

    ,

    Дрю

    Ч.Р.

    Структура додекамера В-ДНК

    .

    Дж. Мол. биол.

    1981

    ;

    149

    :

    761

    786

    .29.

    Ларсен

    Т.А.

    ,

    Копка

    М.Л.

    ,

    Дикерсон

    Р.Э.

    Анализ кристаллической структуры додекамера B-ДНК CGTGAATTCACG

    .

    Биохимия

    .

    1991

    ;

    30

    :

    4443

    4449

    .30.

    Гжесковяк

    К.

    Зависимая от последовательности структурная вариация B-ДНК

    .

    Хим. биол.

    1996

    ;

    3

    :

    785

    790

    .31.

    Ву

    Х.-М.

    ,

    Крозерс

    Д.М.

    Локус направленного последовательности и индуцированного белками изгиба ДНК

    .

    Природа

    .

    1984

    ;

    308

    :

    509

    513

    .32.

    Нельсон

    Х.СМ.

    ,

    Финч

    Дж.Т.

    ,

    Луизи

    Б.Ф.

    ,

    Клуг

    А.

    Структура олиго(dA)·oligo(dT) тракта и его биологическое значение

    .

    Природа

    .

    1987

    ;

    330

    :

    221

    226

    .33.

    ДиГабриэле

    г. н.э.

    г. ,

    Steitz

    Т.А.

    Додекамера ДНК, содержащая адениновый тракт, кристаллизуется в уникальную решетку и демонстрирует новый изгиб

    .

    Дж. Мол. биол.

    1993

    ;

    231

    :

    1024

    1039

    .34.

    Фуррер

    стр.

    ,

    Беднар

    Ж.

    ,

    Стасяк

    А.З.

    ,

    Катрич

    В.

    ,

    Мишу

    Д.

    ,

    Стасяк

    А.

    ,

    Дюбоше

    Ж.

    Противоположный эффект противоионов на персистентную длину ДНК с разрывом и без разрыва1

    .

    Дж. Мол. биол.

    1997

    ;

    266

    :

    711

    721

    .35.

    Чжан

    г.

    ,

    Крозерс

    Д.М.

    Высокопроизводительный подход для обнаружения изгиба и гибкости ДНК на основе циклизации

    .

    Проц. Натл. акад. науч. США

    2003

    ;

    100

    :

    3161

    3166

    .36.

    Яковчук

    стр.

    ,

    Протозанова

    Е.

    ,

    Франк-Каменецкий

    М.Д.

    Вклад стекинга оснований и спаривания оснований в термостабильность двойной спирали ДНК

    .

    Рез. нуклеиновых кислот.

    2006

    ;

    34

    :

    564

    574

    .37.

    Рулон

    С.

    ,

    Ketterlé

    C.

    ,

    Faibis

    V.

    ,

    Fazakerley

    G.V.

    ,

    Булар

    Ю.

    Конформации структур ДНК с разрывами и разрывами с помощью ЯМР и молекулярно-динамического моделирования в воде

    .

    Биохимия

    .

    1998

    ;

    37

    :

    4059

    4070

    .38.

    Протозанова

    Э.

    ,

    Яковчук

    П.

    ,

    Франк-Каменецкий

    М.Д.

    Равновесие с накоплением и без накопления в ник-сайте ДНК

    .

    Дж. Мол. биол.

    2004

    ;

    342

    :

    775

    785

    .39.

    Аймами

    Дж.

    ,

    Coll

    M.

    ,

    van der Marel

    G.A.

    ,

    фургон Boom

    J.H.

    ,

    Ван

    А.Х.

    ,

    Рич

    А.

    Молекулярная структура ДНК с разрывами: субстрат для ферментов репарации ДНК

    .

    Проц. Натл. акад. наук США

    1990

    ;

    87

    :

    2526

    2530

    .40.

    Мельницы

    Дж. Б.

    ,

    Cooper

    J.P.

    ,

    Hagerman

    P.J.

    Электрофоретические доказательства того, что одноцепочечные участки из 1 или более нуклеотидов резко увеличивают гибкость ДНК

    .

    Биохимия

    .

    1994

    ;

    33

    :

    1797

    1803

    .42.

    Коричневый

    Дж.А.

    ,

    Упаковка

    L.R.

    ,

    Санман

    Л.Э.

    ,

    Суо

    З.

    Эффективность и точность ДНК-полимераз человека λ и β во время синтеза ДНК с заполнением пробелов

    .

    Ремонт ДНК

    .

    2011

    ;

    10

    :

    24

    33

    .43.

    Карими-Бушери

    Ф.

    ,

    Ли

    Дж.

    ,

    Вайнфельд

    М.

    ,

    Томкинсон

    А.Е.

    Восстановление разрывов и разрывов нитей ДНК, содержащих 3΄-фосфатные и 5΄-гидроксильные концы, с помощью очищенных ферментов млекопитающих

    .

    Рез. нуклеиновых кислот.

    1998

    ;

    26

    :

    4395

    4400

    .44.

    Хо

    К.К.

    ,

    Ван Эттен

    Дж.Л.

    ,

    Шуман

    С.

