Лада х код фото: фото новая цена Х Код Concept, АвтоВаз опубликовал тизер кроссовера

Содержание

LADA представляет XCODE на тольяттинском автосалоне

22 сентября 2016 г.

На тольяттинском автосалоне MOTOREXPO-2016 LADA представляет 6 концептуальных автомобилей, которые раскрывают потенциальные направления развития модельного ряда. Вместе с концепт-карами в экспозиции LADA участвуют модернизированные серийные модели.

Кроме того, на MOTOREXPO-2016 демонстрируется LADA Granta Sport, LADA Largus фургон и две мелкосерийных модификации LADA 4х4 — болотоход »Марш» и автомобиль повышенной проходимости »Рысь». Как и другие специальные версии LADA, эти внедорожники можно приобрести через официальную дилерскую сеть.

Одной из новинок автосалона стала перспективная система LADA Connect, которая позволит управлять системами автомобиля с помощью смартфона.

Подробная информация обо всех представленных автомобилях и фото доступны по ссылке MOTOREXPO

Тольяттинский автосалон проходит с 22 по 25 сентября в УСК »Олимп». Традиционно для сотрудников АВТОВАЗа организовано бесплатное посещение автосалона. С 23 по 25 сентября каждый работник, предъявив свой служебный пропуск, сможет прийти на выставку и провести с собой еще одного посетителя. Для детей до 7 лет вход свободный. Время работы выставки с 23 по 25 сентября: с 10.00 до 20.00.

Концептуальный LADA XCODE Concept

LADA XCODE Concept — автомобиль, демонстрирующий возможное развитие модельного ряда LADA и новой дизайнерской концепции, в основе которой лежит ИКС-стиль. XCODE Concept выполнен в рамках ДНК дизайна, которая уже успешно реализована в серийных автомобилях Vesta и XRAY.

Концепция автомобиля предусматривает ряд перспективных решений, в том числе применение турбомотора и полноприводной трансмиссии, а также телематической платформы LADA Connect, которая позволяет управлять системами автомобиля с помощью смартфона, а в перспективе пользоваться из автомобиля облачными сервисами.

Дополнительная информация о LADA XCODE и фото доступны по ссылке: LADA XCODE Concept

Концептуальные Cross

LADA Vesta Cross Concept Седан

Седан в роли кроссовера – концептуальное решение, уникальное не только для российского, но и для мирового автомобильного рынка. Рост спроса на кросс-версии, соединенный с традиционной российской приверженностью статусным седанам, может дать старт разработке действительно оригинального автомобиля. Седан LADA Vesta Cross Concept оснащен специальным обвесом, который защищает эмаль кузова на легком бездорожье. Концепция автомобиля предусматривает увеличенный клиренс и более крупные колеса, что повышает внедорожный потенциал седана LADA Vesta.

Дополнительная информация о LADA Vesta Cross Concept Седан и фото доступны по ссылке LADA Vesta Cross Concept Sedan.

LADA Vesta SW Cross Concept

Концептуальный универсал, показанный впервые в 2015 году. Это пример развития проекта LADA Vesta и интерпретации нового ИКС-образного стиля LADA в формате вседорожного универсала. Динамичный силуэт универсала сочетается с увеличенным клиренсом и развитым обвесом из неокрашенного пластика. Совместно со штампованными элементами ИКС-стиля на боковинах, внедорожные накладки придают автомобилю спортивный, мускулистый и пропорциональный облик. Примечательно, что на концептуальном универсале применены задние фонари, унифицированные с седаном. Запуск автомобиля в серийное производство запланирован на вторую половину 2017 года.

Дополнительная информация о LADA Vesta SW Cross Concept и фото доступны по ссылке LADA Vesta SW Cross Concept

LADA XRAY Cross Concept

От своего серийного прототипа LADA XRAY Cross Concept отличается вседорожным обвесом. Это накладки на пороги, расширители арок, накладки на бамперы. Аналогичный обвес, защищающий эмаль кузова на легком бездорожье, применяется сегодня на серийных Kalina и Largus в модификации Cross.

Дополнительная информация о LADA XRAY Cross Concept и фото доступны по ссылке LADA XRAY Cross Concept

Концептуальные Sport

LADA Vesta Sport Concept

LADA Vesta Sport Concept демонстрирует богатый потенциал седана-бестcеллера. Кузов и салон концепта выполнены в гоночном стиле. Автомобиль оснащен подвеской с гоночными настройками — при этом использован опыт участия команд LADA в соревнованиях мирового уровня, в т.ч. в Чемпионате по турингу WTCC. Напомним, что в июне 2016 года заводская команда LADA Sport Rosneft сделала победный дубль на домашнем этапе в России.

Дополнительная информация о LADA Vesta Sport Concept и фото доступны по ссылке LADA Vesta Sport Concept

LADA XRAY Sport Concept

Концептуальный автомобиль иллюстрирует возможное развитие линейки серийных LADA с форсированными моторами и гоночным стилем. Как и у концепта LADA Vesta Sport, двигатель LADA XRAY Sport Concept базируется на серийном 1,8-литровом моторе. Доработка и перенастройка двигателя могут поднять его мощность со штатных 122 л.с. до 145-150 л.с. Подвеска автомобиля была занижена и получила спортивные настройки.

Дополнительная информация о LADA XRAY Sport Concept и фото доступны по ссылке LADA XRAY Sport Concept

Концепты LADA Vesta Sport Concept и LADA XRAY Sport Concept созданы в рамках единой стратегии спорт-версий LADA — в настоящий момент выпускаются аналогично модифицированные Kalina Sport и Granta Sport.

Новые модификации серийных LADA

LADA Vesta CNG Taxi

Перспективная модификация LADA Vesta, которая позволяет использовать два вида топлива: сжатый природный газ (метан) и бензин. Работа на сжатом природном газе позволяет снизить затраты на топливо более чем в 3 раза. Это очень важно для корпоративного транспорта и таксопарков – именно поэтому LADA Vesta CNG изготовлена в варианте такси. Метан более экологичен и менее взрывоопасен, чем пропан и бензин. Кроме того, работа на природном газе увеличивает ресурс мотора.

Дополнительная информация о LADA Vesta CNG Taxi и фото доступны по ссылке LADA Vesta CNG .

LADA Vesta 1.8 Exclusive

Модификация, которая сегодня готовится к производству. Ее отличие — новый силовой агрегат (аналогичный устанавливается на LADA XRAY). 1,8-литровый мотор LADA мощностью 122 л.с. оснащен системой электронной регулировки фаз газораспределения (VVT). Для автомобиля предусмотрена как механическая коробка передач, так и автоматизированная механическая трансмиссия (АМТ) — совместная разработка LADA и немецкой фирмы ZF. АМТ откалибрована таким образом, чтобы приспосабливаться под индивидуальный стиль вождения.

Новая модификация Exclusive дополнена такими опциями как кожаная обивка сидений, руля, подсветка салона в ногах пассажира и водителя, хромированные молдинги на дверях и др.

Дополнительная информация о LADA Vesta Exclusive и фото доступны по ссылке LADA Vesta Exclusive

Общая информация по LADA Vesta — по ссылке LADA Vesta

LADA Connect

LADA Connect – перспективная телематическая платформа, которая позволит управлять системами автомобиля с помощью смартфона. Это уникальная опция для автомобилей доступного и среднего ценовых сегментов. На тольяттинском автосалоне можно ознакомиться с настройками системы и протестировать некоторые из функций LADA Connect: подачу звукового и светового сигнала, получение данных о геолокации, температуре воздуха в салоне и снаружи автомобиля, проверить, закрыты ли двери и багажник автомобиля. Первые LADA Vesta и LADA XRAY с функцией Connect планируется выпустить в 2017 году.

Подробная информация о LADA Connect доступна по ссылке LADA Connect .

фото кроссовера внутри снаружи с разных ракурсов

Уникальная концептуальная модель компактного кроссовера от АвтоВАЗа была представлена в августе 2016 года в рамках Московского международного автосалона. Задача концепта – продемонстрировать новое дизайнерское направление компании, которое будет реализовано в ближайшем будущем в так называемой линейке «Х» (икс). Модель вызвала широкий интерес и получила массу вполне заслуженных положительных отзывов, и те, кому не посчастливилось увидеть концепт собственными глазами, с интересом рассматривают, какая же она – новая Лада х код на фото и видео, выложенных на многих интернет-ресурсах.

К сожалению, ни один даже самый качественный снимок не передаст в полной мере уникальность и оригинальность модели. Для того, чтобы получить наиболее полную информацию о новом концепте, нужно просмотреть некоторые комментарии и описания, касающиеся экстерьера и интерьера модели, причём те, которые помогут Ладе х код с фото предстать в глазах ценителя топовых авто во всей своей красе.

Реализация фирменного стиля в экстерьере

В основе новой дизайнерской концепции компании положена идея выпуска линейки машин в новом икс-стиле. При этом важно, чтобы модель получилась модной, стильной, динамичной, притягивающей взгляды и запоминающейся. Поэтому, как видно на фото Лады х код, в новой модели дизайнерская задумка реализована даже в мелких деталях экстерьера, намёк на «икс» наблюдается со всех сторон: спереди, сзади и по бокам.

В результате использования чётких рельефных линий и объёмности, кроссовер получил можно сказать «атлетическое телосложение». Теперь даже на фото Лада XCODE выглядит мощно, уверенно, надёжно и немного агрессивно – именно такой, каким должен быть автомобиль повышенной проходимости (а представленный концепт-кар позиционируется именно как компактный кроссовер).

Объёмные боковые стороны чётко передают дизайнерское решение и выполнены в фирменном «Х-стиле». Высокая подоконная линия, красивый обтекаемый профиль, плавные изгибы – всё это, как видно на всех фото Лады х коде, подчёркивает современность и динамичность модели. Колёсные арки, а также порожки и нижняя часть дверей дополнены тёмными защитными обвесами, дополнительным украшением стали нижние молдинги.

Есть одна интересная особенность боковых сторон, которую не передаёт ни одно фото Лады х код – это надёжно «спрятанные» ручки задних дверей. Концепт представляет собой 5-дверную модель, но визуально это сразу не заметить, т.к. обе задние наружные ручки перенесли в чёрную область дверной рамки и выполнили в вертикальном направлении.

Стильно выглядит и радиаторная решетка, состоящая из достаточно крупных «иксов», на вид переплетённых между собой. Подчёркивают вид переднего «икса» хромированные дуги, переходящие в передние фары. Интересно, что даже блок-фары тоже стали элементом стиля «Х», для этого в них соединены друг с другом светодиоды ближнего и дальнего света.

На фото concept lada XCODE, снятых сзади, тоже чётко просматривается фирменный стиль. Задние блок-фары связаны с икс-образными формами крыльев, бампер – массивный, оснащён имеющими трапециевидную форму выхлопными трубами.

Ещё один момент, который сложно рассмотреть на фото Лада икс код, это крыша. Она выполнена в чёрном глянце, и очень эффектно сочетается с белыми передними стойками, боковыми балками и спойлером.

Внимание! Контрастное оформление крыши даёт возможность персонализации модели в дальнейшем.

Оформление интерьера модели

Не менее интересен и салон концепта, который абсолютно не похож ни на одну из выпускаемых сегодня АвтоВАЗом модель. В нём все сведено к:

  • стильности;
  • минимализму;
  • удобству для водителя;
  • отсутствию всего лишнего или навязчивого.

Первое, что привлекает взгляд любого автолюбителя на фото Lada XCODE – это современная и технологичная цифровая приборная панель. Центральную консоль украшает десятидюймовый сенсорный экран мультимедийной системы, интегрированной с облачными сервисами Lada Cloud.

Отделка салона выполнена в благородном чёрном цвете, с некоторыми небольшими контрастными элементами, всё вместе – элегантно и гармонично.

С какой стороны не посмотреть – на фото новая Лада XCODE выглядит безукоризненно, эффектно и роскошно. Одного взгляда достаточно, чтобы оценить новинку и пожелать прокатиться в такой красавице, но пока что это только концепт – запуск в серийное производство запланирован на 2018 год. Цены на модель в настоящее время не определены, т.к. кроссовер подлежит доработке, не уточнены окончательно технические характеристики, а тем более – комплектация. Единственное, в чем не стоит сомневаться, это в том, что модель будет наполнена всеми возможными современными опциями, направленными на максимально комфортное управление и безупречную езду.

Марка Лада поманила россыпью концептуальных паркетников — ДРАЙВ

По словам главного дизайнера компании Стива Маттина, концепты, подготовленные к салону, — новый шаг в стилистике, заданной седаном Lada Vesta или «икс-реем». И действительно, фирменных букв «X» явно прибавилось.

Самый большой стенд на Московском автошоу за всю историю бренда Лада вместил 19 автомобилей, шесть из них — концепты (пять новых). Главный магнит экспозиции, конечно, Xcode. Вспоминается неофициальная информация о ещё только обсуждаемой идее создания оригинального паркетника в размерах Калины. Ну а пока эта машина объявлена просто предвидением облика будущих Лад.

Решётка радиатора с иксом дополнена светодиодными икс-фарами, фонари тоже образуют букву «икс», и даже традиционные выштамповки по бортам сделаны более рельефными. Модная парящая крыша сзади визуально отделена от стойки чёрной вставкой.

Салон «икс-кода» не похож на интерьер нынешних Лад. Десятидюймовый экран мультимедийной системы открывает доступ к облачным сервисам Lada Cloud.

Авторы концепта не раскрывают технических данных, но указывают, что конструкция принципиально предусматривает установку турбомотора и полного привода. О серии для «икс-кода» говорить рано, хотя, по инсайдерской информации, это может быть 2018-19 год. Зато единственный концепт на автошоу, показанный публике ранее, универсал Vesta Cross, встанет на конвейер во второй половине 2017-го. Его на стенде поддержали модели Xray Cross и Vesta Cross Sedan.

Седан Vesta Cross с увеличенным до 20 см клиренсом оформлен аналогично кроссу-универсалу. Возможно, скоро у Volvo S60 Cross Country появится российский аналог, пусть и в другом сегменте.

Вспомним, что пятидверка Xray когда-то начинала свою карьеру как неординарный концептуальный паркетник с тремя створками, потом проект упростился до шоу-кара номер два, а в итоге обратился хэтчбеком (хотя на сайте компании его числят кроссовером). Сейчас трансформация этой машины завершила своеобразный цикл.

Концепт Xray Cross получил 17-дюймовые колёса, увеличенный клиренс и пластиковый обвес в стиле кросс-Весты.

У кроссового варианта пятидверки Xray такие же хорошие серийные перспективы, как и у приподнятой Весты, хотя ещё пару-тройку лет покупателям нужно будет подождать. Даже внедрение полного привода тут обсуждается, хотя неясно пока, по какому пути лучше пойти: адаптировать механическую трансмиссию альянса (с муфтой в приводе задней оси, как у Дастера) или поставить гидрообъёмную систему, с гидромоторами сзади и масляным насосом в коробке передач.

Ещё Веста и Xray предстали перед зрителями в противоположном амплуа. Два концепта Vesta Sport и Xray Sport стараниями Маттина и его команды обзавелись новыми бамперами, креслами, яркими акцентами в салоне, спойлерами и прочими атрибутами «подогретых» модификаций.

Спортивные вариации двух этих же машин объявлены потенциальным направлением развития линейки марки. Шоу-кары получили 18-дюймовые колёсные диски, спортивные настройки моторов и подвесок, задние дисковые тормозные механизмы и кучу ярких акцентов в дизайне. Были в столице представлены и Лады куда более близкие к конвейеру.

Седан Vesta Signature удлинён на 20 см против стандартной версии, вся прибавка пошла на пространство на втором ряду, где вместо дивана появились два кресла.

Замеченная недавно фотошпионами длиннобазная Vesta превратилась в модификацию Signature, которую компания намерена выпускать под заказ. При этом в широких пределах может варьироваться оформление интерьера (цвета, материалы), по желанию клиента завод поставит продвинутую развлекательную систему. Даже автоматизированная трансмиссия тут перекалибрована в сторону более плавной работы. Не менее важно, что шумоизоляция в таком седане была усилена.

В Весте Signature появилась кожаная отделка с перфорацией, вставки под чёрный лак, текстильные коврики, оригинальные декоративные элементы вроде окантовок воздуховодов. В салон каждого седана будет помещена металлизированная табличка с автографом владельца.

Президент ОАО АвтоВАЗ Николя Мор выразил уверенность, что расширение модельного ряда поможет марке отвоевать новые сегменты рынка. А ведь и сейчас дела у бренда Лада обстоят неплохо. За первые семь месяцев 2016 года наблюдалось падение продаж на 10% при общем снижении рынка на 14,4%. Доля Лады возросла за год на процент (до 18,7%, по данным Ассоциации европейского бизнеса).

Лада концепт фото. Блог, авто новинки, фото

Содержание статьи:
  • Фото
  • Концепт Lada 4х4 Vision — Нива из будущего
  • Видео
  • Похожие статьи
  • Смотреть все результаты поиска на сервисе Яндекс.Картинки.

    lada kalina cross. Лада › Концепт Lada Vesta открыл новую главу в дизайне серийных Лад. Леонид Попов, 27 августа Фото Драйва и компании АвтоВАЗ. Оптика — одна из самых запоминающихся деталей Весты. Общие пропорции кузова тоже не подкачали. Не верится, что это почти серийная Lada. Четырёхдверке Lada Vesta суждено стать новым флагманом марки. Со временем она заменит Приору, но пока на Московском международном автосалоне показан только концепт.

    Концепт-кары линии Lada Cross Concept. Помимо кроссовера Lada XCode, в Москве были представлены концепт-кары серии Cross Concept.  На фото версия в кузове универсал. Лада Веста в кузове универсал с внедорожным пакетом также выглядит вполне современно и определенно в ней что-то есть. К сожалению, внедорожная версия Лады Веста как в кузове седан, так и в кузове универсал была представлена на выставке только пока в качестве концепции.

