Лада гранта 200 км ч: Зачем производители рисуют на спидометре Лада Гранта максималку в 200 км/ч?

Содержание

Зачем производители рисуют на спидометре Лада Гранта максималку в 200 км/ч?

Вы наверняка замечали, что даже на самых бюджетных автомобилях спидометр расделен до каких-то неимоверных скоростей. Например, на «Ладах» прибор показывает максималку в 200 км/ч, и это при том, что сама машина быстрее 180 не разгонится. Попробуем разобраться, для чего вообще рисовать такие скорости, если официально, по российским дорогам нельзя ездить быстрее 130 км/ч.

Чтобы лучше продавалось

В автомобильном бизнесе очень высока конкуренция, по этой причине крайне важно уделять особое внимание маркетингу. От того, как позиционируется машина, напрямую зависит её успех у покупателей. Во всех странах есть ограничения максимальной скорости, но при этом никому и в голову не приходит разметить спидометр до установленного законом лимита. Производители знают, что если они так сделают, то это ударит по продажам, ведь кто захочет покупать машину с максимальной скоростью в 130 км/ч.

А вот завышение максималки, наоборот, улучшает продажи. Большие цифры на спидометре создают ощущение того, что автомобиль действительно более мощный и быстрый, чем это есть на самом деле. Поэтому даже на маленьких городских автомобильчиках спидометры имеют недостижимые для них деления.

Разные комплектации

Вторая причина, по которой спидометр размечается до каких-то запредельных скоростей, — это разные двигатели. Некоторые автопроизводители предлагают довольно большой выбор комплектаций своих машин. Покупатель может подобрать не только наиболее подходящую отделку салона или набрать нужные опции, но и выбрать двигатель с коробкой передач. Самая базовая версия машины может оснащаться слабым мотором, а в максимально укомплектованной машине уже будет установлен мощный агрегат. При этом ради унификации на всех машинах, вне зависимости от комплектации, будет стоять одна и та же приборная панель, спидометр на которой может быть размечен даже до 250 км/ч.

Это просто удобно

Третья причина, по которой производители автомобилей рисуют на спидометрах большие скорости, — такой шкалой удобно пользоваться. Если спидометр будет показывать только реальную максимальную скорость или даже только разрешённую ПДД, то водитель будет постоянно видеть, как стрелка находится в крайнем положении. А как показывает практика, ездить с такой приборной панелью не безопасно. Лежащая в максимальной зоне стрелка со временем исчезает из поля зрения водителя, и он не может адекватно оценивать свою скорость. По этой причине инженеры оставляют после стрелки небольшой запас только для того, чтобы её всегда было видно.

Фото с интернет-ресурсов

Максимальная скорость гранты — 190 км/час. Видео

Итак, давайте рассмотрим такое понятие, как максимальная скорость Гранты, и попробуем ответить на некоторые вопросы.

До скольких километров в час способна разогнаться Лада Granta?
Какую скорость развили вы на своей Гранте по трассе?  В какой модификации?
Оставался ли при этом какой-то запас мощности, или Вы давили на «всю гашетку»?
Как чувствовали Вы себя при этом? Комфортно или не очень?

Теоретически, по паспорту, Гранта способна развить максимальную скорость в 167 км/час (это в комплектации «Норма» 1,6 л 8-кл., 87 л.с. с механической коробкой ПП).

На практике же, я встречал человека, который на новом отрезке трассы (по «Волгоградке») разгонял свою Гранту до 170 км/час. При выключенном кондиционере. Говорил, что запас мощности ещё был, но ехать было уже совсем не комфортно.

Вот, посмотрите реальное видео, где человек разогнал Ладу Гранта до 190 км/час. Честно — я бы не стал этого делать))

Далее отвечаю за себя.

Я свою Ладу Granta максимально разгонял до 150+км/час. Скажу откровенно, я не пытался поставить некий рекорд скорости для Гранты, а просто хотел попробовать, на какой максимальной скорости я буду чувствовать себя относительно комфортно в плане безопасности и управляемости. Также мне было интересно, какой уровень шума будет в салоне на максимальной скорости.