    Характеристика АТФ-зависимой ДНК-лигазы, кодируемой вирусом хлореллы PBCV-1

    .

    Дж. Вирол.

    1997

    ;

    71

    :

    1931

    1937

    .45.

    Лю

    г.

    ,

    Борода

    W.A.

    ,

    Шок

    D.D.

    ,

    Прасад

    р.

    ,

    Хоу

    EW

    ,

    Wilson

    S.H.

    Ферментативная специфичность ДНК-полимеразы β и лоскутной эндонуклеазы 1 поддерживает синтез ДНК для эксцизионной репарации основания длинного участка

    .

    Дж. Биол. хим.

    2005

    ;

    280

    :

    3665

    3674

    .46.

    Ворота

    К.С.

    Обзор химических процессов, повреждающих клеточную ДНК: спонтанный гидролиз, алкилирование и реакции с радикалами

    .

    Хим. Рез. Токсикол.

    2009

    ;

    22

    :

    1747

    1760

    .47.

    Карелл

    Т.

    ,

    Brandmayr

    C.

    ,

    Hienzsch

    A.

    ,

    A.

    ,

    Müller

    M.

    ,

    M.

    ,

    ,

    D.

    ,

    REITER

    V.

    ,

    THOMA

    I.

    ,

    Тумбы

    Р.

    ,

    Вагнер

    М.

    Структура и функция неканонических азотистых оснований

    .

    Анжю. хим. Междунар. Эд.

    2012

    ;

    51

    :

    7110

    7131

    .

    © Автор(ы), 2017 г. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

    (В цвете онлайн) Рентгеновская кристаллическая структура сывороточного альбумина человека, изображающая…

    Контекст 1

    … хорошо охарактеризованы спектроскопически [24] и, как известно, служат моделями для искусственного захвата солнечной энергии, как при фотосинтезе. Кристаллографическое исследование [25] показывает, что PPIX, член семейства порфиринов, связывается с доменом-IB HSA (рис. 2). На рис. 3а показано спектральное перекрытие спектров испускания донора (Trp214 в домене-IIA ЧСА) и спектра поглощения акцептора (PPIX в домене-IB ЧСА) N-формы (нативной формы) ЧСА. . Наблюдается значительное перекрытие, свидетельствующее о значительном безызлучательном переносе энергии возбужденного состояния от Trp214 к PPIX….

    Context 2

    … эффективный акцептор энергии в исследованиях FRET биомолекул. Здесь мы использовали NPA (NPA, флуоресцентный зонд, как известно, связывается с ферментативным активным центром [51]) в качестве донора флуоресцентной энергии. Ожидается, что огромное перекрытие между излучением NPA-CHT и поглощением нанокластера Ag-CHT покажет расстояние между зондами, когда они находятся в непосредственной близости (рис. 20). На рисунке 21а показано значительное спектральное перекрытие между спектром излучения NPA-CHT (D, максимум излучения при 428 нм) и спектром возбуждения Ag-CHT (A, максимум возбуждения при 413 нм), что способствует передаче энергии от NPA к Ag при CHT.Следует отметить, что полоса поглощения биоконъюгатов Ag-CHT осталась неизменной даже после …

    Контекст 3

    … эти КТ отлично подходят для исследований и приложений на основе FRET. На вставке рис. 22а показаны спектры поглощения и излучения КТ CdSe/ZnS, покрытых МПА, в буфере после процедуры лигандного обмена. Это указывает на то, что КТ сохраняли свои фотолюминесцентные свойства при переносе в воду с использованием описанной в литературе процедуры, что важно для полного использования превосходных качеств этих флуоресцентных нанокристаллов для применения в водных средах….

    Context 4

    … прямое связывание лигандов МФК с поверхностью КТ обеспечивало сохранение малого размера КТ с тонкой солюбилизирующей оболочкой для повышения эффективности переноса энергии, т.е. важно для приложений FRET. На вставке к рисунку 22а ​​также видно огромное спектральное перекрытие между спектром излучения КТ и спектром поглощения комплекса EB-ДНК (EtBr-ДНК), что позволяет предположить, что эффективный FRET между донором (КТ) и акцептором (ДНК, меченной EB) может иметь место при адсорбции ДНК на поверхности КТ.Мы подтвердили, что произошло лишь небольшое перекрытие между флуоресценцией донора и акцептора, что позволило эффективно отделить флуоресценцию донора от флуоресценции акцептора. …

    Контекст 5

    … мы ожидаем, что адсорбция EB-меченой ДНК на поверхности КТ, покрытых МПА, приведет к тушению флуоресценции КТ при 528 нм, в то время как при в то же время усиление флуоресценции EB при 600 нм с помощью FRET, что было подтверждено как в стационарных, так и в экспериментах с временным разрешением, как описано ниже.На рис. 22а показаны переходные процессы ФЛ с пикосекундным разрешением КТ и конъюгата КТ-(ЭБ-ДНК) при 528 нм. Пикосекундное затухание КТ в буфере выявило многоэкспоненциальные [43] постоянные времени 0,31 нс (28%), 4,83 нс (26%) и 19,44 нс (46%), что дает среднюю постоянную времени (τ) 10,3 нс. . …