    Серийная модель будет пятидверной Ориентировочно старт продаж Лада Х код Икс Код намечен на год. Хотя есть и своя особенность — многоярусная светодиодная головная оптика, к тому же у кузова прототипа нет центральной стойки. В данной статье следует рассмотреть все то, что интересует потенциальных покупателей кара Лада Х-Код — фото, цены, технические особенности авто и дату его появления на рынке. Всё течёт, всё меняется, по крайней мере ешё несколько лет назад создание подобных ЖК экранов было проблемой не имеющей бытовых решений.

    Шокирующие концепты «АвтоВАЗа» — DRIVE2

    На Московском международном автосалоне состоялся первый показ предвестника вазовского внедорожника следующей генерации. Прототип получил икс-фейс и икс-образные же выштамповки по бокам, как у Vesta и Xray. Также концепт оснастили мультимедийной системой с большим тачскрином и климат-контроль. На центральном тоннеле имеется шайба — вероятно, она отвечает за выбор режимов движения внедорожника. Смотреть все фото в галерее. Хотя есть и своя особенность — многоярусная светодиодная головная оптика, к тому же у кузова прототипа нет центральной стойки.

    О силовой установке — вообще ни слова. А что вы думаете об этом? Авторизуйтесь или войдите через. Сначала лучшие Сначала старые. HungryGoblin 4 недели назад. Автоваз, второй раз мы на эту фигню не купимся!

    Вы действительно хотите удалить комментарий? Показать все 5 ответов. Дмитрий 4 недели назад. Сразу отпадут вопросы, куда делись предыдущие тазовские прототипы Kazanzaki 4 недели назад.

    А с круглым рулём можно будет купить, за очень большую доплату? Чёта мне квадратный не кажется удобным. Сергей Астапов 4 недели назад.

    Судя по тому, сколько стоят нынешние дрова, эта будет стоить 3,, р. Ниву люблю пипец, но качество и цена это что то Владимир 4 недели назад. Одним из понтовых элементов концепта можно назвать «стеклянную» приборную панель. Учитывая тот неоспоримый факт что в РФ бывает местами очень холодно возникает вопрос: И вот теперь вопрос: По моим наблюдениям не готов. А в предложенных красивых картинках дофига всего такого что относится к категории дорого-богато Одынат Владимир 3 недели назад.

    Да ладно, на хундае ставят жк экраны, выдерживает до — 38, проверял. Появляются засветы пикселей, но с теплой погодой, восстанавливаются. Владимир Одынат 2 недели назад. Всё течёт, всё меняется, по крайней мере ешё несколько лет назад создание подобных ЖК экранов было проблемой не имеющей бытовых решений.

    На практике проблема решалась установкой нагревательных элементов внутрь экрана, но это работало только пока есть электричество в АКБ. Я видел ноутбук оставленный в неотапливаемом помещении на новогодние праздники. Температура там падала где то до После оттаивания он работал, но изображение на экране было еле заметным на сером фоне.

    Тотсамый 4 недели назад. Александр 4 недели назад. Смотрится не плохо, даже я житель Владивостока со своей любовью к японскому авто готов признать, что эта машина интересна но есть одно НО! Вспоминая как изначально выглядел Х-рей и в какое говно он превратился после запуска в серию, воздержусь пока о выводах. Kuzzмич 4 недели назад. JIux 4 недели назад. Х-рей была шикарна на картинках в реальности превратилось в обычный автоваз читай г-вно с этим будет то же самое Алексей 4 недели назад.

    Главное побольше всего напихать. Нива всегда рассматривалась как машина для бездорожья. Тут имеем кучу лишнего или не Нива это уже. SinigamiRuuk 4 недели назад. Ahle 4 недели назад. Это только концепт концепта и вброшен для обсуждения. Но вот хотелось бы увидеть обещанную на начало го ниву.

    НОВАЯ ЛАДА 4Х4 / NEW Russian Lada 4×4 2018

    Все лада концепт. Блог, авто новинки, фото

    Содержание статьи:
  • Фото
  • Концепт-кары Lada 2017 | ZHAND.RU
  • Видео
  • Похожие статьи
  • Концепт -кары линии Lada Cross Concept.  Например, на выставку в Москву Автоваз привез концепт -кар спорт версии Лады Веста.

    Обзор Лада Х Код Concept и ее внедорожных качеств.  Лада XCode – концепт кроссовер Х Код.

    Новые концепты LADA | Naked Science Могут же когда хотят! Лада концепт ! Lada Vesta Concept — новая Лада Веста.

    К сожалению подробностей, о технических деталях новой концепции нет. Наружные ручки задних деверей удалось. Первая партия автомобилей будет предлагаться в двух комплектациях: Лайт и Люкс. Подоконная линия идет почти параллельно земле.

    АвтоВАЗ показал шесть новых концепт-каров — ЯПлакалъ

    Внешность нового кроссовера Лада выполнена в том же стиле, что и седан Lada Vesta. Отличительной особенностью новинки, так же как и Весты, является Х-профиль в дверях автомобиля.

    Именно поэтому многие линии и стиль может напомнить многим знакомый дизайн некоторых старых моделей Вольво. К сожалению подробностей, о технических деталях новой концепции нет. По некоторым данным, в случае если эта концепция дойдет до серийного производства, машина получит турбированные силовые агрегаты и полный привод. Кроме того, планируется оснастить новую модель кроссовера телематикой Лада Коннект.

    Так с помощью этой системы транспортным средством можно будет управлять с помощью мобильного телефона. Например, компания Автоваз представила в качестве исследования внедорожную версию концепта Лада Веста в кузове седан.

    Эта версия автомобиля имеет увеличенный дорожный просвет и имеет ряд защиты от бездорожья. Как сообщают эксперты эта модель идеально подходит для эксплуатации по нашим Российским плохим дорогам. Но, например зарубежные эксперты также заявляют, что внедорожная версия седана Лада Веста, может получить неплохой спрос в некоторых странах Европы.

    По мнению создателей автомобиля, эта модель идеальное средство передвижения по Российским дорогам. Особенно при длительных путешествиях. А как насчет спортивной модели Лада?

    Наверное, в наши дни об этом можно не мечтать. Ведь потребители уже не верят, что компания Автоваз способна выпустить спорт версию своей продукции.

    Но, по всей видимости, в компании действительно что-то началось меняться. Например, на выставку в Москву Автоваз привез концепт-кар спорт версии Лады Веста. Смотрите также: Все известные факты о Лада Веста Кому-то может показаться, что эта модель ни кому не нужна. Особенно если учитывать, что у Автоваза нет мощного качественного мотора и спортивной коробки передач. Спорт версия Лады Веста будет предназначен для массового рынка. Но мы не сомневаемся, что на его базе будет создан другой автомобиля, предназначенный для профессионального автоспорта.

    Кроме того, Автоваз привез в Москву спортивную версию кроссовера Lada XRay, которая также получила точно такой же внешний стиль как и спортверсия Lada Vesta.

    Машина получила имя Lada CNG. Эта версия седана оснащается двумя баллонами, в которые под давлением закачивается газ. Также машина сохранила возможность работать на традиционном топливе. Так инженеры оснастили топливную газовую систему специальными клапанами, которые в случае аварии мгновенно смогут сбросить газ, для того чтобы избежать взрыва метана. Эта машина полностью основана на традиционном шасси Нива. Планируется, что Автоваз будет выпускать пикапы, специально оснащая их под определенные задачи.

    АВТОВАЗ представит 29 автомобилей на ММАС-2016

    Lada XCode/Лада Х код (Икс Код) концепт: фото, цена, технические характеристики и видео

    {loadposition direct5} Незадолго до Московского автосалона появилась информация о новом кроссовере от АвтоВАЗа под именем

    Дизайн XCode – дальнейшее продолжение линейки «Х»

    С первого взгляда на концепт Лада Икс-Код видно, что он является продолжением развития линейки «Икс». Естественно, что зарубежные корни нового кроссовера прослеживаются очень отчетливо – проект, несомненно, разрабатывался под влиянием Renault, недавно выпустившей компактные модели Kadjar и Kaptur.

    Это неудивительно – в качестве базы для будущего флагмана была использована все та же хорошо зарекомендовавшая себя платформа Nissan B0, на которой разработан X-Ray и ряд кроссоверов Nissan и Renault. С одной стороны, платформа используется уже давно и хорошо себя показала, а с другой – налаженное производство позволит удержать цену на приемлемом уровне.

    Несомненный плюс Лады Х Код – то, что при создании внешнего вида АвтоВАЗ напрочь отказался от собственных наработок. Дизайн разрабатывался с нуля командой Рафаэля Линари и под влиянием идей Стива Маттина.

    Благодаря этому автомобиль выгодно отличается от моделей Весты, Калины и Гранты действительно современной и стильной внешностью – при взгляде на него и не заподозришь, что перед тобой детище отечественного автопрома.

    Хотя Лада Икс Код относится к классу субкомпактных городских кроссоверов, разработчики по максимуму постарались использовать объем кузова и сделали его пятидверным. Правда, багажный отсек получился и вовсе рудиментарным – но этим грешит не только «вазовский» кроссовер, но и все остальные представители класса.

    Носовая часть городского паркетника завораживает – без дураков, ее внешний облик действительно цепляет. Радиаторная решетка и нижний воздухозаборник выполнены в виде стилизованной буквы «Х», а выдающиеся части переднего бампера, отделанные алюминиевыми накладками, лишь усиливают эффект.

    Наклонные фары, интегрированные с решеткой, тоже имеют Х-образную форму и визуально расширяют лицевую часть автомобиля. Над каждой фарой установлен блок светодиодных дневных ходовых огней, удачно вписывающихся в экстерьер капота.

    Задняя стойка в форме плавника акулы великолепно гармонирует с вытянутыми фонарями и Х-образным багажником. Вообще, в экстерьере очень много элементов подобного типа – даже выштамповки на крыльях сделаны в таком стиле.

    Покатая крыша оканчивается небольшим верхним спойлером с аэродинамическим зазором, благодаря чему набегающий поток воздуха обрабатывается более эффективно и обеспечивает лучшую прижимную силу.

    Интересна конструкция задних дверей, точнее, ручек. Их спрятали в дверную рамку, как на Nissan Juke. Это необычное дизайнерское решение, безусловно, привлечет к концепту внимание части потенциальной аудитории.

    Фото Лада Х Код

    Фотографии с презентации нового кроссовера на Московском автосалоне-2016:

    Фото интерьера Lada XCODE Concept, салон серийного кроссовера конечно будет отличаться:

    Видео

    Официальное промо видео:

    Интерьер

    Оснащение салона по качеству не отстает от экстерьера кроссовера. Понятно, что это не Rolls-Royce Cullinan, но для отечественного автомобиля – при условии, что у серийных кроссоверов Lada XCode будет хотя бы такой интерьер – это значительный шаг вперед.

    • Приборная панель с массивным туннелем и цифровым табло, на которое выводится основная информация.
    • Удобные эргономичные кресла с выраженной боковой поддержкой, солидно отличающиеся от тех, что устанавливаются на Lada Vesta и Granta.
    • Современная мультимедийная система с широким дисплеем, интегрированная с перспективным проектом LADA Connect. Правда, расположение экрана нельзя назвать удачным – он устанавливается отдельно в центре передней панели, а не интегрирован в нее. При неосторожном движении водитель рискует задеть дисплей или вырвать его с креплений.
    • Адаптивный круиз-контроль, включающий функции удержания полосы и регулировки расстояния.
    • Современные электронные ассистансы, в том числе помощник парковки с возможностью дистанционного управления и многое другое.

    Габаритные размеры Лада Икс Код

    По размерам Xcode получился несколько меньше, чем Xray . Здесь он ближе скорее к Калине. Длина шоу-кара составляет 4 метра, а колесная база примерно 2,5 м. Новинка позиционируется, как кроссовер В-класса и рассчитана больше на городскую езду, чем на бездорожье, несмотря на увеличенный дорожный просвет. Клиренс и размер колес автомобиля был увеличен в связи с возросшим в последнее время спросом на компактные кроссоверы.

    При внешней компактности автомобиля, его салон довольно просторен и с комфортом вмещает водителя и четырех пассажиров. Места для ног и головы достаточно как в переднем, так и в заднем ряду сидений.

    Перспективы

    Что касается силовых агрегатов и трансмиссии, то конкретной информации пока нет. Скорее всего, Lada XCode получит неплохо показавшие себя моторы объемом 1.6 л, устанавливаемые на Lada X-Ray. Также, возможно, для топовых версий будет установлен либо наддувный бензиновый агрегат такого же объема, либо атмосферный двигатель на 2.0 л, используемый на кроссоверах Renault.

    Не исключено, что появится версия, оснащенная дизельным мотором 1500 см3 и развивающая мощность в 109 л. с. – если это произойдет, то коммерческий успех XCode гарантирован. Еще, скорее всего, кроссовера будет комплектоваться 5- или 6-ступенчатой механической трансмиссией и 4-ст. автоматом Jatco.

    Несмотря на то что платформа B0 предполагает возможность установки полного привода, пока концепт представлен исключительно в переднеприводной комплектации.

    С одной стороны, это явный минус, с другой – есть ли смысл устанавливать 4WD на субкомпактный кроссовер, ведь это не Газ Тигр? Полноценно использовать его на бездорожье вряд ли позволит конструкция – всё-таки подвеска заимствована, по словам представителей АвтоВАЗ, от Vesta, по крайней мере, передняя точно. Да и полунезависимая архитектура задней подвески со скручивающейся балкой вряд ли годится для установки привода на все колеса.

    Цены и комплектации

    До начала продаж о цене и комплектациях Лада Х Код (Lada XCODE) говорить пока рано. Явно что его стоимость будет больше Икс Рея.

    Какой будет комплектация Лады XCODE

    На цену Лады Х код в значительной степени повлияет комплектация и количество опций, предусмотренных для создания максимального комфорта водителю во время езды. Так как новый кроссовер пока не запущен в массовое производство и ещё подвергается некоторым доработкам, говорить о базовой или дополнительной комплектации рано. Но производители открыли несколько секретов, которые будут ярко выделять «модель нового поколения» среди других, предлагаемых на авторынке.

    Новый автомобиль планируется укомплектовать множеством современных высокотехнологических решений и «примочек», превращающих управление в сплошное удовольствие. Одно из них – использование телематической платформы LADA Connect, которая позволит управлять некоторыми системами в кроссовере дистанционно, с помощью специального приложения на смартфоне. Благодаря уникальной системе теперь можно на расстоянии:

    • открывать/закрыть автомобиль;
    • прогревать машину перед посадкой или, наоборот, охладить салон, включив кондиционер;
    • открыть багажник;
    • быстро найти авто на парковке, запустив звуковой или световой сигнал;
    • выяснить местонахождение автомобиля по карте;
    • получать уведомления об ударах, эвакуации и т.д.

    Интересно! Система LADA Connect тоже была представлена недавно в числе лучших разработок для топовых авто и машин премиум-класса. Непосредственно для представителей среднего класса данная опция является уникальной.

    Новый кроссовер оснащен цифровой приборной панелью, для вывода данных предусмотрен десятидюймовый сенсорный экран мультимедийной системы, также новинка имеет доступ к облачным сервисам Lada Cloud. И все эти современные технологии будут учтены при установлении производителем цены на Lada XCODE, но затраты на них вполне оправданы предоставлением высокого уровня комфорта при пользовании авто.

    Говоря о комплектации, производитель не скрывает оснащение новинки такими опциями, как:

    • система экстренного торможения;
    • автоматическая парковка;
    • круиз-контроль с выдерживанием дистанции по отношению к впередиидущему автомобилю.

    Зависеть у Лады икс код цена также будет от стандартных элементов и опций (сигнализация, количество подушек безопасности и другие).

    Цена и дата выхода

    О стоимости новинки пока рано говорить – Lada XCode не вышел за рамки концепта.

    Сохранение и использование изображения пользовательского ввода в Xcode с помощью Swift

    Я пытаюсь сделать простую игру для iOS из 15 приложений, где я могу получить входное изображение пользователя и сделать из него игру. Пока я понял все остальное, но я не знаю, как получить доступ к входному изображению пользователя.

    Итак, я следовал тому, что мне сказали делать, и мне удалось получить изображение на моей первой странице, как вы можете видеть на снимках экрана. Однако я не знаю, как сохранить изображение, разделить его на шестнадцать тайлов и сделать репост на второй странице, чтобы пользователи могли поиграть с тайлами.

    Итак, мой вопрос 1) Как переместить изображение ввода пользователя с первой страницы на вторую страницу? Или как сохранить картинку?

    2) как мне разделить изображение на 16 фрагментов и сохранить их или поместить в каждый вид изображения соответственно?

    мой код на первой странице

      импорт UIKit
    
    класс BeginningPage: UIViewController, UIImagePickerControllerDelegate, UINavigationControllerDelegate {
    
    @IBOutlet слабая переменная ImageView: UIImageView!
    @IBOutlet слабая переменная ImageSelector: UIImageView!
    
    переопределить функцию viewDidLoad() {
        супер.просмотрDidLoad()
    
        // Выполните любую дополнительную настройку после загрузки представления.
    }
    
    func imagePickerControllerDidCancel(_ picker: UIImagePickerController) {
        // Закрыть сборщик, если пользователь отменил.
        уволить (анимированный: правда, завершение: ноль)
    }
    
    func imagePickerController(_ picker: UIImagePickerController, didFinishPickingMediaWithInfo info: [String: Any]) {
    
        // Информационный словарь может содержать несколько представлений изображения. Вы хотите использовать оригинал.
        охранять пусть selectedImage = info[UIImagePickerControllerOriginalImage] как? UIImage еще {
            fatalError("Ожидался словарь, содержащий изображение, но было предоставлено следующее: \(info)")
        }
    
        // Установите photoImageView для отображения выбранного изображения.ImageView.image = выбранное изображение
    
        // Закрыть сборщик.
        уволить (анимированный: правда, завершение: ноль)
    }
    
    //МЕТКА: Действие
    
    Функция @IBAction PressImage (_ отправитель: UITapGestureRecognizer) {
        пусть imagePickerController = UIImagePickerController()
        imagePickerController.sourceType = .photoLibrary
        imagePickerController.delegate = я
        присутствует (imagePickerController, анимированный: правда, завершение: ноль)
    
    }
      

    }

    9 основных гитарных аккордов, которые нужно знать начинающим! С фотографиями в помощь — Musicians HQ

    Итак, вы хотите играть на гитаре.Потрясающий! Если вы запутались или не знаете, с чего начать, вы попали в нужную статью. Этот простой урок покажет вам как иллюстрированных гитарных аккорда , так и гитарных аккорда с изображением рук.