Так вот, 150+ моя машинка (комплектация «Норма-1», 87 л.с. ) выдаёт на «Ура!». И, на первый взгляд, запас мощности при этом остаётся значительный. Но дальше разгоняться и ставить рекорд скорости совсем не было желания, поскольку машина вела себя не так уверенно на трассе, как скажем, при скорости в 100-110 км/час. Во-первых, повышенная парусность оч сильно влияет на управляемость и авто реагирует на руль уже не так предсказуемо, как на более низких скоростях. Также и встречные фуры буквально сносят нашу довольно высокую машину.

Вывод прост. Разгонять свою машину до максимума или ездить спокойно и комфортно — решать только вам! Лихачить попусту, в общем-то, ни к чему. Для этого есть спортивные машины и специальные трассы 😉

Удачи на дорогах!

PS. До ~170 разгонял. Дальше — реально страшно.

Почему спидометр даже бюджетных автомобилей размечают до 200 км/ч

Спидометр даже тихоходных малолитражек бывает размечен до 200 км/ч и выше. Однако зачем внедрять такие крупные значения, если реальные скоростные возможности маломощного транспорта редко превышают 150 км/ч, да еще и ограничения скорости в странах сбыта составляют максимум 130 км/ч? Для такой практики есть сразу несколько причин.

Пожалуй, главная подоплека выпуска спидометров со шкалами, размечены до 200, а то и 250 и 300 км/ч — это соображения экономии. Автопроизводителю просто не выгодно тратиться на различные модели спидометров для большого числа моделей и модификаций одного и того же автомобиля.

Поэтому дизайнеры вместе с инженерами создают одну версию спидометра с разметкой для топовой комплектации и предусматривают запас по шкале на случай выпуска в дальнейшем еще более производительных модификаций. В результате мы видим «приборку» с разметкой до 200 км/ч у «Патриота» с его реальным скоростным потолком 150 км/ч.

В основе «серьезных» цифр на спидометрах лежат также и соображения безопасности. Представим, например, что автомобиль подвергся тюнингу и его оснастили форсированным «движком». При ускорении до максимума стрелка спидометра, размеченного до каких-нибудь 180 км/ч, как говорят, «ляжет», и водитель не сможет оценивать реальную скорость движения, что, согласитесь, небезопасно.

Еще одна причина, по которой мы видим спидометры с впечатляющим скоростным рубежом в тихоходных машинах, — маркетинговая. Согласитесь, покупателю греет душу, когда он видит цифру 200 км/ч на приборном щитке Lada Granta или 180 км/ч на Lada Niva Legend. В этом смысле многообещающие цифры на «приборке» — игра на амбициях клиента и стимул для наращивания продаж.

Впрочем, дело также в эргономике и, как следствие, удобстве использования. Ведь в большинстве случаев, когда стрелка подбирается к первой трети разметки аналогового спидометра (равно как его нарисованной виртуальной версии), водитель, даже не видя точных цифр, осознает, что едет со скоростью, максимально допустимой для движения в городе. Как правило речь идет о 60 — 80 км/ч. При этом водитель в курсе, что за этим рубежом, к примеру, еще две трети шкалы. По той же «эргономической» причине значения 90-110 км/ч стараются размещать на шкале спидометра ближе к вертикальному положению стрелки. Все опять-таки потому, что так быстрее и проще сориентироваться при беглом взгляде на положение стрелки.

И тем не менее, новые тенденции автопрома в ряде случаев ломают сложившуюся практику разметки «приборок». Это связано прежде всего с появлением цифровых спидометров. К примеру, в Renault Kaptur вы видите на «приборке» очень крупные цифры набранной скорости без какого-либо дублирования шкалы спидометра на отдельных циферблатах. Тот, кто ездил на этом кроссовере, согласится, что реализовано все очень удобно. Между тем никакого прорисованного скоростного потолка в Renault Kaptur нет, так же, как и на проекционных дисплеях, транслирующих данные скорости на лобовое стекло многих премиальных моделей.

Наконец, некоторые автопроизводители не так давно встали на путь снижения фактического скоростного потолка своих моделей. Речь прежде всего о компании Volvo, начавшей устанавливать на всех своих новых машинах ограничение максимальной скорости в 180 км/ч.