    Контекст 6

    … КТ CdSe/ZnS (донор) в буфере, ап-конвертированное затухание флуоресценции (рис. 22b) выявило компонент сверхбыстрого нарастания 430 фс вместе с более коротким компонентом затухания 6 шт.Сверхбыстрое время нарастания, составляющее 430 фс, связано с накоплением низшего (1S) электронного состояния в КТ CdSe/ZnS и согласуется с измерениями фемтосекундного нестационарного поглощения на коллоидных КТ CdSe, имеющих радиус 4,2 нм, на …

    Context 7

    … 310 пс в фемтосекундном измерении, что также было подтверждено в эксперименте с пикосекундным разрешением. Распады КТ с пикосекундным разрешением (рис. 22а) в буфере вместе с 310 пс также выявили константы времени, равные 4.8 нс и 19,4 нс. Постоянные времени затухания донорной и донорно-акцепторной систем с пикосекундным разрешением вместе с их средними постоянными времени (τ ) приведены в табл. 4. Долгоживущая составляющая ~10 нс может быть отнесена к излучательной рекомбинации носители, привязанные к ловушке …

    Контекст 8

    … [54]. Мы также измерили фемтосекундную динамику комплекса КТ-(ЭБ-ДНК) (донорно-акцепторная система) и получили компоненты нарастания 640 фс, компоненты спада 935 фс и 13 пс и длинную компоненту 269 фс. ps в подогнанном распаде (рис.22б). Более быстрое время затухания для донорно-акцепторной системы по сравнению с одним донором убедительно указывает на эффективную сверхбыструю передачу энергии от КТ CdSe/ZnS, покрытых МПА, к адсорбированному комплексу EB-ДНК. Постоянные времени распада донорной и донорно-акцепторной систем с фемтосекундным разрешением вместе с их средними временными константами …

    Контекст 9

    … КТ CdSe/ZnS в адсорбированный комплекс EB-DNA. Постоянные времени затухания с фемтосекундным разрешением донорной и донорно-акцепторной систем вместе с их средними постоянными времени (τ) приведены в таблице 4.Эффективность FRET, полученная в результате фемтосекундного эксперимента, оказалась равной 91 % аналогичной эффективности, полученной в результате пикосекундных измерений (рис. 23). Следует отметить, что процент донорных КТ, которые вносят вклад в FRET, определяемый процентом дополнительного более быстрого компонента в разрешенном во времени флуоресцентном затухании комплекса КТ-(ЭБ-ДНК) (при 528 нм), который отсутствует в флуоресценции донора, оценивается примерно в 75%. Для подтверждения того, что флуоресценция…

    FRET: Applications in Biology

    Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — это механизм переноса энергии, который широко используется в биологических экспериментах, таких как исследование молекулярной структуры.Его часто называют «спектроскопической линейкой» из-за его природы, в которой расстояние между двумя флуорофорами определяется как отношение интенсивностей флуоресценции.

    Фото: Миша Вебер/Shutterstock.com

    Применение биологических молекул FRET считается неизбежным, поскольку его измерения обладают высокой чувствительностью на расстояниях в нанометровом масштабе. Измерение FRET может быть выполнено только с чувствительностью к одной молекуле, так как оно основано на методе флуоресцентного измерения.

    Применение FRET для обнаружения гибридизации ДНК

    Применение FRET при гибридизации ДНК-зондов усиливает гибридизацию в двух аспектах.

    1. Сигнал от непрореагировавших зондов гасится при выполнении гибридизации на основе FRET. Это позволяет избежать процедур промывки и твердой подложки, когда реакцию гибридизации наблюдают в режиме реального времени как гомогенный анализ. Преимуществом этого гомогенного типа анализа является его меньшая сложность и скорость, поэтому его можно легко адаптировать для автоматизированного выполнения.
    2. Гибридизацию in vivo можно проводить непосредственно в живых клетках, обнаруживая только сигналы зонда, которые гибридизуются, и благодаря повышенной скорости гибридизации в растворе. Были разработаны гибридизационные зонды FRET различных форматов.

    Применение FRET для обнаружения мутаций ДНК

    Системы переноса энергии могут быть либо созданы (анализы TDI), либо разрушены (анализы захватчиков) с помощью олигонуклеотидных зондов FRET, которые были специально разработаны для обнаружения мутаций ДНК.Анализы захватчиков используют разлагаемые зонды, такие как анализы 5′-нуклеазы; более того, они используют два разлагаемых зонда, а не один и один неразлагаемый зонд, работающие согласованно.

    Для создания разветвленных структур ДНК используются как линейные, так и шпилькообразные олигонуклеотиды, которые впоследствии разрушаются в ходе реакции. Другим преимуществом этого подхода является то, что он приводит к эффективному усилению сигнала и не требует ПЦР для обнаружения очень небольшого количества последовательностей-мишеней.Несомненным преимуществом TDI-тестов является то, что зонды FRET производятся в процессе обнаружения, но для этого требуется ПЦР-амплификация.