    Не могу обещать, что поначалу эти аккорды будут легкими, но они необходимы. Эти аккорды являются строительными блоками музыки, и их знание позволит вам играть множество популярных песен! Дочитайте статью до конца, чтобы найти список из 20 гитарных песен для начинающих.

    Эти аккорды предназначены для начинающих, потому что это открытые аккорды, то есть струны, которые вы играете открытыми. Другие варианты исполнения этих аккордов требуют запрета и более сложных положений пальцев. Эти 9 простых гитарных аккордов имеют простые формы, которые не так уж сложно освоить.

    Давайте разберем эти 9 основных гитарных аккордов для начинающих.

    Как читать таблицу гитарных аккордов


    Как вы можете видеть на изображении выше, мы иллюстрируем гитарный аккорд с помощью таблицы аккордов.Прежде чем выучить какие-либо аккорды, вам нужно научиться читать таблицу. Это очень просто:

    • Вертикальные линии представляют собой струны гитары, как если бы вы смотрели на гриф прямо и прямо. Крайняя левая струна — это низкая ми, а крайняя правая — высокая ми (между ними — струны ля, ре, соль и си).
    • Горизонтальные линии представляют собой маркеры ладов. Пространство между каждой горизонтальной линией — это лад.
    • Более толстый черный блок в верхней части диаграммы представляет собой порожек гитары.
    • Черные кружки показывают, куда вы кладете пальцы. (Ваши пальцы всегда проходят между маркерами ладов, а не поверх них)
    • Кружки и крестики в верхней части таблицы показывают, играете ли вы на струне или нет. Кружок означает, что вы играете на струне с открытой струной (не нажимая на нее), а X означает, что вы вообще не играете на струне.
    • Буквы внизу таблицы, выровненные со струнами, иногда говорят вам, какую высоту звука вы играете. Это очень полезно для изучения того, какие ноты составляют трезвучие!

    Самое популярное, что нужно знать

    Давайте разобьем эти основные аккорды на части, чтобы сделать их более удобоваримыми.

    Если вы только начинаете учиться играть на гитаре, эти четыре аккорда — до мажор, ля минор, фа мажор и соль мажор — позволят вам сыграть сотен , если не тысяч песен, многие из которых вы, вероятно, уже знаете !

    • До мажор — аккорд до мажор состоит из нот до, ми и соль.

    Вот как играть до мажор на гитаре:

    • ля минор – аккорд ля минор состоит из нот ля, до и ми.

    Вот как играть ля минор на гитаре:

    • Фа мажор – аккорд фа мажор состоит из нот фа, ля и до.

    Вот как играть фа мажор на гитаре:

    Небольшое примечание к аккорду фа мажор, аккорд фа мажор — это сложный аккорд, который бросал вызов гитаристам с незапамятных времен… Если у вас возникли проблемы, попробуйте другое звучание, прочитав эту статью, 8 способов сыграть опасный аккорд фа. на гитаре.(Эта форма, вероятно, самая простая, если вы начинающий гитарист, поскольку она не требует штриховки.)

    • Соль мажор — аккорд соль мажор состоит из нот соль, си и ре.

    Вот как играть соль мажор на гитаре:

    Эти четыре аккорда представляют собой последовательность аккордов I-vi-IV-V в тональности C. С помощью этих четырех аккордов можно сыграть множество популярных песен.

    Другие распространенные аккорды, которые вам понадобятся

    Помимо этих четырех аккордов, вот еще 5 гитарных аккордов, которые часто используются в песнях.

    • Ре мажор – Аккорд ре мажор состоит из нот Ре, Фа# и Ля.
    • Ре минор – Аккорд ре минор состоит из нот ре, фа и ля.
    • Ми мажор – Аккорд ми мажор состоит из нот ми, соль # и си.
    • Ми минор – Аккорд ми минор состоит из нот ми, соль и си.
    • ля мажор – аккорд ля мажор состоит из нот ля, до# и ми.

    Теперь вы можете играть эти песни!

    Запишите все эти гитарные аккорды, и вы сможете сыграть все эти песни! И если вы хотите испытать себя, я пометил некоторые из них, которые включают другие аккорды/вариации, не описанные в этой статье.

    Если сейчас это кажется чрезмерным, не волнуйтесь! Нужно много запоминать, практиковать и совершенствовать. Если вы чувствуете себя подавленным, начните с того, что сосредоточьтесь только на аккордах C, Am, F и G. Эти четверо откроют вам больше всего возможностей начать играть на гитаре.

    Хорошо, что музыка дает нам отправную точку, и еще лучше, что так много запоминающихся песен построены по одному и тому же образцу. Просто продолжайте в том же духе, и вы сможете выпустить несколько хитов на следующей вечеринке!

    DeepFRET, программное обеспечение для быстрой и автоматизированной классификации данных FRET одной молекулы с использованием глубокого обучения

    Основные версии:

    1) Неясно, как предварительная подготовка модели может учитывать бесконечные возможные состояния FRET/время жизни/занятости/пути перехода/шум и т. д.Как это может не искажать результаты, чтобы искать трассы, которые аналогичны SNR и т. Д. Данным обучения? Например, максимальная вероятность перехода между состояниями в обучающем наборе данных, равная 0,2, может сместить анализ в сторону долгоживущих состояний FRET. Авторы должны прокомментировать это.

    Это действительно очень правильный комментарий, и он играет центральную роль в процессе, поскольку существует бесконечное количество возможных перестановок данных FRET, а неправильное обучение модели может привести к необъективному выбору трасс.Мы благодарим рецензентов за то, что они позволили нам прокомментировать это, поскольку это могло быть неясно в рукописи.

    Чтобы внести как можно меньше смещения в сторону конкретных состояний FRET, мы стремились сгенерировать репрезентативную долю всего пространства smFRET, единообразно отбирая большое количество бесконечных возможных перестановок данных ( состояний FRET/времен жизни/занятий/путей перехода/шумов). ) . Чтобы проверить это и дополнительно охарактеризовать данные обучения, мы предприняли ряд осторожных шагов, которые описаны ниже:

    а) FRET состояний и занятости .Количество состояний FRET в данной трассе выбиралось равномерно от 1 до 4 состояний. Каждому состоянию случайным образом присваивалось значение FRET путем равномерной выборки от 0 до 1. Для трасс с более чем одним состоянием требовалось минимальное расстояние 0,1 FRET между состояниями (т. е. случайная равномерная выборка повторялась до тех пор, пока требование не способность отличать фактические переходы от шумовых флуктуаций. Мы проверили, что все состояния FRET, а также занятость 150 тыс. трасс в обучающих данных были равномерно распределены между 0 и 1, как показано на рисунке 1 — дополнение к рисунку 3A.Мы поняли, что это могло быть неясно в исходной заявке, поэтому мы подробно описали это в подразделе «Материалы и методы» «Синтетическая генерация данных smFRET» в исправленной версии. Кроме того, мы исправили легенду к рисунку 1 — дополнение к рисунку 3A на «трассы smFRET были сгенерированы с 1-4 случайно определенными состояниями FRET […]», поскольку из-за ошибки формулировки было указано, что трассы были сгенерированы либо с 1, 2 или 3 говорится в исходном представлении.

    b) Вероятность перехода и время жизни. Мы благодарим рецензентов за то, что они заметили ошибку формулировки в исходной заявке «с вероятностью перехода ниже 0 и 0,2». Вероятность перехода для каждого кадра трассы из заданного состояния в другое равномерно дискретизируется между 0 и 0,2. Вероятности перехода релевантны 90 168 между 90 169 состояниями, так что в системе с 4 состояниями с максимально допустимыми вероятностями перехода 0,2 комбинированная вероятность перехода в любом заданном кадре составляет 0,2 * (4-1 состояния) = 0.6. С другой стороны, в системе с двумя состояниями и вероятностью перехода между состояниями, равной 0,01, комбинированная вероятность перехода в любой заданной системе координат составляет 0,01*(2-1 состояние)=0,01. Таким образом, среднее время жизни вышеупомянутых систем составляет 1/0,6=1,7 кадра и 1/0,01=100 кадра соответственно. Распределение всех обучающих данных за время жизни представляет собой равномерно взвешенное среднее по экспоненциальному спаду для каждого возможного количества состояний FRET и вероятностей перехода, как показано на рисунке 1 — дополнение к рисунку 3B.Моделирование методом Монте-Карло на 10 000 трасс выборки вероятностей перехода равномерно между 0 и 0,2 на 2-4 трассах состояния подтверждает, что наши обучающие данные соответствуют базовой модели (рис. 1 — дополнение к рисунку 3B). Следовательно, мы выбираем широкий диапазон вероятностей перехода, равномерно охватывающий как долгоживущие, так и короткоживущие состояния FRET, стремясь походить на большинство экспериментальных данных, не внося смещения в сторону конкретных времен жизни. Признавая, что это могло быть неясно в рукописи, мы добавили новый рисунок 1 — дополнение к рисунку 3B с распределениями времени жизни и моделированием Монте-Карло вместе с кратким описанием того, как они были получены в подразделе «Материалы и методы» «Синтетический smFRET». генерация данных».

    c) Путь перехода следует цепи Маркова, которая генерируется случайным образом из матрицы перехода с вероятностями, выбранными, как описано выше. Цепь Маркова каждой смоделированной трассы создается с использованием реализации скрытой модели Маркова в пакете Python с открытым исходным кодом под названием pomegranate. Чтобы убедиться, что обучающие данные единообразно отбирают подмножество всех возможных путей перехода, мы построили график плотности перехода для n = 10 000 смоделированных трасс. Это убедительно иллюстрирует совершенно случайный и однородный путь перехода, как и ожидалось.Признавая, что эта важная информация не была реализована в исходной заявке, мы добавили график в качестве нового рисунка 1 — дополнение к рисунку 3C и внесли дополнительные пояснения в подраздел «Материалы и методы» «Синтетическая генерация данных smFRET».

    г) Уровень шума. Экспериментальные данные могут использоваться для выборки широкого диапазона уровней шума в зависимости от биологической системы, инструментов, экспериментальной установки и т. д. Чтобы охватить широкий диапазон возможных уровней шума, мы предприняли следующие шаги: Сначала были сгенерированы интенсивности донора и акцептора для каждой трассы. от базовых истинных значений FRET.Затем к интенсивностям добавлялся шум путем выборки из нормального распределения со значениями σ, равномерно распределенными между 0,01 и 0,30. Для имитации дробового шума сверху был добавлен дополнительный слой гамма-шума с вероятностью 0,8. Чтобы оправдать выбранный диапазон значений σ, мы построили смоделированные распределения FRET при различных уровнях шума, как показано на рис. 1 (дополнение к рисунку 4). конкретного SNR из-за единообразной выборки, поддерживающей наши обучающие данные, и, таким образом, модель не предвзята к конкретному SNR в заданном диапазоне значений σ.Мы разъяснили в исправленной версии как в подразделе «Производительность DeepFRET», так и в разделе «Обсуждение», что в режиме, когда скорости перехода аналогичны временному разрешению изображения, динамические трассы smFRET могут быть неправильно классифицированы моделью как зашумленные. Моделирование трассировки и переобучение модели (или изменение настроек визуализации) решат эту проблему.

    Мы признаем, что, несмотря на наши строгие попытки ввести как можно меньше систематических ошибок путем однородной выборки всех параметров, специализированные пользователи могут иметь лучшее суждение и знание своих конкретных систем, уровней шума, времени жизни состояний или вероятностей перехода среди других параметров.При обучении модели может быть какое-то смещение, определяющее пределы интервалов выборочных параметров. Поэтому, если опытный пользователь хочет адаптировать модель для лучшего удовлетворения своих конкретных потребностей, DeepFRET реализует удобный интерфейс моделирования трассировки, в котором новые трассировки FRET могут быть легко смоделированы на основе заданных пользователем параметров (см. рис. 1 — дополнение к рисунку 6). и используется для переобучения модели DNN по нашим инструкциям (https://github.com/hatzakislab/DeepFRETModel). Мы дополнительно подчеркнули это в новом абзаце в разделе «Обсуждение».

    2) Сравнение DeepFRET с человеческой точностью при выборе «чистых трасс» не кажется подходящим сравнением (и, очевидно, быстрее). Ручной выбор трасс, как правило, больше не является стандартным средством для анализа данных smFRET, учитывая наличие свободно доступных автоматических альтернатив с открытым исходным кодом (например, HAMMY, ebFRET, SPARTAN и т. д.). Сравнение с другими доступными программными пакетами важно, чтобы убедить пользователей в превосходной или, по крайней мере, эквивалентной производительности DeepFRET при автоматическом выборе трасс.Авторы должны включить такое сравнение в исправленную версию рукописи.

    Мы хотели бы подчеркнуть, что основной целью этой рукописи является предоставление интуитивно понятной платформы, требующей минимального вмешательства человека, которая, как прокомментировали рецензенты, «[…] может снизить порог для экспертизы smFRET, позволяя большему количеству ученых воспользоваться преимуществами этого мощного инструмента», вместо того, чтобы доказывать неправоту существующих надежных программных пакетов, разработанных и управляемых экспертами в данной области.Мы также признаем, что ручной выбор трасс не должен быть стандартным средством для анализа данных smFRET, но, несмотря на широкий спектр доступных программных пакетов для анализа данных smFRET, только некоторые из них реализуют расширенную автоматическую сортировку трасс. HAMMY и ebFRET , поскольку рецензенты предложили сосредоточиться на извлечении кинетической скорости и предложить простые пороговые значения, основанные на значениях интенсивности и FRET. Очистка трасс за пределами этих простых порогов часто требует дополнительного ручного выбора. iSMS предлагает более совершенную сортировку по интенсивности донора/акцептора, среднему значению FRET и средней стехиометрии для данных ALEX, а также автоматическое обнаружение фотообесцвечивания. SPARTAN предлагает более широкие возможности автоматической сортировки (всего 26 параметров) и оптимизирован для данных, отличных от ALEX. Однако фактические пороговые критерии могут значительно различаться для каждой группы и экспериментальной системы (Fessl et al., 2018; Gouge et al., 2017; Schärfen and Schlierf, 2019; Tsuboyama et al., 2018; Яо и др., 2015). Специализированные группы хорошо обучены ориентироваться в этих многочисленных критериях и точно определять свои собственные, оптимизированные для работы в их конкретных системах (Aznauryan et al., 2016; Fessl et al., 2018; Gouge et al., 2017; Schärfen and Schlierf, 2019; Цубояма и др., 2018; Ву и др., 2018; Яо и др., 2015). Однако разнообразие этих критериев сортировки может внести ненужную погрешность в и без того сложную серию обработки данных, особенно с учетом того, что появление коммерческих инструментов быстро расширило поле smFRET.

    Чтобы непосредственно ответить на комментарии рецензентов, мы провели два типа экспериментальных проверок. Сначала мы сравнили DeepFRET напрямую с возможностями сортировки HAMMY, ebFRET, SPARTAN и iSMS на смоделированных данных, где достоверность известна. Затем мы сравнили SPARTAN и iSMS, которые имеют расширенные возможности сортировки, с наборами экспериментальных данных, опубликованными другими группами.

    В первом случае мы объединили 200 смоделированных наземных трасс smFRET с 1800 смоделированными трассами без smFRET (рис. 4 — дополнение к рисунку 3A и материалы и методы для распределений FRET и описания параметров, соответственно) и реконструировали tif-файлы, которые соответствовали бы для необработанных данных smFRET.Мы смоделировали как данные ALEX, так и данные без ALEX, поскольку iSMS оптимизирована для данных ALEX, а HAMMY, ebFRET и SPARTAN оптимально работают с данными без ALEX. Файлы tif были загружены в соответствующие программные пакеты и использованы для извлечения и сортировки трасс с использованием показателя качества 0,80 в DeepFRET, параметров сортировки по умолчанию в SPARTAN (кроме порога фонового шума), интенсивности, стехиометрии и порогов FRET в iSMS, порогов интенсивности. в HAMMY и пороги FRET в ebFRET. Мы обнаружили, что DeepFRET, SPARTAN и iSMS восстанавливают базовое распределение FRET наземной истины с различными уровнями детализации, в то время как простая интенсивность и пороговые значения FRET HAMMY и ebFRET требуют дальнейшей сортировки для получения оптимальных результатов.Примечательно, что DeepFRET сортирует трассировки, по крайней мере, так же или даже лучше, чем SPARTAN и iSMS, без какой-либо настройки параметров (рис. 4 — дополнение к рисунку 3B). Мы настоятельно отмечаем, что опытные пользователи смогут точно настроить все возможные пороговые значения, чтобы лучше соответствовать наземным достоверным данным. Однако в реальном эксперименте, где истина неизвестна, задача становится более сложной, а параметры точной настройки могут быть предвзятыми, особенно для неспециализированных пользователей. Единая пороговая классификация, предлагаемая DeepFRET, может иметь решающее значение для большего числа ученых, которые смогут воспользоваться этим инструментом.

    Во втором случае мы сравнили производительность трех программных пакетов, предлагающих расширенную сортировку экспериментальных данных, опубликованных другими группами. Выбор наборов данных без ALEX и ALEX, опубликованных Kilic et al. (Kilic et al., 2018) и Hellenkamp et al. (Hellenkamp et al., 2018), соответственно, обеспечивает надлежащее тестирование в различных настройках FRET и наборах данных. Мы практически использовали настройки по умолчанию в обоих программах и обрезали данные для первых 10 кадров каждой трассы, сводя к минимуму обесцвечивание без использования жесткого порога по умолчанию при FRET <0.2 в СПАРТАНЕ. Наш анализ показывает, что все три пакета программного обеспечения способны воспроизводить опубликованные дистрибутивы FRET из необработанных tif-файлов с небольшими расхождениями (рис. 4 — дополнение к рисунку 4). DeepFRET демонстрирует эквивалентную или превосходящую производительность по сравнению с существующими сложными программными пакетами, в том числе на экспериментальных данных. Мы подчеркиваем, что существующие программные пакеты очень надежны, и опытные пользователи смогут ориентироваться и оптимизировать все необходимые настройки для отдельных наборов данных.Сила DeepFRET заключается в его способности анализировать данные как ALEX, так и не-ALEX воспроизводимым образом, требующим минимального вмешательства человека и, следовательно, минимального опыта в установке пороговых значений, и позволяющих большему количеству ученых воспользоваться преимуществами этого мощного инструмент. Признавая отсутствие сравнения с существующим программным обеспечением, мы добавили новый рисунок 4, дополняющий рисунки 3-4. Мы также переименовали подраздел «Производительность DeepFRET на реальных данных» в «Производительность DeepFRET на реальных данных, сравнение с существующим надежным программным обеспечением для анализа smFRET», а также добавили новый абзац в раздел, в котором явно обсуждается сравнение смоделированных реальных данных и опубликованные данные.