Такой «ошейник» начали надевать на новые шведские автомобили еще в мае 2020 года. И, как можно догадаться, это делается для пущей безопасности и снижения смертности на дорогах. Заметим, что поскольку спидометры на новых моделях Volvo будут исключительно цифровыми, то разметка до более чем 180 км/ч попросту не понадобится. К слову, сейчас на большинстве современных Volvo виртуальные цифры скоростного режима вписаны в опять-таки нарисованную классическую шкалу спидометра, а при выборе той или иной графики «приборки» картинка меняется.

Самое интересное, что некоторые эксперты усмотрели в действиях шведов меркантильные соображения. Дело в том, что ограничивая физический скоростной потолок своих машин, шведский автопроизводитель в теории может сэкономить на комплектации таких моделей шинами с низким скоростным лимитом. Впрочем, ни в чем подобном шведы пока замечены не были.

Максимальная скорость Лада Гранта: стандарт, норма, спорт, люкс

Автомобиль: Лада Гранта.
Спрашивает: Морозов Михаил.
Суть вопроса: Какая максимальная скорость у Лада Гранта?


Доброго времени суток Вам! У меня Лада Гранта в максимальной комплектации, скажите, какая же у неё максимальная скорость?


Тип двигателя и максимальная скорость

Автомобиль Лада Гранта или ВАЗ – 2190, начал свою историю с 2011 года. За пять лет выпуска, на дороги было выпущено порядка полумиллиона экземпляров в различных модификациях и типах кузова.

The following two tabs change content below.

Владею автомобилем Рено Меган 2, до этого были Ситроены и Пежо. Работаю в сервисной зоне дилерского центра, поэтому знаю устройство автомобиля «от и до». Вы можете всегда обратиться ко мне за советом.

Соответственно в зависимости от комплектации, автомобили оснащались и разными типами двигателей, которые в свою очередь напрямую влияют на максимальную скорость транспортного средства.

Подробно о модификациях седана

Вид спереди сбоку

Самая первая версия народного российского автомобиля сразу полюбилась всем любителям нашего автопрома. После многочисленных испытаний и проверок, автомобиль прошел все проверки и с линии сошли автомобили следующих модификаций:

  • 1.6 литра 8V 5 МКПП – 87 л.с с максимальной скоростью 167 км\час.

    Двигатель 21116 — 167 км\час.

  • 1.6 литра 16V 4 АКПП – 98 л.с с максимальной скоростью 168 км\час
  • 1.6 литра 16V 5 МКПП – 106 л.с с максимальной скоростью 183 км\час
  • 1.6 литра 16V 5 АМКПП – 106 л.с с максимальной скоростью 180 км\час

Подробно о модификациях лифтбека

Одна из последних идей дизайнеров АвтоВАЗа, которая была представлена общественности в марте 2013 года. Не смотря на то, что претерпели изменения форма кузова и бампера, саму начинку создатели оставили без изменений.

  • 1.6 литра 8V 5 МКПП – 87 л.с с максимальной скоростью 167 км\час
  • 1.6 литра 16V 4 АКПП – 98 л.с с максимальной скоростью 166 км\час
  • 1.6 литра 16V 5 МКПП – 106 л.с с максимальной скоростью 177 км\час
  • 1.6 литра 16V 5 АМКПП – 106 л.с с максимальной скоростью 179 км\час

Лада Гранта СПОРТ (Люкс и Light)

Под капотом Лада Гранта Спорт

Из всей линейки, эта модель безусловно выделяется своей спортивной манерой, низкой посадкой, изящными линиями кузова и высокопроизводительным двигателем. Модель под лейблом СПОРТ выпускается в двух комплектациях Light и Luxe, оснащенная механической коробкой с двигателем объёмом 1.6 литра 16V и

способной развить максимальную скорость в 197 километров в час.

Выводы

Как вы могли убедиться, создатели народного автомобиля приложили максимум усилий для того, чтобы автолюбители смогли воочию подобрать для себя тот автомобиль, который соответствовал каждому для их потребностей.