    Применение FRET в исследованиях белков

    Взаимодействие белков клеточной поверхности

    играет жизненно важную роль в процессе трансмембранной передачи сигналов. Важными конечными результатами взаимодействия лиганда с рецептором являются кластеризация рецепторов и изменение их конформации. FRET используется как инструмент для определения взаимосвязи расстояния и надмолекулярной организации молекул клеточной поверхности.В динамике белка сворачивание белка является наиболее важным процессом, который широко исследуется. smFRET был использован, чтобы узнать больше о динамике сворачивания и разворачивания переходов двухсостоятельных и более крупных многодоменных молекул.

    Применение FRET для картирования биологических мембран

    Взаимодействие белков, присутствующих на поверхности клетки, существенно важно для трансмембранного сигнального процесса. Кластеризация рецепторов и вариации их конформаций являются ключевыми факторами, влияющими на конечный результат взаимодействия рецепторов-лигандов.Надмолекулярная организация клеточной поверхности и определение отношений расстояния могут быть эффективно выполнены с помощью FRET.

    Применение FRET для картирования биологических мембран привело к кластеризации лектиновых рецепторов, распределению рецепторных тирозинкиназ и гемопоэтических кластеров дифференцировочных молекул на клеточной поверхности, а также к конформационным вариациям молекул главного комплекса гистосовместимости I при связывании лиганда и изменении мембранного потенциала.

    Применение в клеточной биологии

    Визуализация

    FRET, в которой используется спектральный мутант GFP, добавляет возможность отслеживать и обнаруживать связывание ионов и белок-белковые взаимодействия в живых клетках.Важные трансмембранные рецепторные белки, которые участвуют в адгезии и передаче клеточных сигналов, часто известны как интегрины.

    Например, обнаружены явные взаимодействия межмолекулярного интегрина in vivo, что стало возможным благодаря микроскопии FRET, состоящей из пары FRET CFP/YFP. Локальное взаимодействие Rac-эффектор индуцируется направлением Rac к мембранам и отсоединением его от Rho-GDI.

    Кроме того, благодаря своей однородной дисперсии в клетке, Rac конститутивно активен; он избирательно взаимодействует с эффекторами в определенных областях клеточного края.Возникновение и прекращение передачи сигналов Ca2+ в определенных клеточных участках, таких как эндоплазматический ретикулум, ядро ​​или цитоплазма, можно заметить, вычислив соотношение изменения интенсивности флуоресценции донора и акцепторных молекул, присутствующих в живых клетках.

    Применение FRET в других биомолекулах

    Считалось, что ферментативные реакции, управляемые динамикой, являются конформационными. Предполагается, что фермент в открытой структуре ожидает субстрата и катализирует его в закрытой структуре.Далее реакция протекает между молекулами асинхронно.

    Это означает, что аденилаткиназа (АК) находится в равновесии между закрытой и открытой структурой, несмотря на характер связывания субстрата, который изменяет только скорость перехода. В отличие от ЯМР или рентгеновской кристаллографии, стандартных подходов к определению биомолекулярной структуры, измерение smFRET не требует наличия молекулы для получения структуры более высокого порядка.

    Дополнительное чтение

    Изображение белков | Eurekalert!

    Даже рабочая лошадка не может делать все.Двойной преимущества высокого разрешения и высокой пропускной способности сделать синхротронную рентгеновскую кристаллографию, например то, что проводится в лаборатории Беркли Усовершенствованный источник света, бесспорная опора для решение белковых структур. Однако от 20 до 40 процентов всех белков являются чрезвычайно сложными или даже невозможно кристаллизовать, в том числе многие найденные в мембраны, контролирующие транспортировку молекулы и передача сигналов через клетку поверхности.Это означает, что другие технологии также будут должны сыграть решающую роль. Одна альтернатива, которая делает не требует кристаллизованных белков, является ядерно-магнитным резонансная (ЯМР) спектроскопия, технология, использует спин определенных атомных ядер для получения структурная, пространственная и даже динамическая информация об этих ядрах. Обычная ЯМР-спектроскопия, однако существенно ограничивается изучением малых белки.Для изучения макромолекулярного белка комплексы, особенно те, которые трудно уговорить в кристаллы, лучшая альтернатива рентгену кристаллография может быть электронной микроскопией.

    Взгляд в большую картину

    Луч электрона микроскоп может производить дифракционные картины от двумерный кристаллический массивы, а не трехмерные массивы требуется для рентгеновской дифракции.В случае с мембраной белки, эти двумерные кристаллы можно создать в более натуральные оклады молекулы жира, называемые липиды — чем тяжелые концентрации моющих средств необходимо для формирования трехмерных кристаллов.

    Иногда электрон кристаллография является единственным путь, как это было в случае два года назад, когда биофизики Ева Ногалес, Шэрон Вульф и Кеннет Даунинг из Berkeley Lab Отдел наук о жизни, объявил о завершении первый трехмерный атом модель белка, называемая «тубулин», очень универсальный молекула, которая среди прочего функции, позволяет клетке подвергаться митозу.В разрешение 3,7 ангстрем, эта модель стала первой высокодетальный трехмерный взгляд на тубулин, включая место, где белок взаимодействует с противораковым препаратом таксолом.