    3) В том же духе лучший способ доказать эффективность анализа трассировки DeepFRET — это взять несколько наборов данных и сравнить анализы HAMMY, ebFRET и т. д. с DeepFRET. Авторы должны включить такой сравнительный анализ более чем одного набора данных в исправленную версию рукописи.

    Чтобы ответить на комментарий рецензентов, мы напрямую сравнили производительность DeepFRET с опубликованными результатами для двух экспериментальных наборов данных (ALEX и не-ALEX) в разных группах (рис. 4 — дополнение к рисунку 4 и ответ на комментарий 2).Мы обнаружили, что DeepFRET смог воспроизвести опубликованные дистрибутивы smFRET, используя простой порог качества 0,80, без дальнейшего вмешательства человека и, кроме того, наравне или лучше, чем существующее программное обеспечение (см. также ответ на комментарий рецензента 2). Эти данные дополнительно подтверждают производительность и мощность DeepFRET по сравнению с другим существующим программным обеспечением, требующим определенных пользователем пороговых значений, которые могут потребовать специальных знаний пользователей. Мы объяснили сравнение в основном тексте и добавили в рукопись новый рисунок 4 — дополнение к рисунку 4.

    4) Было бы полезно, если бы в разделе «Обсуждение» авторы могли обсудить ограничения инструмента. Обсуждение, в котором говорится о случаях, когда их инструмент может дать сбой, будет полезно для исследователей, которые хотят использовать свой инструмент или развивать его. Например, в обсуждении в разделе «Материалы и методы» отмечается, что фотофизические эффекты, которые иногда наблюдаются в экспериментах smFRET, могут быть проблематичными для метода (похоже, что инструмент, скорее всего, классифицирует их как бесполезные следы, даже если они могут отражать «истинный» сигнал из эксперимента [т.е.грамм. наблюдение PIFE в работе от группы TJ Ha]).

    Следуя комментариям рецензентов, мы добавили новый абзац в раздел «Обсуждение», в котором излагаются ограничения текущей версии DeepFRET и то, что можно сделать в будущем для ее улучшения. Как указывалось в предыдущих разделах, DeepFRET точно работает как с смоделированными, так и с экспериментальными двухцветными данными smFRET в нескольких лабораториях. Ограничения, которые обсуждаются в исправленной версии рукописи, могут быть устранены опытными пользователями путем моделирования новых обучающих данных и повторного обучения модели DNN в соответствии с нашими инструкциями (https://github.com/hatzakislab/DeepFRET-Model), как описано в разделе «Материалы и методы».

    Каталожные номера:

    Азнаурян М., Сондергаард С., Ноер С.Л., Шиётт Б., Биркедал В., 2016. Прямой взгляд на сложную многопутевую укладку теломерных G-квадруплексов. Нуклеиновые Кислоты Res. 44, 11024– 11032. doi:10.1093/nar/gkw1010

    Фессл, Т., Уоткинс, Д., Оутли, П., Аллен, В.Дж., Кори, Р.А., Хорн, Дж., Болдуин, С.А., Рэдфорд, С.Е., Коллинсон, И., Тума, Р., 2018. Dynamic действие аппарата Sec во время инициации, транслокации белка и терминации. eLife 7. doi:10.7554/ eLife .35112

    Гоуг, Дж., Гутерц, Н., Крамм, К., Дергай, О., Абаскаль-Паласиос, Г., Сатья, К., Кузен, П., Эрнандес, Н., Громанн, Д., Ваннини, A., 2017. Молекулярные механизмы Bdp1 в сборке TFIIIB и инициации транскрипции РНК-полимеразой III. Нац. коммун. 8, 130.

    doi:10.1038/s41467-017-00126-1

    Schärfen, L., Schlierf, M., 2019. Мониторинг индуцированных белком конформационных изменений ДНК в режиме реального времени с использованием одномолекулярного FRET.Методы 169, 11–20.

    doi:10.1016/j.ymeth.2019.02.011

    Цубояма, К., Тадакума, Х., Томари, Ю., 2018. Конформационная активация аргонавта с помощью различных, но скоординированных действий систем шаперонов hsp70 и hsp90. Мол. Ячейка 70, 722-729.e4. doi:10.1016/j.molcel.2018.04.010

    Ву, С., Лю, Дж., Ван, В., 2018. Анализ ферментативного катализа, модулируемого конформационной динамикой, с помощью одномолекулярного FRET. Дж. Физ. хим. Б 122, 6179–6187.

    doi:10.1021/acs.jpcb.8b02374

    Яо, К., Сасаки, Х.М., Уэда, Т., Томари, Ю., Тадакума, Х., 2015. Одномолекулярный анализ реакции расщепления мишени ферментным комплексом Drosophila RNAi. Мол. Ячейка 59, 125–132. doi:10.1016/j.molcel.2015.05.015

    https://doi.org/10.7554/eLife.60404.sa2

    Санкционная политика — наши внутренние правила

    Эта политика является частью наших Условий использования. Используя любой из наших Сервисов, вы соглашаетесь с этой политикой и нашими Условиями использования.

    Как глобальная компания, базирующаяся в США и осуществляющая операции в других странах, Etsy должна соблюдать экономические санкции и торговые ограничения, включая, помимо прочего, те, которые введены Управлением по контролю за иностранными активами («OFAC») Департамента США. казначейства. Это означает, что Etsy или любое другое лицо, использующее наши Сервисы, не может принимать участие в транзакциях, в которых участвуют определенные люди, места или предметы, происходящие из определенных мест, как это определено такими агентствами, как OFAC, в дополнение к торговым ограничениям, налагаемым соответствующими законами и правилами.

    Эта политика распространяется на всех, кто пользуется нашими Услугами, независимо от их местонахождения. Ознакомление с этими ограничениями зависит от вас.

    Например, эти ограничения обычно запрещают, но не ограничиваются транзакциями, включающими:

    1. Определенные географические области, такие как Крым, Куба, Иран, Северная Корея, Сирия, Россия, Беларусь, Донецкая Народная Республика («ДНР») и Луганская Народная Республика («ЛНР») области Украины, или любой отдельный или юридическое лицо, работающее или проживающее в этих местах;
    2. Физические или юридические лица, указанные в санкционных списках, таких как Список особо обозначенных граждан (SDN) OFAC или Список иностранных лиц, уклоняющихся от санкций (FSE);
    3. Граждане Кубы, независимо от местонахождения, если не установлено гражданство или постоянное место жительства за пределами Кубы; и
    4. Предметы, происходящие из регионов, включая Кубу, Северную Корею, Иран или Крым, за исключением информационных материалов, таких как публикации, фильмы, плакаты, грампластинки, фотографии, кассеты, компакт-диски и некоторые произведения искусства.
    5. Любые товары, услуги или технологии из ДНР и ЛНР, за исключением подходящих информационных материалов и сельскохозяйственных товаров, таких как продукты питания для людей, семена продовольственных культур или удобрения.
    6. Ввоз в США следующих товаров российского происхождения: рыбы, морепродуктов, непромышленных алмазов и любых других товаров, время от времени определяемых министром торговли США.
    7. Вывоз из США или лицом США предметов роскоши и других предметов, которые могут быть определены США.S. Министр торговли, любому лицу, находящемуся в России или Беларуси. Список и описание «предметов роскоши» можно найти в Приложении № 5 к Части 746 Федерального реестра.
    8. Товары, происходящие из-за пределов США, на которые распространяется действие Закона США о тарифах или связанных с ним законов, запрещающих использование принудительного труда.

    Чтобы защитить наше сообщество и рынок, Etsy принимает меры для обеспечения соблюдения программ санкций. Например, Etsy запрещает участникам использовать свои учетные записи в определенных географических точках.Если у нас есть основания полагать, что вы используете свою учетную запись из санкционированного места, такого как любое из мест, перечисленных выше, или иным образом нарушаете какие-либо экономические санкции или торговые ограничения, мы можем приостановить или прекратить использование вами наших Услуг. Участникам, как правило, не разрешается размещать, покупать или продавать товары, происходящие из санкционированных районов. Сюда входят предметы, которые были выпущены до введения санкций, поскольку у нас нет возможности проверить, когда они были действительно удалены из места с ограниченным доступом. Etsy оставляет за собой право запросить у продавцов дополнительную информацию, раскрыть страну происхождения товара в списке или предпринять другие шаги для выполнения обязательств по соблюдению.Мы можем отключить списки или отменить транзакции, которые представляют риск нарушения этой политики.

    В дополнение к соблюдению OFAC и применимых местных законов, члены Etsy должны знать, что в других странах могут быть свои собственные торговые ограничения и что некоторые товары могут быть запрещены к экспорту или импорту в соответствии с международными законами. Вам следует ознакомиться с законами любой юрисдикции, когда в сделке участвуют международные стороны.

    Наконец, члены Etsy должны знать, что сторонние платежные системы, такие как PayPal, могут независимо контролировать транзакции на предмет соблюдения санкций и могут блокировать транзакции в рамках своих собственных программ соответствия.Etsy не имеет полномочий или контроля над независимым принятием решений этими поставщиками.

    Экономические санкции и торговые ограничения, применимые к использованию вами Услуг, могут быть изменены, поэтому участники должны регулярно проверять ресурсы по санкциям. Для получения юридической консультации обратитесь к квалифицированному специалисту.

    Ресурсы: Министерство финансов США; Бюро промышленности и безопасности Министерства торговли США; Государственный департамент США; Европейская комиссия

    Последнее обновление: 18 марта 2022 г.

    ДНК-конструкции Cy3/Cy5 с внутренней меткой демонстрируют значительно повышенную фотостабильность в экспериментах FRET с одной молекулой | Исследование нуклеиновых кислот

    Аннотация

    ДНК-конструкции

    , меченные цианиновыми флуоресцентными красителями, являются важными субстратами для одномолекулярных (см) исследований функциональной активности комплексов белок-ДНК.Ранее мы изучили флуктуации локального остова ДНК репликативной вилки и ДНК-конструкций праймер-матрица, меченных парами хромофоров донор-акцептор Cy3/Cy5 форстеровского резонансного переноса энергии (FRET), и показали, что, в отличие от красителей, связанных «внешне» с основаниями с гибкими Привязи, прямая «внутренняя» (и жесткая) вставка хромофоров в сахаро-фосфатные остовы привела к конструкциям ДНК, которые можно было использовать для изучения внутренних и вызванных белком флуктуаций остова ДНК как с помощью smFRET, так и sm флуоресцентного линейного дихроизма (smFLD).Здесь мы показываем, что эти жестко встроенные хромофоры Cy3/Cy5 также обладают двумя дополнительными полезными свойствами, демонстрируя как высокую фотостабильность, так и минимальное влияние на локальную термодинамическую стабильность конструкций ДНК. Повышенная фотостабильность внутренних меток значительно снижает долю ложноположительных «фоновых» сигналов преобразования smFRET, тем самым упрощая интерпретацию как экспериментов smFRET, так и smFLD, в то время как уменьшенное влияние внутренних зондов на локальную термодинамическую стабильность также вызывает флуктуации, воспринимаемые эти зонды более репрезентативны для ненарушенной структуры ДНК.Мы предполагаем, что маркировка внутреннего зонда может быть полезна при изучении многих систем ДНК-белковых взаимодействий.

    ВВЕДЕНИЕ

    Одномолекулярный резонансный перенос энергии Фёрстера (smFRET) является важным методом изучения локальных конформаций и динамики белков и нуклеиновых кислот (1–5). Одновременно наблюдая за изменениями флуоресценции от пар донорно-акцепторных хромофоров FRET, можно отслеживать в реальном времени колебания относительной ориентации и разделения между сайт-специфически помеченными позициями внутри биомолекулярных комплексов (1,3,6-11).Флуоресцентные хромофорные зонды, которые хорошо подходят для приложений smFRET, должны обладать рядом важных свойств. К ним относятся высокий коэффициент экстинкции, высокий квантовый выход флуоресценции, короткое время жизни триплетного состояния и высокий порог фотохимического повреждения (3,12,13). Цианиновые красители Cy3 и Cy5 в настоящее время являются наиболее широко используемыми хромофорами для применений smFRET, и типичные эксперименты основаны на реагентах, поглощающих кислород и гасящих триплеты, чтобы уменьшить эффекты фотоиндуцированного «мигания» и обесцвечивания триплетов (13–18).Тем не менее, фотодеградация хромофора остается основным ограничивающим фактором в экспериментах smFRET, которые пытаются отслеживать сигналы в течение длительного времени наблюдения (3,12–13,19).

    В общем, фотофизические свойства флуоресцентного хромофора чувствительны к динамике его локального окружения (2,20–22). При электронном возбуждении индуцированная поляризация электронного перехода может сочетаться с колебательными движениями самой молекулы-зонда в дополнение к колебательным движениям ближайших молекул растворителя.Такие колебательные движения стремятся стабилизировать возбужденное электронное состояние и могут управлять последующими релаксационными процессами. Этот эффект известен как «сольватация» флуорофора и может влиять на энергии возбуждения и испускания, формы спектральных линий и квантовые выходы флуоресценции.

    Флуорофоры, которые специфично связаны с биологической макромолекулой, часто используются для исследования локальных изменений в конформации макромолекул с помощью спектроскопических средств (1,3,6). Помимо фотофизических свойств фотостабильность хромофора зависит от его взаимодействия с растворителем.Известно, что низкомолекулярные добавки, которые действуют как «гасители триплетного состояния» (TSQ), такие как β-меркаптоэтанол и тролокс, могут повышать фотостабильность цианиновых красителей за счет сокращения времени их жизни в триплетном состоянии и восстановления в темном состоянии. время. Возбужденные триплетные состояния могут действовать как «ворота» к путям фотоиндуцированной деградации, а активность агентов TSQ, по-видимому, основана на механизме доступности растворителя, индуцированном столкновением (12, 14–16, 23). Например, фотостабильность дуплексных ДНК-конструкций, меченных Cy5, может быть улучшена за счет использования гибкого химического линкера для присоединения «защитной» группы TSQ вблизи места вставки хромофора (12, 24).

    Здесь мы сообщаем об альтернативном подходе к достижению повышенной фотостабильности с помощью ДНК-конструкций, меченных Cy3/Cy5, который может быть легко реализован с использованием стандартных методов мечения и визуализации smFRET. Мы обнаружили, что конструкции ДНК, которые «укрепляют» возбужденное состояние хромофора, тем самым частично отделяя электронный переход как от внутри-, так и от межмолекулярных колебательных мод, проявляют благоприятные фотофизические свойства для экспериментов smFRET. Эксперименты smFRET использовались для изучения фотостабильности четырех различных ДНК-конструкций Cy3/Cy5 (см. рисунок 1 и дополнительную таблицу S1 для структур репликационной вилки и маркировки), чтобы исследовать зависимость фотостабильности от положения зонда, химии маркировки и локальной конформации. стабильность ДНК.Образцы ДНК, которые мы исследовали, могут быть приобретены на коммерческой основе (например, у Integrated DNA Technologies, Inc.) и могут быть собраны в разветвленные конструкции и конструкции праймер-матрица для изучения «дышащих» свойств самой конструкции разветвления ДНК, а также для образуют субстраты для изучения механизмов геликазы и полимеразы и их взаимодействия с их мишенями из нуклеиновых кислот.

    Рисунок 1.

    ДНК-конструкции, меченные Cy3/Cy5, использованные в этих исследованиях. ( A ) Хромофоры Cy3 и Cy5 присоединены к тиминовым основаниям на противоположных цепях с помощью гибкого линкера из 16 атомов.Поскольку хромофоры расположены снаружи дуплекса ДНК, субстрат обозначается как ДНК, меченная дуплексом eCy3/eCy5. ( B ) Хромофоры Cy3 и Cy5 жестко включены в основу сахаро-фосфатной ДНК с использованием фосфорамидитной химии. Субстрат с внутренней меткой обозначается как «ДНК с дуплексной меткой iCy3/iCy5». ( C ) В этой ДНК-конструкции праймер/матрица (p/t) хромофор Cy3 присоединен к 3′-концу цепи праймера, а хромофор Cy5 расположен внутри матричной цепи рядом с соединением p/t .Этот субстрат обозначается как «меченая ДНК endCy3/iCy5 p/t». ( D ) Хромофоры Cy3 и Cy5 расположены внутри в месте соединения одноцепочечной и двухцепочечной вилки репликации ДНК. Субстрат обозначается как «меченная вилкой iCy3/iCy5» ДНК.

    Рис. 1.

    ДНК-конструкции, меченные Cy3/Cy5, использованные в этих исследованиях. ( A ) Хромофоры Cy3 и Cy5 присоединены к тиминовым основаниям на противоположных цепях с помощью гибкого линкера из 16 атомов. Поскольку хромофоры расположены снаружи дуплекса ДНК, субстрат обозначается как ДНК, меченная дуплексом eCy3/eCy5.( B ) Хромофоры Cy3 и Cy5 жестко включены в основу сахаро-фосфатной ДНК с использованием фосфорамидитной химии. Субстрат с внутренней меткой обозначается как «ДНК с дуплексной меткой iCy3/iCy5». ( C ) В этой ДНК-конструкции праймер/матрица (p/t) хромофор Cy3 присоединен к 3′-концу цепи праймера, а хромофор Cy5 расположен внутри матричной цепи рядом с соединением p/t . Этот субстрат обозначается как «меченая ДНК endCy3/iCy5 p/t».( D ) Хромофоры Cy3 и Cy5 расположены внутри в месте соединения одноцепочечной и двухцепочечной вилки репликации ДНК. Субстрат обозначается как «меченная вилкой iCy3/iCy5» ДНК.