Проехал 200 км на новой Ладе Гранте с 90 сильным мотором. Шум коробки, вибрация и тяга двигателя: обо всём по порядку | Мехвод

Друзья! Для тех кто ещё не в курсе, напомню, что я стал счастливым обладателем новой Лады Гранты, которую купил на прошлой неделе в автосалоне у официального дилера. Как покупал автомобиль, подробно рассказал в публикации ранее, кому интересно посмотрите у меня на канале.

В личные сообщения мне поступило очень много вопросов с просьбой рассказать, как ведёт себя новый 90 сильный мотор, коробка передач и что с шумоизоляцией салона.

На данный момент на Гранте проехал около 230 км, как по городу, так и по трассе. На некоторые моменты уже обратил своё внимание.

Начну с топлива.

«Можно ли заправлять автомобиль Лада Гранта, под капотом которого 90 сильный мотор, бензином с октановым числом 92?»

Ответ на вопрос я нашёл в руководстве по эксплуатации и на официальном сайте «LADA». Ниже прикрепил скриншот.

Скриншот с официального сайта LADA

Скриншот с официального сайта LADA

На официальном сайте «LADA» говорится, что бензин с октановым числом 92 можно использовать. В руководстве по эксплуатации сказано, что бензин АИ-92 минимально рекомендованный, с пометкой желательно заправлять авто бензином АИ-95.

После того, как выехал с автосалона, залил в Гранту полный бак АИ-95, так что все изложенные ниже ощущения от работы двигателя на 95-ой марке бензина.

Поначалу у меня были претензии к водительскому креслу, посадка за рулём казалась не комфортная, но после 200 км пробега свыкся и теперь меня всё устраивает.

Несмотря на то, что автомобиль оборудован электроусилителем руля, повороты рулём туговатые, но этот момент отнесу к плюсам, так как на трассе управлять автомобилем с нагрузкой на рулевое колесо намного удобней.

Что касается тормозов, то к ним замечаний нет. Лада Гранта оборудована антиблокировочной системой ABS и EBD, а так же есть вспомогательная система торможения BAS.

Разгоняется Лада Гранта с 90 сильным мотором до 100 км/ч за 11,2 секунды. Довольно шустро! Больше сотни не давал, так как авто ещё на обкатке.

При движении по трассе, если верить показаниям бортового компьютера, выводил автомобиль под средний расход топлива 5.1 — 5.4 литра на сто километров.

Что касается шума.

При движении на первой и второй передаче коробка немного подвывает, но, как мы знаем, эта проблема есть и на предыдущих Грантах. Так что на этот момент я не буду обращать внимание.

А вот, что касается третьей передачи, то при движении на автомобиле со скоростью 40 км в час после резкого ускорения двигатель начинает цокать (детонировать), но к 2000 оборотам в минуту детонация пропадает.

Тянет 90 сильный двигатель хорошо, не рекомендую проверять, но думаю, что с четвёртой передачи с места машина точно поедет.

Теперь, что касается вибрации в салоне. Она есть! Только вот проявляется не всегда. В основном вибрация на руль возникает, когда двигатель работает на холостых 1000 оборотах в минуту. Как только обороты падают ещё ниже: до 750 оборотов, вибрация переходит на весь салон автомобиля.

Подчеркну, что вибрация терпимая и пропадает сразу же при движении. Продолжаю тестить новую Гранту дальше! Подписывайтесь на канал, чтобы быть в курсе событий. На этом у меня всё, до новых встреч.

Специалисты поведали, из-за чего спидометр даже бюджетных машин размечают до 200 км/ч

Эксперты издания «Российская газета» рассказали о том, в связи с чем спидометр даже тихоходных малолитражек бывает размечен до 200 км/ч и выше.

Автор: Алексей Таршиков, редактор

Многие компании размечают спидометры своих моделей до 200, а то и 250 и 300 км/ч ради экономии. Компании невыгодно тратиться на подготовку различных моделей спидометров и, в связи с этим они являются универсальными для тихоходных и более мощных моделей.