    Использование электронной, а не рентгеновской кристаллографии было решающее значение для создания этой модели. Как объяснил Даунинг, «получение дифракционных картин с помощью электронного луча мы могли работать с кристаллами толщиной всего в одну молекулу, давая нам наше высокое разрешение.»

    Расшифровка атомной структуры тубулина была впечатляющим успехом — ученые пытались делать это с момента открытия белка в 1960-х годах, но проект взял на себя лаборатория Беркли исследователи более чем за шесть лет, чтобы завершить. За это время они записали около 4000 изображения и картины дифракции электронов, которые Ногалес обработал, чтобы придумать 159 изображений и 93 дифрактограммы, использованные для компьютерной реконструкции для финальной версии. 3-D модель тубулина.

    Метод, используемый для определения структуры тубулина, называется криоэлектронной микроскопией или «крио-эм», потому что изображения были записаны с помощью электронного микроскопа, оснащенного «холодная стадия». Замораживание белка сохраняет его в естественном гидратированном состоянии и помогает защитить его от радиационного поражения. Еще одно дополнение к электронной микроскопии с исключительно сильный потенциал для решения структур макромолекулярного белка Комплексы — это метод, называемый «анализ изображения одной частицы».»

    При анализе изображений отдельных частиц тысячи изображения случайно ориентированного отдельного белка молекулы записываются с помощью электрона микроскоп. Затем компьютер используется для выравнивания эти тысячи произвольно ориентированных изображений в упорядоченный массив и объединить их в трехмерная реконструкция — по сути, создание виртуального кристалла.

    Возможности анализа изображений отдельных частиц как инструмент для структурной геномики был недавно продемонстрировано в проекте под руководством Ногалеса.Работающий с белками, приготовленными в лаборатории Калифорнийского университета в Беркли профессор Роберт Тиан, Ногалес и Фрэнк Андел использовали комбинацию электронной микроскопии и анализ изображения одной частицы для получения первого Трехмерные модели белкового механизма, который инициирует транскрипция генетического кода ДНК для последующей продукции новых белков. Этот на самом деле представляет собой комплекс транскрипционных факторные (tf) белки, которые включают TFIID, TFIIA и ТФИИБ.

    После раскручивания нити ДНК и распакован для подготовки к производству белка, Белок TFIID связывается с открытым участком ДНК именно там, где начинается генетическое сообщение. Один раз TFIID распознает и связывается с геном на цепи ДНК, он взаимодействует с РНК-полимеразой. чтобы генетический код транскрибировался в сигнальную РНК, которая затем несет информация из ядра клетки в ее цитоплазму, где происходит сборка белка. место.

    «Наша модель дает нам хорошее представление о том, как TFIID работает совместно с TFIIA и TFIIB. чтобы инициировать и регулировать транскрипцию генов, кодирующих белок, — говорит Ногалес. — Мы показывают подковообразную структуру, окружающую центральную полость, внутри которой происходит распознавание и связывание с ДНК».

    Структурные определения для некоторых доменов и других компонентов TFIID, TFIIA и белки TFIIB были определены с помощью рентгеновской кристаллографии, но размер TFIID в сочетании с трудностями, возникающими при попытке кристаллизовать все белки tf. вместе, до сих пор исключало использование дифракции рентгеновских лучей для визуализации всего комплекса.Следовательно, до сих пор общая форма и взаимное расположение компонентов внутри Комплекс был загадкой.

    TFIID представляет собой подковообразный белок, запускающий процесс транскрипции генов путем связывания к незащищенной нити ДНК именно там, где начинается генетическое сообщение. Центральная полость подковы рассчитаны на то, чтобы легко закрепиться вокруг одной нити ДНК.

    Поскольку Ногалес и ее коллегам не нужно было кристаллизовать комплекс tf, они может работать с относительно небольшим количеством выборки и все же создавать изображение целая транскрипционная машина.Менее чем за семь месяцев у них появился трехмерный реконструкция с разрешением 35 ангстрем.

    «Наше исследование показывает, что электронная микроскопия является хорошим методом для изучения биологических комплексы белков и нуклеиновых кислот, которые слишком велики или слишком хрупки для кристаллизации для исследований дифракции рентгеновских лучей», — говорит Ногалес, который благодарит Андела за одночастичную аналитическая работа. «Наше исследование также показывает, что методология отдельных частиц является полезной. метод структурной характеристики мегадальтоновских транскрипционных комплексов.»

    При разрешении 35 ангстрем формы TFIID и сопутствующих ему белков, а также их Относительные положения внутри комплекса tf хорошо видны. Когда этот электрон информация микроскопии объединяется с данными рентгенографии различных субструктур внутри комплекс — метод, получивший название «гибридная кристаллография» — Ногалес и ее коллеги ожидайте найти дальнейшие подсказки относительно того, как механизм транскрипции объединяется. (Подробнее о лаборатории Ногалеса на http://cryoem.berkeley.edu.)