    В исследованиях одиночных молекул эти конструкции нуклеиновых кислот обычно прикрепляются к покровным стеклам микроскопа с использованием стандартных биохимических методов, которые включают покрытие поверхностей кварца функционализированным полиэтиленгликолем (ПЭГ) и использование биотин/нейтравидиновых связей для прикрепления конструкций к ПЭГ. (3,10,11).Представленные здесь результаты показывают, что зонды с внутренней меткой гораздо более устойчивы к фотоповреждениям и демонстрируют резко уменьшенные «фоновые» колебания сигнала по сравнению с зондами, прикрепленными «внешне», что делает их полезными в экспериментах smFRET и sm Fluorescent Linear Dichroism (smFLD), которые требуют мониторинга движений остова ДНК в течение длительных периодов времени. В «Обсуждении» мы рассматриваем возможные механистические объяснения повышенной фотостабильности и локальной термодинамической стабильности, обеспечиваемой этими внутренними зондами, и предлагаем, как эти свойства могут сделать их полезными и при изучении других макромолекулярных систем.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    smFRET эксперименты

    Мы использовали изготовленный на заказ инструмент smFRET и методы подготовки образцов, как описано в другом месте (11). Вкратце, мы выполнили измерения smFRET с использованием призменного флуоресцентного микроскопа полного внутреннего отражения. Флуоресценцию визуализировали с использованием масляного иммерсионного объектива 100× NA = 1,4 (Plan Apo, Nikon) и фильтровали с помощью длиннополосного фильтра (BLP01–532R-25, Semrock, Rochester, NY).Флуоресценция хромофоров Cy3 (донор) и Cy5 (акцептор) была пространственно разделена с использованием коротких путей пучка и минимального количества пропускающих оптических компонентов. Флуоресцентное изображение было направлено на дихроичное зеркало (FF650-Di01–25×36, Семрок, Рочестер, Нью-Йорк), которое было расположено на входе оптики с разделением лучей, которая была устроена так же, как в интерферометре Sagnac . Дихроичное зеркало создавало два встречных световых пути (донорная и акцепторная флуоресценция) с использованием двух широкополосных диэлектрических зеркал (BB1-E02, Thorlabs, Newton, NJ).Каждое изображение проецировалось на половину активной области камеры с электронным умножением и зарядовой связью (EM-CCD, iXon DV897-BB, 512 × 512 пикселей, Andor Technology, Белфаст).

    Микрожидкостные камеры для образцов были сконструированы путем пипетирования 1,5 мкл капли стандартного буферного раствора на кварцевое предметное стекло, покрытое ПЭГ. Покровное стекло (∼10 мм × 24 мм) было помещено поверх предметного стекла стороной, покрытой ПЭГ, обращенной внутрь, и поверхности были загерметизированы с помощью 5-минутного эпоксидного клея. Таким образом, камера для образца толщиной ~10 мкм может быть подготовлена ​​без возникновения сферической аберрации, которая становится проблемой, когда толщина проточной ячейки превышает несколько десятков микрон при использовании масляной иммерсионной линзы.Тефлоновая (ПТФЭ) трубка (TT26, 0,914 мм Н.Д., Weico Wire & Cable, Edgewood, NY) была подсоединена к предварительно просверленным отверстиям в предметном стекле и загерметизирована эпоксидной смолой. После высыхания камеры для образцов во входную трубку вводили аликвоту 50 мкл нейтравидина с концентрацией 0,1–0,2 мг/мл (Thermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс) и инкубировали в течение 2–3 минут перед промывкой стандартным буфером.

    Функционализированные нити ДНК были приобретены у компании Integrated DNA Technologies (Коралвилл, Айова), как показано на рисунке 1 (см. дополнительную таблицу S1 для последовательностей оснований ДНК).ДНК-конструкции отжигали путем нагревания до ∼90°C в течение 3–4 мин, а затем медленно охлаждали до комнатной температуры (∼22°C). Отожженные конструкции разводили до концентрации 50–100 пМ, аликвоту 50 мкл вносили в камеру для образцов и инкубировали 2–3 мин. Несвязавшиеся молекулы ДНК отмывали стандартным буферным раствором.

    Все наши эксперименты с одной молекулой проводились с использованием стандартного буфера для визуализации (10 мМ Трис при рН 8,0, 100 мМ NaCl, 6 мМ MgCl 2 ).Эти растворы содержали систему поглощения кислорода и тушения триплетов [165 ед/мл глюкозооксидазы (Sigma), 0,8% (вес/объем) D-глюкозы (Sigma), 2170 ед/мл каталазы (Sigma) в насыщенном (≥2 mM) Trolox (Sigma)], который, как было показано, хорошо работает с хромофорной системой Cy3/Cy5 smFRET, используемой в наших экспериментах (3,10,11,14). Для типичного запуска сбора данных последовательные изображения были записаны с интервалом 100 мс в течение 2 минут. Отдельные кадры изображений содержали в среднем около 400 признаков одиночных молекул Cy3 (донор)/Cy5 (акцептор), которые анализировались с использованием программного обеспечения, написанного на языке программирования IDL.Эти данные были использованы для построения зависимых от времени траекторий одиночных молекул для интенсивностей донорно-акцепторных хромофоров I D и I A , что позволило рассчитать эффективность smFRET, которая определяется как I A /( I D + I A ). Мы обозначаем резкое падение значения эффективности FRET, соответствующее одновременному уменьшению I A и увеличению I D , как событие преобразования FRET.’

    Постоянная времени фотообесцвечивания, τ B , обнаруженного количества пар FRET была определена путем подгонки данных к одному экспоненциальному затуханию с использованием программного обеспечения Origin (Нортгемптон, Массачусетс) (рис. 3, таблица 1 и дополнительные Рисунок S3).

    Рисунок 2.

    Влияние «внутреннего» по сравнению с «внешним» мечением Cy3/Cy5 на спектры CD полностью отожженных конструкций вилки репликации ДНК и составляющих цепей одноцепочечной ДНК. ( A ) Дуплексная ДНК-конструкция, меченная iCy3/iCy5, демонстрирует большой сигнал CD вблизи максимума поглощения зонда (красная кривая), что указывает на то, что хромофоры жестко закреплены внутри дуплексного сахаро-фосфатного остова.Напротив, не наблюдалось значительного сигнала CD для отдельных цепей одноцепочечной ДНК, меченных iCy3 и iCy5 (зеленая и синяя кривые соответственно), а также для полностью отожженных конструкций дуплексной ДНК, меченных eCy3 и eCy5 (желтая кривая). Все конструкции измеряли при концентрации молекул ДНК 5 мкМ. ( B ) Спектры КД внутренне и внешне меченных конструкций Су3/Су5-дцДНК при λ < 300 нм и концентрациях 1 мкМ показывают, что пары оснований дуплексных частей конструкций ДНК остаются полностью сложенными в присутствии либо внутренние или внешние зонды красителя Cy3/Cy5, и что присутствие зонда любого типа существенно не нарушает общую конформацию B-формы дуплексных областей.

    Рисунок 2.

    Влияние «внутреннего» по сравнению с «внешним» мечением Cy3/Cy5 на спектры CD полностью отожженных конструкций вилки репликации ДНК и составляющих цепей одноцепочечной ДНК. ( A ) Дуплексная ДНК-конструкция, меченная iCy3/iCy5, демонстрирует большой сигнал CD вблизи максимума поглощения зонда (красная кривая), что указывает на то, что хромофоры жестко закреплены внутри дуплексного сахаро-фосфатного остова. Напротив, не наблюдалось значительного сигнала CD для отдельных цепей одноцепочечной ДНК, меченных iCy3 и iCy5 (зеленая и синяя кривые соответственно), а также для полностью отожженных конструкций дуплексной ДНК, меченных eCy3 и eCy5 (желтая кривая).Все конструкции измеряли при концентрации молекул ДНК 5 мкМ. ( B ) Спектры КД внутренне и внешне меченных конструкций Су3/Су5-дцДНК при λ < 300 нм и концентрациях 1 мкМ показывают, что пары оснований дуплексных частей конструкций ДНК остаются полностью сложенными в присутствии либо внутренние или внешние зонды красителя Cy3/Cy5, и что присутствие зонда любого типа существенно не нарушает общую конформацию B-формы дуплексных областей.

    Рис. 3.

    Количество обнаруженных пар хромофоров Cy3/Cy5 FRET в фиксированной области изображения в зависимости от времени непрерывного освещения образца. ( A ) Мощность лазера была установлена ​​на ~ 22 мВт. Каждая из четырех конструкций ДНК демонстрировала экспоненциальную фотодеградацию, зависящую от времени, со временем жизни τ B , которое зависит от положения сайта встраивания хромофора и химического состава. Обратите внимание, что различные субстраты обозначены схематически.( B ) Результаты для конструкции ДНК, меченной дуплексом iCy3/iCy5, показаны в зависимости от мощности лазерного возбуждения.

    Рис. 3.

    Количество обнаруженных пар хромофоров Cy3/Cy5 FRET в фиксированной области изображения в зависимости от времени непрерывного освещения образца. ( A ) Мощность лазера была установлена ​​на ~ 22 мВт. Каждая из четырех конструкций ДНК демонстрировала экспоненциальную фотодеградацию, зависящую от времени, со временем жизни τ B , которое зависит от положения сайта встраивания хромофора и химического состава.Обратите внимание, что различные субстраты обозначены схематически. ( B ) Результаты для конструкции ДНК, меченной дуплексом iCy3/iCy5, показаны в зависимости от мощности лазерного возбуждения.

    Постоянные времени затухания, определенные из экспериментов по фотообесцвечиванию, показанных на рис. 3, и активности преобразования FRET, включая разделение между необратимыми и обратимыми событиями, как показано на рис. 5
    Таблица 1. Постоянные времени затухания, определенные из экспериментов по фотообесцвечиванию, показанных на рисунке 3, и активности преобразования FRET, включая разделение между необратимыми и обратимыми событиями, как показано на рисунке 5.
    log N в зависимости от времени . Наклон линии наилучшего соответствия . . С.Д. . Р 2 . +
    eCy3 / eCy5 дуплекс ДНК-меченые -0,0976 0,0015 0,996
    iCy3 / iCy5 дуплекс ДНК-меченые -0,0285 0,0003 0.996
    endCy3 / iCy5 р / т-меченого ДНК -0,0819 0,0015 0,994
    iCy3 / iCy5 вилка-меченого ДНК -0,0488 0.0009 0,991
    iCy3 / iCy5 дуплекс ДНК-меченые б -0,0158 0,0003 0,993
    iCy3 / iCy5 дуплекс ДНК-меченый с -0.0085 0,0001 0,0001 0.994
    Однократное экспоненциальное время и цены 120457 τ B (мин) K B (мин -1 ) T 1/2 (мин)
    ECY3 / ECY5 Дуплекс ДНК A 4,6 0.217 3.2
    Endcy3 / Icy5 P / T-меченая ДНК A   5.3 0,189 3,7
    iCy3 / iCy5 вилка-меченого ДНК- 8,9 0,112 6,2
    iCy3 / iCy5 дуплекса-меченого ДНК- 15,0 0,066 10,4
    iCy3 / iCy5 дуплекс-меченый ДНК б 27,0 0,037 18,7
    iCy3 / iCy5 дуплекс-меченый ДНК с 34.4 0,029 23,8
    Анализ преобразования FRET Всего FRET общая FRET (%) Необратимая FRET (%) S.D. безвозвратный FRET (%) Реверсивный FRET (%) S.D. переворачивает. FRET (%)
    ECY3 / ECY5 A 37.7 2,81 2,81 31.9 3.26 5,8 1.66
    iCy3 / iCy5 дуплекса 0,8 0,36 0,5 0,37 0,3 0,35
    endCy3 / iCy5 17,9 4,55 14,7 3.35 3.2 3.2 1.31
    ICY3 / ICY5 Fork 11.9 1.61 9.1 2,49 2,8 0.91 
    C
    log N в зависимости от времени . Наклон линии наилучшего соответствия . . С.Д. . Р 2 .
    ECY3 / ECY5 двусторонняя ДНК A -0457 0.0015 0.0015
    ICY3 / ICY5 Дуплексная ДНК A -0.0285 от 0,0003 0,996
    endCy3 / iCy5 р / т-меченого ДНК -0,0819 0,0015 0,994
    iCy3 / iCy5 вилка-меченого ДНК- -0.0488 0,0009 0,0009 0.991
    ICY3 / ICY5 Дуплексная ДНК B -0.0158 0,0003 0.993
    ICY3 / ICY5 Дуплекс-меченая ДНК C -0.00857 — 0,0001 0,0001 0,0001 0.994
    Однократное экспоненциальное время и цены и цены τ B (мин) K B (мин -1 ) T T 1/2 (мин)
    ECY3 / ECY5 Дуплекс ДНК A 4,6 0 .217 3.2 3.2
    Endcy3 / ICY5 P / T-Meaded DNA A 5.3 0.189 3
    ICY3 / ICY5 FORK-MOATED DNA A 8.9 0.112 6.2 6.2
    ICY3 / ICY5 Дуплекс ДНК A 9048 0.066 10.04
    ICY3 / ICY5 DUPLEX TO DNE B 27.0 0,037 18,7
    iCy3 / iCy5 дуплекса-меченого ДНК с 34,4 0,029 23,8
    Анализ преобразования FRET Итого FRET ( %) С.Д. общая FRET (%) Необратимая FRET (%) S.D. безвозвратный FRET (%) Реверсивный FRET (%) S.D. переворачивает. FRET (%)
    eCy3/eCy5 a   37.7 2,81 31,9 3,26 5,8 1,66
    iCy3 / iCy5 дуплекса 0,8 0,36 0,5 0,37 0,3 0,35
    endCy3 / ICY5 17.9 4.55 14.7 14.7 3.35 3.2 1.31
    Icy3 / Icy5 Fork A 11.9 1.61 1.61 9.1 9.1 2.49 2.49 2,8 0.91 0.91
    Таблица 1. Отсутствуют константы времени, определенные из экспериментов по фото-отбеливанию, показанные на рисунке 3 и активность преобразования FROT, включая разбиение между необратимыми и обратимыми событиями, как показано на рисунке 5 0015 +0,994 T
    log N в зависимости от времени . Наклон линии наилучшего соответствия . . С.Д. . Р 2 .
    eCy3 / eCy5 дуплекс ДНК-меченые -0,0976 0,0015 0,996
    iCy3 / iCy5 дуплекс ДНК-меченые -0,0285 0,0003 0,996
    endCy3/iCy5 p/t-меченая ДНК a -0,0819 0,0457
    iCy3 / iCy5 вилка-меченого ДНК -0,0488 0,0009 0,991
    iCy3 / iCy5 дуплекса ДНК-меченого б -0,0158 0,0003 0,993
    iCy3 / iCy5 дуплекс ДНК-меченые с -0,0085 0,0001 0,994
    Одиночной экспоненциальное время и константа скорости τ B (min) K B (мин -1 ) T 1/2 (MIN)
    ECY3 / ECY5 Дуплекс ДНК A 4 .6 0.217 3.2
    Endcy3 / ICY5 P / T-MARECED DNA A 5.3 0.189 3,7
    3
    ICY3 / ICY5 FORK-MOARED DNA A 8,9 0,112 6,2
    iCy3 / iCy5 дуплекс-меченый ДНК- 15,0 0,066 10,4
    iCy3 / iCy5 дуплекс-меченый ДНК б 27.0 0,037 18,7
    iCy3 / iCy5 дуплекса-меченого ДНК с 34,4 0,029 23,8
    Анализ преобразования FRET Итого FRET ( %) С.Д. общая FRET (%) Необратимая FRET (%) S.D. безвозвратный FRET (%) Реверсивный FRET (%) S.D. переворачивает. FRET (%)
    eCy3/eCy5 a   37.7 2,81 31,9 3,26 5,8 1,66
    iCy3 / iCy5 дуплекса 0,8 0,36 0,5 0,37 0,3 0,35
    endCy3 / ICY5 17.9 4.55 14.7 14.7 3.35 3.2 1.31
    Icy3 / Icy5 Fork A 11.9 1.61 9.1 9.1 2.49 2.8 0,91 0,91
    (мин)
    Log N против времени . Наклон линии наилучшего соответствия . . С.Д. . Р 2 .
    ДНК, меченная дуплексом eCy3/eCy5 a -0,0976 0.0015 0, 0,996
    ICY3 / ICY5 Дуплекс-меченая ДНК -0457 0,0003 0,0003 0.996
    Endcy3 / Icy5 P / T-Meaded DNA A -0.0819 0,0015 0,994
    iCy3 / iCy5 вилок-меченый ДНК -0,0488 0,0009 0,991
    iCy3 / iCy5 дуплекс ДНК-меченые б −0.0158 от 0,0003 0,993
    iCy3 / iCy5 дуплекса ДНК-меченого с -0,0085 0,0001 0,994
    Одиночные экспоненциальное время и константы скорости τ B (мин) K B (мин -1 ) T 1/2 (мин)
    ECY3 / ECY5 Дуплекс ДНК A 4.6 0.217 3.2
    Endcy3 / ICY5 P / T-MARECED DNA A 5.3 0.189 3,7
    3
    ICY3 / ICY5 FORK-MOARED DNA A 8,9 0,112 6,2
    iCy3 / iCy5 дуплекс-меченый ДНК- 15,0 0,066 10,4
    iCy3 / iCy5 дуплекс-меченый ДНК б 27.0 0,037 18,7
    iCy3 / iCy5 дуплекса-меченого ДНК с 34,4 0,029 23,8
    Анализ преобразования FRET Итого FRET ( %) С.Д. общая FRET (%) Необратимая FRET (%) S.D. безвозвратный FRET (%) Реверсивный FRET (%) S.D. переворачивает. FRET (%)
    eCy3/eCy5 a   37.7 2,81 31,9 3,26 5,8 1,66
    iCy3 / iCy5 дуплекса 0,8 0,36 0,5 0,37 0,3 0,35
    endCy3 / ICY5 17.9 4.55 14.7 14.7 3.35 3.2 1.31
    Icy3 / Icy5 Fork A 11.9 1,61 9,1 2,49 2,8 0,91

    конструкции ДНК были собраны и отожжены путем смешивания 1 мкМ биотинилированной лидирующей цепи и 1 мкМ небиотинилированной отстающей цепи в соотношении 1:1 в различных буферах. Растворы нагревали до 90°С в течение 3–4 мин, а затем медленно охлаждали до комнатной температуры (∼22°С). Затем отожженные конструкции разбавляли до концентрации 500 нМ для измерения поглощения при 260 нм с использованием спектрофотометра Cary Model 3E в ультрафиолетовом (УФ)/видимом (VIS) спектрофотометре, который был снабжен регулятором температуры Пельтье.Образцы нагревали со скоростью 1°С/мин от 15°С до 85°С и измеряли оптическую плотность с интервалами в 1°С.