Также спидометры размечают до высоких значений и в целях безопасности. Если транспортное средство укомплектовали форсированным мотор. То при ускорении до максимума стрелка спидометра, который размечен до каких-нибудь 180 км/ч, как говорят, «ляжет», и водитель не сможет оценивать настоящую скорость движения, что небезопасно. Также не стоит забывать о маркетинговой части. Потребителю гораздо приятнее смотреть на цифру 200 км/ч на приборном щитке Lada Granta или 180 км/ч на Lada Niva Legend.

Дело также в эргономике, так как в большинстве случаев, когда стрелка прибора подбирается к первой трети разметки аналогового спидометра, автовладелец осознает, что движется со скоростью максимально допустимой для движения в городе, по этой же причине значения 90–110 км/ч стараются размещать на шкале спидометра ближе к вертикальному положению стрелки.

В Татарстане лихач устроил смертельное ДТП, разогнавшись до 200 км/ч

Страшная авария на одной из автотрасс Татарстана произошла сегодня поздней ночью.

ДТП произошло в три часа ночи на 5 км автодороги Актаныш – Аишево – Казкеево. Как сообщили в пресс-службе МВД по РТ, 28-летний водитель автомобиля ВАЗ-2110 для того, чтобы обогнать впереди идущий автомобиль, выехал на встречную полосу.

На мостовом переходе через ручей столкнулся с автомобилем «Лада Гранта», который двигался по своей полосе.

Водитель и пассажирка автомобиля «десятки» от полученных травм скончались на месте происшествия. Они не были пристегнуты ремнями безопасности.

Кстати, водитель ВАЗ-2110 не имел водительских прав. А после смертельного столкновения стрелка спидометра автомобиля остановилась на отметке «180 км/ч».

На момент столкновения в «десятке» находились еще три пассажира – молодой человек и две девушки, которые были ровесниками погибшего водителя. Молодежь, а так же 36-летний водитель автомобиля «Лада Гранта» с различными травмами были доставлены в ЦРБ.В страшной аварии на одной из автотрасс Татарстана произошла сегодня поздней ночью.

ДТП произошло в три часа ночи на на 5 км автодороги Актаныш – Аишево – Казкеево. Как сообщили в пресс-службе МВД по РТ, 28-летний водитель автомобиля ВАЗ-2110 для того, чтобы обогнать впереди идущий автомобиль, выехал на встречную полосу.

На мостовом переходе через ручей столкнулся с автомобилем «Лада Гранта», который двигался по своей полосе.

Водитель и пассажирка автомобиля «десятки» от полученных травм скончались на месте происшествия. Они не были пристегнуты ремнями безопасности. 

Кстати, водитель ВАЗ-2110 не имел водительских прав. А после смертельного столкновения стрелка спидометра автомобиля остановилась на отметке «180 км/ч».

На момент столкновения в «десятке» находились еще три пассажира – молодой человек и две девушки, которые были ровесниками погибшего водителя. Молодежь, а так же 36-летний водитель автомобиля «Лада Гранта» с различными травмами были доставлены в ЦРБ.

Разработка индикаторов на основе FRET для визуализации гомофильного транс-взаимодействия сгруппированного протокадгерина