    Роберт Глейзер, профессор биофизики Калифорнийского университета в Беркли, работающий по совместительству в Подразделения наук о жизни и физической биологии Беркли Лаборатории являются пионерами и мировыми специалист по электронной кристаллографии. Глейзер говорит, что гибридная кристаллография повышает большим энтузиазмом» среди ученых в своей области, потому что «это комплексы, а не отдельные компоненты, которые действительно начинают приносить структурные биологии в область функциональной геномики.»

    Глейзер сравнивает рентгеновскую кристаллографию с идентификацией всех отдельных компонентов, которые зайти в блок двигателя авто-свечи, распредвал, клапана и т.д.» Строение каждого этих компонентов очень интересно и поучительно, но вы также хотите знать, как свеча зажигания подходит к блоку, порядок открытия и закрытия клапанов и т.д. далее, и как все это достигается», — говорит он.

    Глейзер, Ногалес и Даунинг недавно начали использовать электронный микроскоп в Национальный центр электронной микроскопии (ncem) лаборатории Беркли, оснащенный автоэмиссионная пушка, которая позволяет направлять высокосфокусированные электронные пучки на 200 киловольт (кВ) энергии на образец.Это повышает разрешение и повышает контраст для получения изображений лучшего качества, чем электронные микроскопы с меньшей мощностью они ранее использовали. Трое наблюдают за приобретением новых изготовленных на заказ электронный микроскоп, который ускорит электронные пучки до 300 кВ, что должно улучшить разрешение и качество изображения еще выше.

    «Этот новый микроскоп позволит нам получить максимально возможное разрешение наших изображений. при этом нанося минимальный ущерб нашим образцам», — говорит Ногалес.«С добавлением новой технологии обнаружения, мы также сможем собирать наши данные намного быстрее и более эффективно.»

    Между новым микроскопом и оборудованием в ncem исследователи лаборатории Беркли надеюсь, что сможет записывать до 3000 изображений в день. Тем не менее, электронная микроскопия и гибридные кристаллография не будет соответствовать синхротронной рентгеновской кристаллографии для атомного уровня Детали и скорость передачи. Однако другой подход к электронной микроскопии может подойди ближе.

    Глейзер в сотрудничестве с Даунингом и Ногалесом, а также Рави Маллади и Эсмондом Нг из Национальный научно-вычислительный центр энергетических исследований (nersc) изучает возможность применения огромных вычислительных мощностей суперкомпьютера к электронным Методы визуализации микроскопии.

    С помощью суперкомпьютера вместо работы с несколькими десятками тысяч изображений как есть теперь все готово, должна быть возможность собрать и объединить до миллиона изображений одного один некристаллизованный белок, а затем реконструировать эти изображения в трехмерную модель с разрешение, сравнимое с разрешением рентгеновской кристаллографии.Более того, с суперкомпьютеры nersc, способные производить триллионы вычислений каждую секунду, такие реконструкцию можно было сделать менее чем за полдня. Глейзер называет этот подход «кристаллизация in silico», эквивалент использования компьютера для выполнения сложной задачи. кристаллизации белков.

    «В настоящее время программное обеспечение, которое существует для объединение данных от одной частицы было написано для рабочих станций и мало что было сделано, чтобы воспользоваться преимуществами суперкомпьютера возможностей», — говорит он.

    Глейзер и его сотрудники стремятся сделать кристаллизация in silico «важный игрок в структурной геномики», изучая способы автоматизация сбора данных изображения, частицы идентификация и окончательное объединение данных из отдельные частицы.

    «С дальнейшим улучшением качества изображения, более близко к тому, что законы физика позволит, размер частиц, который может быть обработанный с помощью этой техники, может толкнуть вниз до диапазон, который включает все, кроме самых маленьких белков», — говорит Глейзер.

    «На этом этапе это может стать методом выбора для решения структур любых белок, который еще не кристаллизовался».

    Увеличение деталей

    С рентгеновской кристаллографией для определения трехмерных структур белковых компонентов и электронной микроскопии, чтобы показать, как эти компоненты встраиваются в комплексы, необходимо увеличить масштаб для более мелких деталей электронных свойств, чтобы увидеть, как белок машина выполняет свои химические функции.Лучшими методами для этой работы являются рентген абсорбционная спектроскопия (xas) и расширенная тонкая структура рентгеновского поглощения (exafs). Оба метода основаны на энергетическом спектре, полученном, когда одно или несколько ядер электроны (те, чьи энергетические орбитали ближе всего к ядрам атома) поглощают рентген. В xas электрон поднимается на орбиту с более высокой энергией, и в результате спектр дает важную информацию о том, как электроны атома-хозяина настроен.В экзафах электрон вылетает из атома как фотоэлектрон и полученный спектр обеспечивает чрезвычайно точные измерения длин электронных связей.

    «Рентгеновская абсорбционная спектроскопия является прекрасным дополнением к рентгеновской кристаллографии», говорит химик PBD Карен Макфарлейн. «Мы можем посмотреть на определенный тип атома внутри белок и посмотреть, кто его соседи, и мы можем посмотреть на него под несколькими разными среды или после того, как мы манипулировали им.»