    Эксперименты с круговым дихроизмом

    конструкции ДНК были собраны и отожжены, как описано в предыдущем разделе. Концентрации конструкции ДНК для измерений кругового дихроизма (CD) составляли 5 мкМ или 1 мкМ (рисунок 2 и дополнительная таблица S1), а измерения проводились при комнатной температуре при постоянном потоке газообразного азота и в стандартном буфере для изображений (10 мМ Трис при рН 8.0, 100 мМ NaCl и 6 мМ MgCl 2 ). Спектры КД измеряли между λ = 200 и 750 нм с использованием CD-спектрометра Jasco модели J-720 (Токио, Япония), оснащенного терморегулируемым держателем кювет. Спектры КД записывали при скорости сканирования 100 нм/мин.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    «Внешне меченые» ДНК-конструкции

    Первый образец, который мы исследовали, представлял собой стандартную конструкцию для анализа геликазы с «внешней меткой», включающую вилку репликации модельной ДНК с хромофорами Cy3 и Cy5, прикрепленными к основаниям на противоположных цепях с использованием гибких линкеров (см. дополнительную таблицу S1 и рисунок S1 в дополнительной информации) .Меченые основания в этом образце хорошо расположены в стабильной дуплексной области конструкции (рис. 1А). Линкер, который связывал внешние зонды с основаниями (дополнительная фигура S1), состоял из алифатической цепи из 16 атомов, что позволяло цианиновым красителям выходить за пределы основных борозд дуплекса и, в принципе, свободно пробовать широкий диапазон ориентационных конформации. Спектры поглощения внешне меченых пар красителей, прикрепленных к конструкциям ДНК при двух разных концентрациях конструкции, показаны на дополнительном рисунке S2 и демонстрируют, что красители присутствуют в конструкциях и не нарушаются зависимыми от концентрации взаимодействиями между конструкциями.Отсутствие спектра CD в видимой области длин волн (рис. 2А) указывает на то, что внешне меченые хромофорные зонды в этих конструкциях не удерживаются в фиксированной конформации, а, вероятно, подвижны и неупорядочены. В то же время наличие нормального спектра КД В-формы в УФ-диапазоне (рис. 2Б) подтверждает, что эти внешние зонды существенно не нарушают общую структуру дуплекса ДНК (25–26).

    Этот метод внешней маркировки обычно используется при подготовке ДНК-конструкций для исследований ДНК и ДНК-белковых взаимодействий с участием одной молекулы, отчасти для того, чтобы свести к минимуму опасения, что присутствие нормального спаривания оснований и стекинга в конструкциях может неблагоприятно повлиять на присутствие хромофоров, а также способствовать свободному вращению зондов в анализах FRET, что часто предполагается при расчете расстояния передачи энергии Фёрстера.В частности, такие ДНК-конструкции с внешней меткой часто использовались в исследованиях одиночных молекул реакций раскручивания нуклеиновых кислот, катализируемых геликазой (4–5). Поскольку зонды «внешне» связаны с областью дуплекса ДНК, мы называем конструкции ДНК, подобные показанным на рисунке 1А, «мечеными дуплексом eCy3/eCy5».

    ДНК-конструкции с внутренней меткой

    Наш второй класс ДНК-конструкций был похож на первый с точки зрения состава оснований и последовательности, но здесь цианиновые красители были жестко включены в сахаро-фосфатный остов в качестве «внутренних» зондов с использованием фосфорамидитной химии (рис. 1В) (11, 27).Доказательством того, что эти внутренние хромофоры являются структурно жесткими внутри спирального дуплекса, являются хорошо развитые спектры КД, полученные в видимой области этих образцов (рис. 2А), а также результаты предыдущих исследований (10–11). Снова измерения КД в УФ подтверждают, что хромофорные зонды существенно не нарушают дуплексную структуру конструкций ДНК (рис. 2В), а исследования раскручивания показали, что эти «внутренние» хромофоры не препятствуют значительно прохождению (по крайней мере) Т4. примосомная геликаза через конструкцию вилки репликации (11).Кроме того, жесткое включение хромофоров-зондов в сахаро-фосфатный остов в этих образцах имело центральное значение для экспериментов, которые использовались для обнаружения «дыхательных» движений остова ДНК в микросекундных масштабах времени с помощью комбинации smFRET и флуоресцентного обнаружения. линейный дихроизм (смЛД) (10). Поскольку хромофоры зонда связаны «внутри» в области дуплекса ДНК, мы называем такие образцы ДНК-конструкциями, меченными дуплексом iCy3/iCy5.

    ДНК-конструкции праймер-матрица и разветвление

    Хромофоры Cy3/Cy5 были помещены близко к соединению праймер/матрица (p/t) (рис. 1C) в образцах третьего класса.Здесь донорный хромофор Су3 был присоединен к 3′-концу цепи праймера, а акцепторный хромофор Су5 был включен в сахарофосфатный остов матричной цепи в «положении +1» относительно p/t-перехода (28). ). Мы называем эти образцы ДНК-конструкциями «endCy3/iCy5 p/t junction-меченые». В последнем классе конструкций, собранных в модели репликационных вилок, зонды Cy3/Cy5 были вставлены в сахаро-фосфатный остов в положениях, близких к соединению вилки одноцепочечной и двухцепочечной ДНК (рис. 1D) (10).Мы называем эти образцы ДНК-конструкциями «iCy3/iCy5, мечеными вилкой».

    Фотостабильность зонда в зависимости от среды конструкции ДНК

    Мы использовали прибор smFRET призменного типа для наших исследований характеристик фотостабильности (11). Различные конструкции ДНК, изображенные на рис. 1, растворяли в стандартном буфере для визуализации, содержащем реагенты для поглощения кислорода и гашения триплетов, и непрерывно освещали лазером с длиной волны 532 нм при мощности 10–22 мВт (3, 14).В наших экспериментах с одиночными молекулами флуоресценция Cy3/Cy5 примерно 400 ДНК-конструкций одновременно отслеживалась с использованием системы визуализации с разделенным экраном (11). Из анализа этих данных мы определили время, необходимое для фотодеградации хромофора Cy3, отслеживая изменения количества одиночных хромофоров, обнаруженных в фиксированной области изображения, в зависимости от времени.

    Для всех вышеперечисленных образцов мы обнаружили, что количество активных хромофоров Cy3 экспоненциально уменьшалось в течение нескольких минут с характерным временем фотообесцвечивания, τ B , которое зависело как от используемой химии мечения, так и от положение места вставки в конструкции (рис. 3, дополнительная таблица S1 и дополнительная фигура S1, а также дополнительные фигуры S4-S8).Мы изучили влияние «внешнего» и «внутреннего» химического мечения на фотостабильность хромофора, сравнив результаты, полученные с конструкцией ДНК, меченной дуплексом eCy3/eCy5, с результатами, полученными с конструкцией, меченной дуплексом iCy3/iCy5. Мы обнаружили, что фотодеградация Cy3 происходила почти в три раза быстрее для конструкции дуплекса ДНК с внешней меткой, чем для эквивалентной конструкции с внутренней меткой. Далее мы изучили влияние изменения положения зонда и места вставки для других конструкций ДНК с внутренней меткой (рис. 1C и D).На фигуре 3A показано, что для конструкции ДНК, меченной вилкой iCy3/iCy5, мы получили время фотообесцвечивания, которое было значительно сокращено по сравнению с конструкцией ДНК, меченной дуплексом iCy3/iCy5. Для конструкции, меченной p/t соединением end-Cy3/iCy5, время фотообесцвечивания было таким же, как и для конструкции ДНК с внешней меткой.

    Мы отмечаем, что сходство между временем фотообесцвечивания конструкции ДНК, меченной дуплексом eCy3/eCy5, и конструкции ДНК, меченной p/t соединением endCy3/iCy5, согласуется с идеей о том, что структурная жесткость зонда в месте вставки положение сайта может быть основным фактором, который контролирует фотостабильность этих образцов.Кроме того, и, возможно, вопреки ожиданиям, основанным на модели дезактивации, индуцированной столкновениями в возбужденных триплетных состояниях (12, 14–15), наши результаты предполагают, что жесткое включение хромофоров в сахаро-фосфатный скелет и последующее разъединение электронный переход от локальных колебательных движений — может значительно повысить фотостабильность хромофора. Этот эффект был еще более выражен, когда зонды были жестко включены в стабильный дуплекс ДНК. Мы проверили зависимость фотостабильности зондов от мощности падающего лазера для конструкции ДНК, меченной дуплексом iCy3 / iCy5 (рис. 3B и дополнительный рисунок S3), и от локальной стабильности дуплекса ДНК.Как показано на рисунке 3, снижение входной мощности лазера с 22 мВт до 10 мВт значительно увеличило срок службы фотоотбеливания. Таким образом, мы подчеркиваем, что сигналы smFRET от конструкции ДНК, меченной дуплексом iCy3 / iCy5, можно отслеживать без значительной фотодеградации в течение периодов до 1 часа с использованием непрерывного освещения с падающей мощностью ~ 10 мВт (рисунок 3B и дополнительная фигура S8) .

    «Обратимые» и «необратимые» события преобразования FRET

    В экспериментах smFRET событие преобразования FRET — т.е.е. уменьшение сигнала акцептора Cy5, совпадающее с увеличением сигнала донора Cy3, часто интерпретируется как биологически значимое событие, такое как изменение конформации макромолекул, процесс раскручивания, управляемый геликазой, событие сворачивания или разворачивания белка и т. д. Например, в условиях, в которых скорость фотодеградации аналогична скорости ожидаемого конформационного изменения, событие фотообесцвечивания Cy5 может быть ошибочно идентифицировано как конформационный переход, поскольку оба процесса приводят к идентичным изменениям в smFRET. сигнал.Тем не менее ожидается, что событие фотообесцвечивания приведет к «необратимому» изменению smFRET, в то время как локальные конформационные флуктуации должны быть «обратимыми». химия мечения и положение сайта вставки в зависимости от скорости спонтанных событий преобразования smFRET.

    Для каждого из образцов меченых конструкций, которые мы исследовали, мы определили процент отдельных конструкций ДНК, которые подверглись одному или нескольким событиям преобразования FRET в течение периода ~120 с, в то время как область образца непрерывно освещалась с использованием мощности падающего лазера ~22 мВт. .На рисунке 4 мы показываем три примера зависящих от времени интенсивностей сигналов smFRET, записанных от конструкции ДНК, меченной дуплексом eCy3/eCy5. Когда пары Cy3/Cy5 FRET сильно связаны, мы ожидаем, что сигнал от акцепторного хромофора Cy5 будет относительно большим, в то время как сигнал от донорного хромофора Cy3 будет относительно небольшим. Для трасс, показанных на верхней панели рисунка 4, событие преобразования FRET произошло около 13-секундной «метки», за которой вскоре последовало восстановление сигнала FRET до исходного значения на 15-секундной отметке.Позже в том же наборе данных произошло второе событие преобразования FRET (около 37-секундной отметки). В отличие от первого события преобразования FRET, это второе событие не восстановилось в течение периода наблюдения ~120 с.

    Рисунок 4.

    Образцы траекторий smFRET для конструкции ДНК, меченной дуплексом eCy3/eCy5. Траектории записывались с интервалом ~120 с. Траектория, показанная на верхней панели, демонстрирует «обратимое» преобразование FRET на отметке 13 с.Позже по той же траектории происходит «необратимое» преобразование, связанное с фотообесцвечиванием хромофоров Су3 и Су5. На средней и нижней панелях показаны примеры траекторий, которые демонстрируют наиболее часто наблюдаемые события фотообесцвечивания.

    Рисунок 4.

    Образцы траекторий smFRET для ДНК-конструкции, меченной дуплексом eCy3/eCy5. Траектории записывались с интервалом ~120 с. Траектория, показанная на верхней панели, демонстрирует «обратимое» преобразование FRET на отметке 13 с.Позже по той же траектории происходит «необратимое» преобразование, связанное с фотообесцвечиванием хромофоров Су3 и Су5. На средней и нижней панелях показаны примеры траекторий, которые демонстрируют наиболее часто наблюдаемые события фотообесцвечивания.

    Исследование наших данных показало, что всякий раз, когда происходит изменение направления события smFRET, оно происходит в течение нескольких секунд после первоначального процесса передачи. С целью разделения двух типов процессов мы определили «обратимое» событие как событие, которое восстанавливается в течение примерно 20 с после начального процесса.Считается, что такие обратимые изменения сигнала отражают некоторую достаточно долгоживущую форму (формы) локального «дыхания» ДНК, термически управляемый процесс, посредством которого последовательности двухцепочечных (дц) молекул ДНК временно принимают локально «открытые» конформации, которые отклоняются от их наиболее стабильные структуры и могут частично обнажать внутренние одноцепочечные (ss) матричные последовательности ДНК (10, 28–30). На средней и нижней панелях рисунка 4 показаны примеры событий преобразования smFRET, которые были идентифицированы на этом основании как «необратимые» — т.е.е. как те процессы, в которых произошли лежащие в основе процессы обесцвечивания донорных и акцепторных хромофоров. Ожидается, что дыхание ДНК будет значительно сильнее вблизи разветвлений ss-ds ДНК и соединений p/t, где стекинг пар оснований и взаимодействия водородных связей между основаниями Уотсона-Крика слабы (28).

    Для каждой из четырех исследованных конструкций ДНК мы определили относительную популяцию обратимых и необратимых событий преобразования smFRET в течение 120-секундного периода наблюдения за заданными областями образца (рис. 5 и таблица 1).Мы обнаружили, что для ДНК-конструкций, меченных дуплексом eCy3/eCy5, ~38% молекул в области визуализации проявляли активность преобразования FRET, которая была разделена на ~6% обратимых событий и ~32% необратимых событий на основе временных критериев. вышеперечисленное. Напротив, для конструкции ДНК, меченной дуплексом iCy3/iCy5, мы обнаружили, что общая конверсионная активность FRET была почти неопределяемой (<1%). Конструкция ДНК, меченная p/t соединением endCy3/iCy5, демонстрировала среднюю активность преобразования FRET, составляющую ~18%, с ~3% обратимых превращений и ~15% необратимых превращений.Мы наблюдали несколько более низкий уровень конверсионной активности для ДНК-конструкции, меченной вилкой iCy3/iCy5, ~12%, с обратимыми конверсиями ~3% и необратимыми конверсиями ~9%.

    Рисунок 5.

    Одномолекулярные (sm) события конверсии FRET, наблюдаемые для четырех исследованных ДНК-субстратов. ( A ) События преобразования smFRET были классифицированы как (обратимые) колебания сахаро-фосфатного остова ДНК или как (необратимое) фотообесцвечивание цианиновых хромофоров.Для каждого из четырех субстратов указан процент каждого типа процесса. ( B ) Процент обратимых событий преобразования smFRET, связанных с флуктуациями скелета ДНК, показан отдельно для каждого из исследованных ДНК-субстратов [те же данные, что и на панели (A)].

    Рис. 5.

    Одномолекулярные (sm) события преобразования FRET, наблюдаемые для четырех исследованных ДНК-субстратов. ( A ) События преобразования smFRET были классифицированы как (обратимые) колебания сахаро-фосфатного остова ДНК или как (необратимое) фотообесцвечивание цианиновых хромофоров.Для каждого из четырех субстратов указан процент каждого типа процесса. ( B ) Процент обратимых событий преобразования smFRET, связанных с флуктуациями скелета ДНК, показан отдельно для каждого из исследованных ДНК-субстратов [те же данные, что и на панели (A)].

    Мы отмечаем, что характер конверсионной активности FRET (как обратимой, так и необратимой) для четырех различных образцов близко отслеживал время жизни фотообесцвечивания для четырех конструкций ДНК, полученных в наших предыдущих измерениях (рис. 3A и дополнительная фигура S3).Более того, для всех исследованных нами образцов субпопуляция обратимых событий преобразования FRET составляла незначительную долю от общей активности FRET. Как указывалось выше, мы связываем обратимое преобразование FRET со спонтанными относительно долгоживущими конформационными изменениями сахаро-фосфатного остова, и, как показано на рисунке 5, такие флуктуации остова гораздо менее вероятны для конструкций ДНК, в которых хромофорные зонды жестко вставлены в сахаро-фосфатный остов дуплекса по сравнению с тремя оставшимися конструкциями, в которых зонды относительно подвержены воздействию растворителя и менее жестко расположены в разной степени.Конструкции ДНК, в которых использовалась химия внешней маркировки, оказались исключительно нестабильными, демонстрируя примерно в 20 раз большую вероятность конформационных флуктуаций в области дуплекса, чем конструкции ДНК, в которых использовались внутренние зонды. ДНК-конструкции, помеченные на соединениях p/t и репликативной вилки, снова оказались подвержены средним уровням флуктуаций конформации остова.