  • Kohmura, N. et al. Разнообразие, обнаруженное новым семейством кадгеринов, экспрессируемых в нейронах синаптического комплекса. Нейрон 20 , 1137–1151. https://doi.org/10.1016/s0896-6273(00)80495-x (1998).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Ву, К.и Маниатис, Т. Поразительная организация большого семейства генов нейронной кадгериноподобной клеточной адгезии человека. Сотовый 97 , 779–790. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)80789-8 (1999).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Эсуми, С. и др. Моноаллельная, но комбинаторная экспрессия вариабельных экзонов кластера генов протокадгерина-α в одиночных нейронах. Нац. Жене. 37 , 171–176. https://doi.org/10.1038/ng1500 (2005 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Канеко Р. и др. Аллельная регуляция генов кластеров Pcdh-α и Pcdh-γ , включающая как моноаллельную, так и биаллельную экспрессию в одиночных клетках Пуркинье. Дж. Биол. хим. 281 , 30551–30560. https://doi.org/10.1074/jbc.M605677200 (2006 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Хирано, К. и др. Разнообразие одиночных нейронов, генерируемое кластером протокадгерина-β в центральной и периферической нервной системе мыши. Фронт. Мол. Неврологи. 5 , 90. https://doi.org/10.3389/fnmol.2012.00090 (2012).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Шрайнер Д.& Weiner, JA. Комбинаторное гомофильное взаимодействие между мультимерами гамма-протокадгерина значительно расширяет молекулярное разнообразие клеточной адгезии. Проц. Натл. акад. науч. США 107 , 14893–14898. https://doi.org/10.1073/pnas.1004526107 (2010 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Чт, Калифорния и др. Одноклеточная идентичность, генерируемая комбинаторными гомофильными взаимодействиями между протокадгеринами α, β и γ. Сотовый 158 , 1045–1059. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.07.012 (2014 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Рубинштейн, Р., Гудман, К. М., Маниатис, Т., Шапиро, Л. и Хониг, Б. Структурное происхождение кластерного нейронного штрих-кодирования, опосредованного протокадгерином. Семин. Сотовый Дев. биол. 69 , 140–150. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2017.07.023 (2017).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Mountoufaris, G., Canzio, D., Nwakeze, C.L., Chen, W.V. & Maniatis, T. Написание, чтение и перевод кода распознавания поверхности сгруппированных протокадгеринов для сборки нейронных цепей. год. Преподобный Cell Dev. биол. 34 , 471–493. https://doi.org/10.1146/annurev-cellbio-100616-060701 (2018 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Панчо, А., Aerts, T., Mitsogiannis, MD & Seuntjens, E. Протокадгерины на перекрестке сигнальных путей. Фронт. Мол. Неврологи. 13 , 117. https://doi.org/10.3389/fnmol.2020.00117 (2020).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лефевр, Дж. Л., Костадинов, Д., Чен, В. В., Маниатис, Т. и Санес, Дж. Р. Протокадгерины опосредуют самоизбегание дендритов в нервной системе млекопитающих. Природа 488 , 517–521. https://doi.org/10.1038/nature11305 (2012 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Костадинов, Д. и Санес, Дж. Р. Зависимое от протокадгерина дендритное самоизбегание регулирует нейронную связь и функцию цепи. Элиф 4 , e08964. https://doi.org/10.7554/eLife.08964 (2015 г.).