    Макфарлейн руководил проектированием и строительством новой экспериментальной конечной станции в als линия луча 9.3.1, линия луча изогнутого магнита, которая генерирует фотоны рентгеновского излучения в диапазоне от 2 до 6 Диапазон тысяч электрон-вольт (кэВ). Эти фотоны идеально подходят для изучения таких атомов, как как сера, хлор и кальций, которые являются второстепенными, но критически важными белками составляющие. Например, серосодержащий пептид глутатион помогает предотвратить окислительного и свободнорадикального повреждения клетки, а также укрепляет эритроциты, в то время как защита лейкоцитов.

    Новая конечная станция на линии луча 9.3.1 оснащена камера для образцов с гелиевым криостатом для охлаждение белковых молекул до 10 Кельвинов в чтобы свести к минимуму радиационные повреждения и позволить exafs в дополнение к сбору данных xas. Давление внутри камеры можно варьировать или проводить эксперименты может быть сделано в вакууме, и образцы могут быть изучается в твердом или жидком состоянии. Этот уникальный Камера была построена физиком PBD Мелом Кляйном, который является главным научным сотрудником в конечная станция, работающая в сотрудничестве с другими химик pbd Виттал Ячандра.

    «До сих пор большинство экспериментов xas и exafs было сделано на металлических центрах в металлопротеинах при опытах с серой, хлором, кальцием и другие атомы с более низким Z встречались редко», — говорит Макфарлейн. «Мы планируем использовать наш экспериментальный станции экстенсивно для серы во многих различных белки, пептиды и неорганические комплексы. Мы также есть планы по исследованию хлора и кальция в белковый комплекс Фотосистемы II».

    Помимо предоставления электронных и структурных информация, которая дополнит рентген данные кристаллографии, рентгеновская спектроскопия техники также могут быть использованы для выполнения сравнительные измерения, которые ответят вопросы, на которые ни одна техника не могла ответить в одиночку.Например, такие сравнительные измерения могли бы помочь определить, существуют ли различия в активных центрах белков, когда они находятся в растворе, в отличие от того, когда они они кристаллизовались. Эксперименты на конечной станции xas/exafs на линии луча 9.3.1 планируется начать в начале следующего лета.

    Создание белковых фильмов

    Независимо от того, сосредоточены ли вы на самых больших, самых маленьких или самых тонких деталях белковых структур, все методы, которые обсуждались до сих пор, имеют одну общую черту — все они обеспечивают статические изображения.Все же белковые машины динамичны, когда выполняют свои функции. Так же, как фотография автомобиль в состоянии покоя, независимо от того, насколько высокое качество изображения, мало что дает для оценки того, что машина будет делать, когда она движется, ученым нужно будет увидеть белок в действии, чтобы полностью понять его цель.

    Новые технологии, разрабатываемые в настоящее время, позволяют получать динамические изображения белки. Вместо предоставления составных изображений, реконструированных из ансамбля или совокупность избранного типа белковой молекулы, эти новые технологии позволяют ученым изучать и даже физически манипулировать одной отдельной молекулой.

    Шимон Вайс, физик, работающий совместно с pbd и Materials. Sciences Division (msd) является одним из признанных лидеров в области одномолекулярных спектроскопия. Он объясняет преимущества характеристики личности и манипулирования ею. белковая молекула.

    «В отличие от ансамблевых измерений, эксперименты с одиночными молекулами обеспечивают информация о распределениях и временных траекториях, которая в противном случае была бы скрыта.В в частности, эксперименты с одной молекулой можно использовать для измерения промежуточных продуктов и отслеживания зависимые от времени пути химических реакций, которые трудно или невозможно синхронизироваться на уровне ансамбля».

    Общая стратегия одиночной молекулы спектроскопия заключается в присоединении молекул красителя к различных участках белка. Эти красители молекулы флуоресцируют определенным цветом, когда забит лазерным светом. Отслеживание интенсивности и расположение флуоресцентных эмиссий над время выявляет любые изменения, которые могут происходить место в структуре белка.Вариант эта стратегия особенно ценна для измерение конформационных изменений белка «резонансная передача энергии флуоресценции» или раздражение.

    Чтобы использовать лад, ученые помечают белок пара молекул красителя, одна из которых действует как энергия «донор» и другой как энергия «акцептор». Эффект лада наблюдается, когда донор фотовозбужден и его энергия флуоресценции соответствует энергии акцептор будет поглощать.Если белок сокращается чтобы сблизить два тега, эффект лада усиливается. Как белок растягивается, отодвигая метки дальше друг от друга, ладовый эффект ослабевает.

    «Выполняя ладовые измерения вместе с одним или несколькими одиночными молекулами методы манипулирования, можно будет сопоставить локальные структурные изменения белка с макромолекулярной функцией», — говорит Вайс.

    Одним из самых больших препятствий на пути к достижению этой цели являются ограничения текущих молекулы флуоресцентного красителя, но помощь уже в пути.Недавно Weiss и msd химик Пол Alivisatos объявила о разработке нового типа флуоресцентного зонда из кристаллы полупроводников нанометрового размера. Эти полупроводниковые нанокристаллы предлагают явное преимущество перед обычными молекулами красителей в том, что они излучают несколько цветов свет, что означает, что их можно использовать для маркировки и измерения нескольких биологических маркеров одновременно.