    Результаты, обобщенные на рисунке 5 и подробно описанные в таблице 1, были основаны на 3–8 отдельных экспериментах для каждой конструкции ( n ), как показано, и включали анализ 1000–4000 отдельных событий преобразования FRET ( N ). для каждой конструкции.Показаны планки погрешностей для каждого набора результатов. Общие результаты конверсии FRET суммированы на фигуре 5A, а события обратимой конверсии FRET также показаны отдельно на фигуре 5B, чтобы подчеркнуть основные различия между конструкциями в отношении этого параметра. Опять же, сравнение высоты первого и второго столбцов на этих гистограммах подчеркивает огромное снижение как обратимых, так и необратимых спонтанных FRET-превращений, вызванное перемещением хромофоров красителя из «гибких внешних» в «жесткие внутренние» позиции маркировки.

    На рисунке 6 мы представляем типичный набор данных для конструкции с внутренней меткой, непрерывно облученной мощностью 10 мВт в течение 1 часа. Эти данные иллюстрируют общую долговременную стабильность всей коллекции меченых конструкций (рис. 6А). Мы также отмечаем очень редкое возникновение событий фотообесцвечивания Cy3 или Cy5, а также фактическое отсутствие обратимых («дыхательных») событий преобразования FRET для этих конструкций с внутренней маркировкой (панели с 1 по 5 на рисунке 6B).

    Рис. 6.

    Флуоресцентные изображения области обнаружения Cy5 для конструкций ДНК, меченных дуплексом iCy3/iCy5, и репрезентативные траектории Cy3 и Cy5 sm. ( A ) Флуоресцентные изображения области обнаружения Cy5 для конструкций ДНК, меченных дуплексом iCy3/iCy5. Изображения были получены с 20-минутными интервалами при непрерывном лазерном возбуждении (около 10 мВт, см. Дополнительный рисунок S8). ( B ) Репрезентативные траектории Cy3 и Cy5 sm, записанные из конструкций ДНК, меченных дуплексом iCy3 / iCy5, в течение 30-секундного интервала после ~ 60 минут лазерного возбуждения (~ 10 мВт).После ∼60 минут непрерывного лазерного возбуждения ∼33% пар FRET оставались стабильными и не мигали для обеих пар FRET донор-акцептор Cy3/Cy5 (как показано на панелях 1, 2 и 3). Нечастое появление событий фотообесцвечивания Cy3 и Cy5 также можно было наблюдать в течение того же периода сбора данных (как показано на панелях 4 и 5).

    Рисунок 6.

    Флуоресцентные изображения области обнаружения Су5 для конструкций ДНК, меченных дуплексом iCy3/iCy5, и репрезентативные траектории Cy3 и Cy5 sm.( A ) Флуоресцентные изображения области обнаружения Cy5 для конструкций ДНК, меченных дуплексом iCy3/iCy5. Изображения были получены с 20-минутными интервалами при непрерывном лазерном возбуждении (около 10 мВт, см. Дополнительный рисунок S8). ( B ) Репрезентативные траектории Cy3 и Cy5 sm, записанные из конструкций ДНК, меченных дуплексом iCy3 / iCy5, в течение 30-секундного интервала после ~ 60 минут лазерного возбуждения (~ 10 мВт). После ∼60 минут непрерывного лазерного возбуждения ∼33% пар FRET оставались стабильными и не мигали для обеих пар FRET донор-акцептор Cy3/Cy5 (как показано на панелях 1, 2 и 3).Нечастое появление событий фотообесцвечивания Cy3 и Cy5 также можно было наблюдать в течение того же периода сбора данных (как показано на панелях 4 и 5).

    Влияние процедур мечения на локальную термодинамическую стабильность конструкций ДНК

    Для того чтобы сравнить эти результаты с эффектами внутреннего и внешнего мечения на структурную стабильность локальных дуплексов ДНК, мы также исследовали влияние размещения красителя и геометрии на кооперативные температуры плавления частей дуплексной ДНК различных конструкции при различных концентрациях соли и сравнили результаты с ожиданиями, основанными на составе дуплекса, длине и последовательности.Результаты обобщены в таблице 2 и показывают, вопреки нашим первоначальным ожиданиям, что при всех протестированных условиях концентрации соли пар красителей с внутренней меткой снижали общую стабильность дуплексных частей наших конструкций значительно на меньше , чем . с внешней маркировкой пар. Таблица 2 показывает, что наши конструкции ДНК с внешними зондами красителя, расположенными внутри областей дуплекса, при трех различных концентрациях соли были дестабилизированы в среднем на ∼ -6.5°С, тогда как введение пар внутренне меченых красителей в те же положения дуплекса ДНК приводило к снижению средней температуры плавления всего на ∼ -2,7°С.

    Сравнение экспериментальных и «теоретических» значений температуры плавления (
    T m ) конструкций вилки репликации ДНК и влияние положения сайта вставки хромофора, химического состава и условий буфера на T m Таблица 2.

    Сравнение экспериментальных и «теоретических» значений температуры плавления ( T m ) конструкций вилки репликации ДНК и влияние положения сайта вставки хромофора, химии и условий буфера на T m

    2 2 2 .
    Экспериментальный T m (°C) . Теоретическая T m (°C) e .+
    немодифицированного ДНК 69,6 69,6
    немодифицированного ДНК б 68,5 67,6
    немодифицированного ДНК с 68,4 65,8
    ICY3 / ICY5 — меченая ДНК A, D 66.8 68.9 68.9
    ICY3 / ICY5 — меченая ДНК B, D 65.8 67.0
    ICY3 / ICY5 — меченая ДНК C, D C, D 65.8 65.8
    ECY3 / ECY5 — меченая ДНК A 63.1 7040457
    ECY3 / ECY5 ДНК B 9 62.0 62.0 68.3
    ECY3 / ECY5 — маркированная ДНК C 61.9 61.8
    DNA Constructs . Экспериментальный T m (°C) . Теоретическая T m (°C) e . 90 437
    немодифицированного ДНК 69,6 69,6
    немодифицированного ДНК б 68,5 67,6
    немодифицированного ДНК с 68,4 65,8
    iCy3/iCy5-меченая ДНК a,d   66.8 68,9
    iCy3 / iCy5-меченого ДНК- б, г 65,8 67,0
    iCy3 / iCy5-меченого ДНК-, г 65,8 65,3
    ECY3 / ECY5 — маркированная ДНК 63.1 70.0
    ECY3 / ECY5 — маркированная ДНК B 62.0 68.3
    ECY3 / ECY5 — меченая ДНК C 61 .9  66,8 
    m

    ДНК-конструкции . Экспериментальный T m (°C) . Теоретическая T m (°C) e .+
    немодифицированного ДНК 69,6 69,6
    немодифицированного ДНК б 68,5 67,6
    немодифицированного ДНК с 68,4 65,8
    ICY3 / ICY5 — меченая ДНК A, D 66.8 68.9 68.9
    ICY3 / ICY5 — меченая ДНК B, D 65.8 67.0
    ICY3 / ICY5 — меченая ДНК C, D C, D 65.8 65.8
    ECY3 / ECY5 — меченая ДНК A 63.1 7040457
    ECY3 / ECY5 ДНК B 9 62.0 62.0 68.3
    ECY3 / ECY5 — маркированная ДНК C 61.9 61.8
    DNA Constructs . Экспериментальный T m (°C) . Теоретическая T m (°C) e . 90 437
    немодифицированного ДНК 69,6 69,6
    немодифицированного ДНК б 68,5 67,6
    немодифицированного ДНК с 68,4 65,8
    iCy3/iCy5-меченая ДНК a,d   66.8 68,9
    iCy3 / iCy5-меченого ДНК- б, г 65,8 67,0
    iCy3 / iCy5-меченого ДНК-, г 65,8 65,3
    ECY3 / ECY5 — маркированная ДНК 63.1 70.0
    ECY3 / ECY5 — маркированная ДНК B 62.0 68.3
    ECY3 / ECY5 — меченая ДНК C 61 .9  66,8 

    Расчеты, обобщенные в таблице 2, также показали, что дестабилизация, вызванная парой красителей с внутренней меткой, была близка к ожидаемой для нашей дуплексной последовательности при введении одной несовпадающей пары оснований в положение пара Cy3/Cy5, в то время как дестабилизация, вызванная внешними метками, была намного больше, даже несмотря на то, что конструкции с внешней маркировкой содержали , а не несовпадающих пар оснований (см. Дополнительную таблицу S1 для последовательностей ДНК).

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Мы продемонстрировали, что на фотостабильность ДНК-конструкций, меченных Cy3/Cy5, существенное влияние оказывает химия мечения и положение сайта встраивания красителя. Наши результаты согласуются с предположением о том, что фотостабильность этих цианиновых красителей может быть повышена за счет жесткого включения хромофоров в дуплексную область, возможно, потому, что повышенная структурная жесткость среды красителя может помочь отделить электронные переходы хромофоров от локальных. колебательные движения.Наши результаты также показывают, что фотообесцвечивание хромофорных зондов с большей вероятностью происходит в участках конструкции ДНК, в которых наиболее выражены долгоживущие колебания дыхания («обратимые» события преобразования FRET), что снижает жесткость хромофоров, а также увеличивает их воздействие растворяющей среды. В соответствии с этой закономерностью мы обнаружили, что дуплексная система с внешней меткой (рис. 1А) является наименее фотостабильной из четырех исследованных нами конструкций ДНК, в то время как, напротив, мы наблюдали резко повышенную фотостабильность дуплексных конструкций ДНК с внутренней меткой. .Таким образом, даже после ~ 1 часа непрерывного возбуждения при ~ 10 мВт падающей мощности лазера ~ 33% первоначально обнаруженных пар iCy3 / iCy5 smFRET все еще демонстрировали стабильные сигналы флуоресценции (см. рисунки 3 и 6 и дополнительный рисунок S8).

    Кроме того, мы также показали, что термодинамическая стабильность конструкций ДНК-дуплекса с внешней меткой значительно снижена по сравнению с таковой у конструкций с внутренней и немеченой меткой (табл. 2), а замена пары оснований на пару Cy3/Cy5 в конструкции с внутренней маркировкой (содержащей эквивалент несоответствия пары оснований) может заставить нас ожидать обратного.Мы предполагаем, что этот термодинамический дестабилизирующий эффект химии внешнего мечения может отражать временные дестабилизирующие взаимодействия между цианиновыми остатками и парами природных оснований, возможно, как следствие частичных и временных интеркаляционных реакций, которые могут локально нарушать нормальную укладку оснований и Уотсона-Крика. WC) взаимодействия пар оснований. Можно также ожидать, что такие флуктуации приведут к долгоживущим обратимым событиям FRET-конверсии, которые мы наблюдали с внешними метками, а гибкость нити, соединяющей хромофоры с остовами ДНК, может усиливать эти дестабилизирующие эффекты, допуская широкий спектр таких взаимодействия из-за случайных колебаний троса.Это согласуется с отсутствием определенного спектра CD в области поглощения красителя внешних зондов, показывая, что такие пары красителей (в отличие от пар с внутренней меткой) не образуют стабильных хиральных структур.

    Существуют прецеденты таких временных взаимодействий внешних красителей, влияющих на структурную стабильность (измеренную по изменениям Δ T m ) вицинальной дуплексной ДНК (31–34). Например, в более раннем исследовании Iqbal et al. (34) показали, что красители Cy3 и Cy5, расположенные на концах конструкций ДНК-дуплекса, могут накладываться друг на друга на концах дуплекса, что в этом случае приводит к увеличению термодинамической стабильности конструкции, а также к ограничению относительная ориентация пары красителей FRET.Наше открытие в настоящем исследовании, которое также согласуется с более ранней работой (33), показывает, что временное частичное локальное связывание красителя и/или интеркаляция внешних зондов, расположенных глубже в дуплексе, вместо этого может термодинамически дестабилизировать , возможно, путем взаимодействия со стабилизацией неблагоприятных колебаний и изгибов. Напротив, как мы показываем в этой статье, внутренних зондов внутри дуплекса не изменяют значительно локальную стабильность конструкции [за исключением того, что ожидается от некомплементарной пары оснований (35)].

    Происхождение повышенной фотостабильности, которую мы наблюдали для ДНК-конструкций Cy3/Cy5 с внутренней меткой, можно объяснить с точки зрения механизма. Имеется большой объем информации о фотофизике свободных цианиновых красителей в растворе, а также имеются свидетельства того, что стерические затруднения хромофора при присоединении к биологической макромолекуле могут влиять на интенсивность его флуоресценции (19–20). Этот эффект можно понимать как следствие фотоизомеризации молекулы в соответствии со схемой, показанной на рисунке 7.Полиметиновые цепи обоих хромофоров существуют преимущественно в энергетически выгодной конформации all-trans. Эта транс-конформация может подвергаться поглощению света, вызывая вертикальный (Франк-Кондон) переход из основного электронного состояния S 0 в колебательно-активное первое возбужденное синглетное состояние S 1 . Релаксация первоначально возбужденной транс-конформации может происходить различными путями. В одном случае избыточная вибрационная энергия быстро рассеивается в виде тепла в окружающую среду, создавая амплитуду на колебательно невозбужденной поверхности S 1 , которая затем может подвергаться безызлучательной внутренней конверсии (IC) и флуоресценции в субнаносекундных масштабах времени.В качестве альтернативы, молекула в своем электронно-колебательно-возбужденном состоянии имеет слабый характер двойной связи C = C и, таким образом, может подвергаться вращению вокруг одной из своих связей C-C с образованием стерически благоприятного «скрученного промежуточного соединения».

    Рис. 7.

    Гипотетические электронные поверхности потенциальной энергии показаны в зависимости от координаты θ , которая задает вращение связи С–С в полиметиновой цепи цианинового хромофора. Поверхность основного состояния помечена как S 0 , возбужденное синглетное состояние помечено как S 1 , а возбужденное триплетное состояние помечено как T 1 .Поглощение транс-конформацией ( θ = 0°) создает колебательно-возбужденное состояние в S 1 , которое может подвергаться эффективной колебательной релаксации (VR) с последующим IC или флуоресценцией. В качестве альтернативы молекула может подвергаться вибрационно-активируемой фотоизомеризации в более стабильное «скрученное промежуточное соединение» ( θ = 90°), которое может подвергаться разветвлению с образованием заселенности основного состояния как в цис ( θ = 180°), так и в транс конформации. Интерсистемному скрещиванию (ISC) в триплетное состояние T 1 способствует образование скрученного интермедиата.Скрученное состояние T 1 является первичным интермедиатом, через который происходит фотодеградация цианинового хромофора.

    Рис. 7.

    Гипотетические электронные поверхности потенциальной энергии показаны в зависимости от координаты θ , которая задает вращение связи С–С в полиметиновой цепи цианинового хромофора. Поверхность основного состояния помечена как S 0 , возбужденное синглетное состояние помечено как S 1 , а возбужденное триплетное состояние помечено как T 1 .Поглощение транс-конформацией ( θ = 0°) создает колебательно-возбужденное состояние в S 1 , которое может подвергаться эффективной колебательной релаксации (VR) с последующим IC или флуоресценцией. В качестве альтернативы молекула может подвергаться вибрационно-активируемой фотоизомеризации в более стабильное «скрученное промежуточное соединение» ( θ = 90°), которое может подвергаться разветвлению с образованием заселенности основного состояния как в цис ( θ = 180°), так и в транс конформации. Интерсистемному скрещиванию (ISC) в триплетное состояние T 1 способствует образование скрученного интермедиата.Скрученное состояние T 1 является первичным интермедиатом, через который происходит фотодеградация цианинового хромофора.

    На рис. 7 показаны (гипотетические) поверхности потенциальной энергии, управляющие этими процессами. Фотоизомеризация изображается как активированное пересечение барьера, при котором избыточная колебательная энергия связана с вращением связи C-C. Существование скрученного промежуточного соединения обеспечивает путь, по которому популяции основного состояния как в цис-, так и в транс-конформациях могут генерироваться посредством процессов безызлучательной релаксации.Поскольку переход S 1 ← S 0 в цис-конформации несет небольшую силу осциллятора, молекула в цис-конформации будет казаться нефлуоресцентной до тех пор, пока она не восстановится до своей полностью транс-конформации посредством термически активируемого повторного уравновешивания.

    Предыдущая работа по фотостабильности ДНК, меченной цианином, была сосредоточена на роли долгоживущих возбужденных триплетных (Т) состояний, которые могут необратимо реагировать с кислородом в основном состоянии с образованием нефлуоресцентных фотопродуктов (13,18, 36).Подобно другим системам, которые подвергаются фотоизомеризации, должно существовать возбужденное триплетное состояние (T 1 ) поверхности с более низкой энергией по сравнению с поверхностью S 1 , как показано на рисунке 7 (37). Так же, как и состояние S 1 , состояние T 1 также должно быть стабилизировано скрученной промежуточной конформацией. Таким образом, интеркомбинационная конверсия (ИСК) с поверхности S 1 на поверхность Т 1 должна быть сопряжена с фотоизомеризацией, при этом наиболее стабильная (и наиболее долгоживущая) форма триплета соответствует скрученному интермедиату.Мы предполагаем, что этот скрученный вид T 1 является основным промежуточным звеном, с помощью которого происходит фотодеградация в конструкциях ДНК, меченных цианином.

    Приведенная выше модель обеспечивает правдоподобную основу для понимания наших экспериментальных наблюдений. Фотодеградация, облегчаемая фотоизомеризацией, менее всего вероятна для конструкции ДНК, меченной дуплексом iCy3/iCy5, из-за стерических ограничений, наложенных на дистальные концы хромофоров, которые жестко расположены внутри структурно упорядоченного дуплекса.Эти стерические ограничения должны быть прямо связаны со степенью упорядоченности в положении сайта встраивания хромофора, что может быть связано с высотой барьера для процесса фотоизомеризации. Следовательно, в соответствии с нашими наблюдениями, мы можем предсказать следующую прогрессию уменьшения стерических затруднений и, соответственно, снижения фотостабильности: «iCy3/iCy5, меченая дуплексом» > «iCy3/iCy5, меченная вилкой» ДНК-конструкция >> «endCy3/iCy5 p ДНК-конструкция, меченная /t > ДНК-конструкция, меченная дуплексом eCy3/eCy5.