    Артикул ПабМед Центральный Google ученый

  • Инг-Эстевес, С. и др. Комбинаторные эффекты альфа- и гамма-протокадгеринов на выживаемость нейронов и самоизбегание дендритов. J. Neurosci. 38 , 2713–2729. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3035-17.2018 (2018 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Хасегава, С. и др. Семейство протокадгеринов-α участвует в слиянии аксонов обонятельных сенсорных нейронов в клубочках обонятельной луковицы у мышей. Мол. Клетка. Неврологи. 38 , 66–79. https://doi.org/10.1016/j.mcn.2008.01.016 (2008 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Mountoufaris, G. и др. Разнообразие Multicluster Pcdh требуется для сборки обонятельной нервной цепи мыши. Наука 356 , 411–414. https://doi.org/10.1126/science.aai8801 (2017 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Катори С. и др. Семейство протокадгеринов-α необходимо для серотонинергических проекций, чтобы соответствующим образом иннервировать целевые области мозга. J. Neurosci. 29 , 9137–9147. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.5478-08.2009 (2009 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Катори, С. и др. Протокадгерин-αC2 необходим для диффузных проекций серотонинергических аксонов. Науч.Респ. 7 , 15908. https://doi.org/10.1038/s41598-017-16120-y (2017).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Чен В.В. и др. PcdhαC2 необходим для укладки аксонов и сборки серотонинергических цепей у мышей. Наука 356 , 406–411. https://doi.org/10.1126/science.aal3231 (2017 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Гаррет, А.М., Шрайнер Д., Лобас М.А. и Вайнер Дж.А. γ-протокадгерины контролируют разветвление кортикальных дендритов, регулируя активность сигнального пути FAK/PKC/MARCKS. Нейрон 74 , 269–276. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2012.01.028 (2012 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Suo, L., Lu, H., Ying, G., Capecchi, M. R. & Wu, Q. Кластеры протокадгерина и киназа клеточной адгезии регулируют сложность дендритов с помощью Rho GTPase. Дж. Мол. Клеточная биол. 4 , 362–376. https://doi.org/10.1093/jmcb/mjs034 (2012 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Molumby, M.J., Keeler, A.B. & Weiner, J.A. Межклеточные взаимодействия гомофильного протокадгерина способствуют усложнению дендритов. Сотовый представитель 15 , 1037–1050. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.03.093 (2016 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Моламби, М.J. и др. γ-Protocadherins взаимодействуют с нейролигином-1 и негативно регулируют морфогенез дендритных шипиков. Сотовый представитель 18 , 2702–2714. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.02.060 (2017 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Штеффен, Д. М. и др. γ-протокадгерины физически и функционально взаимодействуют с нейролигином-2, негативно регулируя плотность тормозных синапсов, и необходимы для нормального социального взаимодействия. Мол. Нейробиол. 58 , 2574–2589. https://doi.org/10.1007/s12035-020-02263-z (2021 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Рейсс, К. и др. Регулируемое ADAM10-зависимое выделение эктодомена гамма-протокадгерина C3 модулирует межклеточную адгезию. Дж. Биол. хим. 281 , 21735–21744. https://doi.org/10.1074/jbc.M602663200 (2006 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Рубинштейн Р. и др. Молекулярная логика нейронального самопознания через взаимодействия протокадгериновых доменов. Сотовый 163 , 629–642. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.026 (2015 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Гудман, К. М. и др. Структурная основа разнообразного гомофильного распознавания сгруппированными α- и β-протокадгеринами. Нейрон 90 , 709–723.https://doi.org/10.1016/j.neuron.2016.04.004 (2016 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Гудман, К. М. и др. Структурное разнообразие γ-протокадгерина и его функциональные последствия. Элиф 5 , e20930. https://doi.org/10.7554/eLife.20930 (2016 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Гудман, К.М. и др. Протокадгерин цис -димерная архитектура и разнообразие единиц распознавания. Проц. Натл. акад. науч. США 114 , E9829–E9837. https://doi.org/10.1073/pnas.1713449114 (2017 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ozawa, M. & Kemler, R. Изменение активности клеточной адгезии перванадатом из-за диссоциации α-катенина из комплекса E-кадгерин-катенин. Дж. Биол. хим. 273 , 6166–6170. https://doi.org/10.1074/jbc.273.11.6166 (1998 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Stryer, L. & Haugland, R.P. Передача энергии: спектроскопическая линейка. Проц. Натл. акад. науч. США 58 , 719–726. https://doi.org/10.1073/pnas.58.2.719 (1967 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Гринвальд, Э.К., Мехта С. и Чжан Дж. Генетически кодируемые флуоресцентные биосенсоры освещают пространственно-временную регуляцию сигнальных сетей. Хим. 118 , 11707–11794. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.8b00333 (2018 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ким С.А., Тай С.Ю., Мок Л.П., Моссер Э.А. и Шуман Э.М. Зависимая от кальция динамика взаимодействий кадгеринов на межклеточных соединениях. Проц. Натл. акад. науч. США 108 , 9857–9862. https://doi.org/10.1073/pnas.10108 (2011 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Fernàndez-Monreal, M., Kang, S. & Phillips, G.R. Гомофильное взаимодействие гамма-протокадгерина и внутриклеточный перенос контролируются цитоплазматическим доменом в нейронах. Мол. Клетка. Неврологи. 40 , 344–353.https://doi.org/10.1016/j.mcn.2008.12.002 (2009 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Feinberg, E.H. et al. Реконструкция GFP через синаптических партнеров (GRASP) определяет клеточные контакты и синапсы в живых нервных системах. Нейрон 57 , 353–363. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2007.11.030 (2008 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Ким Дж. и др. mGRASP позволяет картировать синаптические соединения млекопитающих с помощью световой микроскопии. Нац. Методы 9 , 96–102. https://doi.org/10.1038/nmeth.1784 (2011 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Цеценис, Т., Букард, А.А., Арак, Д., Брунгер, А.Т. и Зюдхоф, Т.С. Прямая визуализация транссинаптических взаимодействий нейрексин-нейролигин во время образования синапсов. J. Neurosci. 34 , 15083–15096. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0348-14.2014 (2014 г.).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Чой, Дж. Х. и др. Межрегиональные синаптические карты среди клеток энграмм лежат в основе формирования памяти. Наука 360 , 430–435. https://doi.org/10.1126/science.aas9204 (2018 г.).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед Google ученый