    «Использование полупроводниковых нанокристаллов должно позволить нам проводить уникальные эксперименты с ладами», говорит Вайс.«Например, можно заставить меченые молекулы излучать разные цвета при разное время события».

    Alivisatos, орган по производству полупроводников химическим путем нанокристаллов, говорит: «Разработка полупроводниковых нанокристаллов для биологических маркировка даст биологам совершенно новый класс флуоресцентных зондов, для которых немало эквивалент органической молекулы существует».

    В эксперименте на клетках ткани мыши, называемых фибробластами 3T3, основной нанокристалл селенид кадмия был заключен в оболочку из сульфида кадмия, и это ядро-оболочка Затем комбо заключали в оболочку из кремнезема для растворимости в воде и биосовместимости.

    Поскольку более ранние исследования Аливисатоса показали, что цвет света, излучаемого полупроводникового нанокристалла зависит от его размера, мышиные клетки были помечены двумя ядра-оболочки разного размера. Поверхности кремнезема ядер-оболочек были модифицированы для выборочно контролировать их размещение в ячейках. Меньшие нанокристаллические ядра-оболочки, которые флуоресцировали зеленым, были модифицированы для проникновения в ядро ​​каждой клетки; чем больше ядра-оболочки, которые излучали красный свет, были модифицированы так, чтобы они могли прикрепляться к актиновым филаментам вдоль наружной клеточной мембраны.

    Флуоресцентно-резонансная спектроскопия переноса энергии или FRET-спектроскопия включает донор и молекула акцепторного красителя, присоединенная в разных точках образца. Когда донор фотовозбуждается на больших расстояниях от акцептора, флуоресценция исходит исключительно от донор. По мере того, как пространство между ними сужается, флуоресценция все больше передается к акцептору.

    Изображения конфокальной микроскопии показали, что ядра клеток были пронизаны зеленым зонды и актиновые волокна были окрашены в красный цвет.Зеленые и красные метки были явно видны невооруженным глазом и могут быть сфотографированы в истинном цвете с помощью обычного камера. Лаборатория Беркли уникальна тем, что располагает лабораториями мирового класса в четырех основных технологические области, необходимые для решения белковых структур — рентген на основе синхротрона кристаллография, ЯМР-спектроскопия, электронная микроскопия и суперкомпьютеры. Через его тесные связи с кампусом Калифорнийского университета в Беркли объединяют некоторые из лучших исследователей в области биофизических наук.Лаборатория поэтому хорошо в состоянии помочь решить то, что было названо грандиозной задачей биологии, характеристика и понимание того, как работает белковый механизм клетки.

    Как сказал директор PBD Грэм Флеминг: «Ничто из того, что происходит внутри живой клетки, не является случайное появление; всем управляют эти удивительные белковые машины».

    ###



    Рентгеновский снимок прикуса: ответы на ваши вопросы

    Рентгенографические (рентгеновские) изображения являются незаменимым диагностическим инструментом в стоматологии.Одним из самых рутинных и полезных видов рентгеновских снимков, которые делают стоматологи, является так называемый прикусной снимок. Вот некоторые вещи, которые вы, возможно, захотите узнать об этой распространенной диагностической процедуре.

    Что такое прикусной рентген?
    Прикусы показывают наличие и степень разрушения задних зубов, особенно в областях, где соседние зубы соприкасаются друг с другом. В отличие от других областей зубов, эти контактные поверхности между соседними зубами не поддаются визуальному осмотру. Прикусы также могут показать участки потери костной массы вокруг зубов — признак пародонтоза; однако их не берут для этой цели, потому что прикусы не показывают всю поверхность корня, окруженную костью.

    Почему они так называются?
    Название «прикусывание» относится к тому, как пленка — или датчик, в случае цифрового рентгеновского снимка — располагается во рту: пациент прикусывает небольшой язычок или крыло, которое удерживает аппарат на месте.

    Как часто они мне нужны?
    Это определяется в каждом конкретном случае, с целью не подвергать вас большему облучению, чем необходимо, даже минимальному количеству, обнаруженному в серии прикусных рентгеновских лучей. Ваша индивидуальная предрасположенность к кариесу (разрушению зубов) и личный стоматологический анамнез будут играть важную роль в определении того, как часто вам нужно проводить рентгенографическое обследование, и, если на то пошло, как часто вам нужно приходить для плановой чистки и осмотра.

    Безопасны ли они?
    Безопасность прикусных рентгеновских лучей лучше всего иллюстрируется сравнением с обычным ежедневным облучением, которое мы получаем каждый день от источников окружающей среды, которое составляет около 0,01 миллизиверта — единицу измерения, которую мы используем для радиации. Серия из 4 прикусных рентгеновских снимков подвергает вас 0,004 миллизиверта радиации — меньше половины дневного облучения. Необнаруженный кариес, который может быстро распространиться через более мягкие внутренние слои зубов, считается гораздо более опасным!

    Если прикусной рентген показывает наличие кариеса, что делать дальше?
    Если полость очень маленькая, мы можем вылечить ее за одно посещение.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.