    Очевидно, что предложенная нами модель потребует экспериментальной проверки. Тем не менее, мы отмечаем, что наши основные результаты предполагают альтернативную стратегию маркировки одномолекулярных «субстратов», которая качественно отличается от большинства ранее реализованных подходов для таких исследований. В частности, мы ожидаем, что эти результаты могут привести к новым способам расширения временных окон наблюдения для экспериментов по флуоресценции одиночных молекул в целом и, возможно, также свести к минимуму локальные изменения стабильности в структуре дуплекса ДНК, которые могут быть вызваны менее жестко вставленными зондами.

    БЛАГОДАРНОСТИ

    Авторы благодарны Дэвису Хосе и Уолту Баасу за помощь и советы по измерению КД, Кэри Фелпс за полезные обсуждения и Тонгфею Бу, Джордану Р. Сенсибо и Шамиру А. Кансакару за помощь в подготовке образцов и образцов. клетки, используемые в наших экспериментах FRET с одной молекулой. А.Х.М. также выражает признательность за полезные обсуждения с доктором Джоном Хардвиком. П.Х.в.Х. профессор химии Американского онкологического общества.

    ФИНАНСИРОВАНИЕ

    Грант Национального института здравоохранения (NIH) / Национального института общих медицинских наук [GM-15792 для P.H.v.H.]; Национальный научный фонд (NSF), Программа «Химия жизненных процессов» [CHE-1307272 для AHM]. Источник финансирования открытого доступа: гранты NIH и NSF.

    Заявление о конфликте интересов. Не объявлено.

    ССЫЛКИ

    1., , .

    Одномолекулярные представления движения белка на одноцепочечной ДНК

    Annu.Преподобный Биофиз.

    ,

    2012

    , том.

    41

     (стр. 

    295

    319

    )2.,  . , 

    Одномолекулярные методы: лабораторное руководство

    2008

    Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк

    Колд-Спринг-Харбор Лаборатория Пресс

    3.,  ,  .

    Практическое руководство по одномолекулярным FRET

    Nat. Методы

    ,

    2008

    , том.

    5

     (стр. 

    507

    516

    )4.,  ,  ,  .

    Пружинный механизм раскручивания ДНК геликазой NS3 вируса гепатита С

    ,

    Наука

    ,

    2007

    , том.

    317

     (стр. 

    513

    516

    )5.,  ,  ,  ,  .

    Хеликаза BLM измеряет раскручивание ДНК перед переключением цепей, а hRPA способствует повторной инициации раскручивания

    ,

    EMBO J.

    ,

    2009

    , vol.

    28

     (стр. 

    405

    416

    )6.,  ,  ,  ,  .

    Достижения в методах флуоресценции одиночных молекул для молекулярной биологии

    Annu. Преподобный Биохим.

    ,

    2008

    , том.

    77

     (стр.

    51

    76

    )7.,  ,  ,  ,  ,  ,  .

    Инициация и повторная инициация раскручивания ДНК геликазой Escherichia coli Rep

    ,

    Nature

    ,

    2002

    , vol.

    419

     (стр. 

    638

    641

    )8.,  ,  ,  ,  .

    Однопарный резонансный перенос энергии флуоресценции (spFRET) для высокочувствительного анализа белков с низким содержанием с использованием аптамеров в качестве элементов молекулярного распознавания

    J. Fluoresc.

    ,

    2010

    , том.

    20

     (стр. 

    203

    213

    )9.,  ,  ,  ,  ,  .

    Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия без перекрестных помех для изучения активности ферментов

    ,

    Анал. хим.

    ,

    2010

    , том.

    82

     (стр. 

    1401

    1410

    )10.,  ,  ,  ,  .

    Одномолекулярные исследования FRET и линейного дихроизма дыхания ДНК и связывания геликазы в местах соединения репликативной вилки

    Proc. Натл. акад. науч. США

    ,

    2013

    , том.

    110

     (стр. 

    17320

    17325

    )11.,  ,  ,  ,  .

    Одномолекулярный взгляд на путь сборки, стехиометрию субъединиц и активность раскручивания комплекса примосом бактериофага Т4 (хеликаза-примаза)

    52

     (стр. 

    3157

    3170

    )12.,  ,  ,  ,  ,  .

    Повышенная фотостабильность цианиновых флуорофоров в видимом спектре

    Nat. Методы

    ,

    2012

    , том.

    9

     (стр. 

    428

    429

    )13., .

    Фотофизика флуоресцентных зондов для биофизики одиночных молекул и визуализации сверхвысокого разрешения

    Annu. Преподобный физ. хим.

    ,

    2012

    , том.

    63

     (стр. 

    595

    617

    )14.,  ,  .

    Немигающая и долговечная флуоресцентная визуализация одиночных молекул

    Nat. Методы

    ,

    2006

    , том.

    3

     (стр. 

    891

    893

    )15.,  ,  .

    Система поглощения кислорода для улучшения стабильности красителя в экспериментах по флуоресценции одиночных молекул

    Biophys.J.

    ,

    2008

    , том.

    94

     (стр. 

    1826

    1835

    )16.,  ,  ,  .

    Смягчение нежелательных фотофизических процессов для улучшения визуализации флуоресценции одиночных молекул

    Biophys. J.

    ,

    2009

    , том.

    96

     (стр. 

    2371

    2381

    )17.,  ,  ,  ,  ,  .

    Мониторинг конформационных флуктуаций шпилек ДНК с использованием однопарного резонансного переноса энергии флуоресценции

    ,

    J. Am. хим.соц.

    ,

    2001

    , том.

    123

     (стр. 

    4295

    4303

    )18.,  ,  .

    О механизме действия тролокса в качестве реагента, препятствующего миганию и обесцвечиванию

    ,

    J. Am. хим. соц.

    ,

    2009

    , том.

    131

     (стр. 

    5018

    5019

    )19.,  .

    Цианиновые красители в биофизических исследованиях: фотофизика полиметиновых флуоресцентных красителей в биомолекулярных средах

    ,

    Q. Rev. Biophys.

    ,

    2011

    , том.

    44

     (стр. 

    123

    151

    )20.,  ,  ,  .

    Одномолекулярные и ансамблевые флуоресцентные анализы функционально важного конформационного изменения ДНК-полимеразы Т7

    ,

    Proc. Натл. акад. науч. США

    ,

    2007

    , том.

    104

     (стр. 

    12610

    12615

    )21.,  ,  ,  ,  .

    Реагенты для мечения цианиновыми красителями: сульфоиндоцианинсукцинимидиловые эфиры

    ,

    Bioconj. хим.

    ,

    1993

    , том.

    4

     (стр.

    105

    111

    )22.,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

    Аномальное усиление флуоресценции Cy3 и Cy3. 5 по сравнению с аномальной потерей флуоресценции Cy5 и Cy7 при ковалентном связывании с IgG и нековалентном связывании с авидином

    ,

    Bioconj. хим.

    ,

    2000

    , том.

    11

     (стр. 

    696

    704

    )23.,  ,  ,  ,  ,  .

    Стратегия фотозащиты для флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул с микросекундным разрешением

    Nat. Методы

    ,

    2011

    , том.

    8

     (стр. 

    143

    146

    )24.,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

    Производные цианина флуорофора с повышенной фотостабильностью

    Nat. Методы

    ,

    2011

    , том.

    9

     (стр. 

    68

    71

    )25.,  ,  . , 

    Линейный дихроизм и круговой дихроизм

    2010

    Oxford

    Oxford University Press

    pg.

    1997

     26.,  .

    Изменение относительной стабильности пар оснований dA· dT и dG· dC в ДНК

    ,

    Proc.Натл. акад. науч. США

    ,

    1973

    , том.

    70

     (стр. 

    298

    302

    )27.,  ,  .

    Фотофизика флуоресцентных модификаций ДНК основной цепи: уменьшение неопределенностей в FRET

    ,

    J. Phys. хим. B

    ,

    2009

    , том.

    113

     (стр. 

    7861

    7866

    )28.,  ,  ,  .

    Спектроскопические исследования позиционно-специфических флуктуаций «дыхания» ДНК на репликационных вилках и соединениях праймер-матрица

    Proc.Натл. акад. науч. США

    ,

    2009

    , том.

    106

     (стр. 

    4231

    4236

    )29.,  ,  .

    Динамика пузырьков в двухцепочечной ДНК

    ,

    Phys. Преподобный Летт.

    ,

    2003

    , том.

    90

    стр.

    138101

    30.,  ,  .

    Пятьдесят лет «дышащей» ДНК: размышления о старых и новых подходах

    99

     (стр. 

    923

    954

    )31.,  ,  ,  .

    Влияние флуоресцентных красителей, гасителей и оборванных концов на стабильность дуплексов ДНК

    ,

    Biochem.Биофиз. Рез. коммун.

    ,

    2005

    , том.

    327

     (стр. 

    473

    484

    )32.,  ,  .

    Метки нуклеиновых кислот с жестким цианиновым красителем

    ,

    Chem. коммун.

    ,

    2008

    (стр.

    2004

    2006

    )33.,  .

    Олигонуклеотиды с сильно флуоресцентными группами, π-конъюгированные с азотистым основанием: синтезы, температуры плавления и конформация

    Bioorg. Мед. хим. лат.

    ,

    2003

    , том.

    13

     (стр.

    2785

    2788

    )34.,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  .

    Ориентационная зависимость переноса флуоресцентной энергии между Cy3 и Cy5, присоединенными на конце к двухцепочечным нуклеиновым кислотам

    ,

    Proc. Натл. акад. науч. США

    ,

    2008

    , том.

    105

     (стр. 

    11176

    11181

    )35.,  .

    Веб-сервер DINAMelt для предсказания плавления нуклеиновых кислот

    Nucleic Acids Res.

    ,

    2005

    , том.

    33

     (стр.

    W577

    W581

    )36.,  ,  ,  ,  ,  ,  .

    Восстановительно-окислительная система сводит к минимуму фотообесцвечивание и мерцание флуоресцентных красителей

    Angew. хим.

    ,

    2008

    , том.

    47

     (стр. 

    5465

    5469

    )37.,  ,  ,  .

    Синглетное состояние цис-, транс-фотоизомеризация и интеркомбинация 1-арилпропенов

    ,

    J. Am. хим. соц.

    ,

    1994

    , том.

    116

     (стр. 

    10477

    10485

    )

    © Автор(ы) 2014.Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

    Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинальная работа правильно цитируется.

    Tiny Tina’s Wonderlands получает 2 новых кода смены

    Игроки Tiny Tina’s Wonderlands могут активировать два новых кода Shift, чтобы получить бесплатную добычу в игре, но время уходит.

    Gearbox Software предлагает поклонникам франшизы Borderlands мародер-шутер множество различных способов получения добычи. Самый распространенный способ — убивать врагов или открывать сундуки в игровом мире, но есть и другой способ — использовать коды Shift. Как и в предыдущих играх серии Borderlands , недавно выпущенная Tiny Tina’s Wonderlands также имеет коды Shift, которые являются кодами с ограниченным сроком действия, которые дают игрокам ключ, который они могут использовать, чтобы открыть сундук в зоне Яркого Копыта, если его активировать. во время.

    Tiny Tina’s Wonderlands Коды смены публикуются в социальных сетях через официальные каналы Gearbox Software или иногда в личном Твиттере генерального директора Рэнди Питчфорда. Как только игроки Tiny Tina’s Wonderlands получат код Shift, они смогут использовать его в игре или на официальном сайте. Когда это будет сделано, следующим шагом будет получение Скелетного ключа из социального меню, а затем использование его на сундуке Яркого Копыта, чтобы получить бесплатную добычу.

    СВЯЗАННЫЙ: Веселый клип Tiny Tina’s Wonderlands показывает веселое взаимодействие Skeep

    На момент написания этой статьи в настоящее время существует два активных кода Shift Tiny Tina’s Wonderlands, которые игроки могут активировать.Первый код Shift был впервые показан игрокам Tiny Tina’s Wonderlands 11 апреля, и это B3F3J-3S3KZ-CWBWC-BTT3T-SHF5F . У всех желающих есть время до понедельника, 18 апреля, чтобы выкупить его. Другой код, изначально выпущенный 12 апреля, — JJRJB-CS3WZ-WWTW5-33BJT-JZ9RJ , и срок его действия также истекает 18 апреля. заканчивается.

    Коды смены Tiny Tina’s Wonderlands, которые активны сейчас

    • B3F3J-3S3KZ-CWBWC-BTT3T-SHF5F — Истекает 18.04.2022
    • JJRJB-CS3WZ-WWTW5-33BJT-JZ9RJ — истекает 18.04.2022

    Любой, кто пропустил эти последние коды Shift Tiny Tina’s Wonderlands , не должен слишком беспокоиться.Скорее всего, в будущем появится еще много возможностей использовать коды Shift Tiny Tina’s Wonderlands , если судить по играм Borderlands . Gearbox Software выпустила новые коды Shift для игр основной серии Borderlands спустя годы после их выпуска, и нет причин думать, что они не сделают то же самое для Tiny Tina’s Wonderlands .

    Несмотря на то, что это побочный продукт, а не основная часть серии, Tiny Tina’s Wonderlands был в основном хорошо принят поклонниками франшизы мародер-шутеров, и поэтому будет интересно посмотреть, какую поддержку он получит в будущем. .Gearbox Software выпустила несколько обновлений Tiny Tina’s Wonderlands с момента запуска, в основном устраняя ошибки и проблемы с балансировкой, но некоторые фанаты могут ждать чего-то более существенного.

    К счастью, большие обновления для Tiny Tina’s Wonderlands скоро появятся. Gearbox Software планирует выпустить четыре DLC-пакета Tiny Tina’s Wonderlands , первый из которых поступит в продажу 21 апреля.

    Tiny Tina’s Wonderlands уже вышла для ПК, PS4, PS5, Xbox One и Xbox Series X.

    БОЛЬШЕ: Обзор Tiny Tina’s Wonderlands

    Стример Twitch и ютубер Кика умерла в возрасте 21 года

    Читать Далее

    Об авторе

    Далтон Купер (опубликовано 8390 статей)

    Далтон Купер — редактор Game Rant, который профессионально пишет о видеоиграх с 2011 года.Написав за свою карьеру тысячи обзоров игр и статей, Далтон считает себя историком видеоигр и стремится сыграть в как можно больше игр. Далтон освещает последние новости для Game Rant, а также пишет обзоры, руководства и многое другое.

    Более От Далтона Купера

    Хотите сварить пиво для домашней вечеринки? Плюс безалкогольные варианты!

    В таком обществе, как Сингапур, где мы предпочитаем платить за удобства, большинство из нас не раздумывают, прежде чем нанять кого-то для выполнения задач, которые мы считаем обыденными и отнимающими много времени.Подумайте об уборке, сантехнике, замене лампочки, приготовлении пищи и даже о выгуле наших собак!

    Но пандемия изменила наши взгляды и переориентировала наши приоритеты. Спустя более двух лет большинство из нас углубились бы в ту или иную форму «Сделай сам» (DIY) или что-то в этом роде. Прелесть этого в том, что мы открыли для себя радость создания, изготовления и изготовления вещей своими руками. Бьюсь об заклад, вы, вероятно, уже пробовали что-то из следующего: вязание, кулинария, садоводство, сбор чайного гриба, гончарное дело и этот список можно продолжить.

    Любители пива, почему бы не активизировать творческий потенциал, добавить веселья и приготовить крафтовое пиво своими руками прямо у себя дома? Недавнее увеличение числа домашних гостей, безусловно, требует вечеринки. Поднимите себе настроение домашними газированными напитками! Ничто не мешает вам (если вам не исполнилось 18 лет!) провести небольшой эксперимент дома, приготовив и употребив домашнее пиво.

    Yahoo Shopping нашел на Lazada, Etsy и Amazon множество простых в использовании наборов для пивоварения, которые вы можете попробовать прямо у себя дома.Они кажутся такими легкими для достижения, так что взгляните. Привет Beer-ista, не нужно ждать Октоберфеста. Для тех, кто не употребляет алкоголь, привет, наши друзья-мусульмане, не беспокойтесь. Прокрутите вниз до безалкогольных вариантов ниже! Более того, мы обеспечили потрясающую скидку для тех, кто впервые знакомится с Amazon.

    [АКЦИЯ]

    Примените код «

    YAHOOAMZ18 », чтобы получить 18 сингапурских долларов со скидкой 40 сингапурских долларов на Amazon .

    Действителен с 14 апреля по 30 июня 2022 года.Только для новых клиентов Amazon. Добавьте в корзину прямо сейчас!

    Зарегистрируйтесь на Amazon Prime и получите доставку в тот же день

    Пройдите курс перед тем, как приступить к пивоварению

    Курс домашнего пивоварения и знакомство с пивом

    Наша редакция стремится найти и рассказать вам больше о продукты и предложения, которые мы любим. Если они вам тоже нравятся и вы решите приобрести их по ссылкам ниже, мы можем получить комиссию. Цены актуальны на момент публикации.

    История продолжается

    и посещение и посещение Yahoo Shopping для первых DIB на покупках

    Home Prewing Kit для пива. ФОТО: Lazada

    Стартовый набор для приготовления крафтового пива объемом 1 галлон. ФОТО: Lazada

    Бойлер из нержавеющей стали Спирты Дистиллятор Вино Пиво Производство фруктов. ФОТО: Lazada

    Craft A Brew Набор для пива Oktoberfest Ale, многоразовый.ФОТО: Amazon

    Набор ингредиентов для домашнего пива, 5 галлонов, американский кремовый эль. ФОТО: Amazon

    Набор крафтового пива с бутылками, 1 галлон, пилзнер, стаут, IPA. ФОТО: Amazon

    Приготовьте рецепт ингредиента для приготовления пива Hefeweizen. ФОТО: Amazon

    Комплексный набор для приготовления крафтового пива с запатентованными аксессуарами для пивоварения. ФОТО: Amazon

    Не совсем понял процесс приготовления пива? Не беспокойтесь, онлайн-доставки спешат на помощь!

    Магазин Shopee для пивных коробок Сделки по пиву на Lazada

    *Только для лиц старше 18 лет.Пить ответственно.

    Не употребляет алкоголь или младше 18 лет? Всегда есть безалкогольное пиво для ваших праздников!

    CARLSBERG Безалкогольное пшеничное пиво Банка, 4 x 330 мл LOTTE Kloud Clear Zero безалкогольное пиво — 6 x 350 мл Hite 0.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.