  • Киношита Н. и др. Генетически кодируемый флуоресцентный индикатор GRAPHIC очерчивает межклеточные связи. Наука 15 , 28–38. https://doi.org/10.1016/j.isci.2019.04.013 (2019 г.).

    КАС Статья Google ученый

  • Киношита, Н., Хуанг, А.Дж.Ю., МакХью, Т.Дж., Мияваки, А. и Шимогори, Т. Диффузионная ГРАФИКА для визуализации морфологии клеток после специфического межклеточного контакта. Науч.Респ. 10 , 14437. https://doi.org/10.1038/s41598-020-71474-0 (2020).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Хасегава, С. и др. Сгруппированные протокадгерины необходимы для построения функциональных нейронных цепей. Фронт. Мол. Неврологи. 10 , 114. https://doi.org/10.3389/fnmol.2017.00114 (2017).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Фуджи Ю. и др. PA tag: универсальная система мечения белков с использованием сверхвысокоаффинного антитела против додекапептида, полученного из подопланина человека. Protein Expr. Очист. 95 , 240–247. https://doi.org/10.1016/j.pep.2014.01.009 (2014 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Шибата Х. и др. Новая роль аннексина А11 в раннем секреторном пути посредством стабилизации белка Sec31A в местах выхода эндоплазматического ретикулума (ERES). Дж. Биол. хим. 290 , 4981–4993. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.592089 (2015 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Канадоме, Т., Шибата, Х., Кувата, К., Такахара, Т. и Маки, М. Кальций-связывающий белок ALG-2 способствует локализации места выхода эндоплазматического ретикулума и полимеризации Trk-слитого гена ( белок ТФГ. FEBS J. 284 , 56–76. https://дои.org/10.1111/febs.13949 (2017).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Биосенсоры FRET с красным смещением для высокопроизводительного флуоресцентного скрининга в течение всей жизни

    Биосенсоры (Базель). 2018 декабрь; 8 (4): 99.

    , 1 , 1 , 2 , 2 , 2 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1, 3, * и 2, *

    3 Photonic Pharma LLC, Minneapolis, MN 55410, USA

    Поступила в редакцию 20 сентября 2018 г.; Принято 19 октября 2018 г.

    Лицензиат MDPI, Базель, Швейцария. Эта статья находится в открытом доступе и распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution (CC BY) (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Эта статья цитировалась в других статьях в PMC. .

    Abstract

    Мы разработали биосенсоры с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET) с флуоресцентными белками (FP) с красным смещением, обеспечивающие улучшенные характеристики для измерений флуоресценции с временным разрешением (время жизни).По сравнению с биосенсорами с зелеными и красными парами FRET (GFP/RFP), FP, которые излучают на более длинных волнах (оранжевый и темно-бордовый, OFP/MFP), увеличили эффективность FRET, динамический диапазон и отношение сигнал-фон при высокопроизводительном скрининге. (ХТС). OFP и MFP были слиты со специфическими участками сердечного кальциевого насоса человека (SERCA2a) для обнаружения структурных изменений, вызванных эффекторами малых молекул. В сочетании с недавно усовершенствованным устройством для считывания микропланшетов со временем жизни флуоресценции HTS этот биосенсор FRET с красным смещением позволил проводить высокоточные измерения затухания флуоресценции с разрешением в наносекунды для микролитровых объемов образцов со временем считывания в три минуты на 1536-луночный планшет.Пилотные скрининги с библиотекой малых молекул демонстрируют, что датчик OFP/MFP FRET существенно улучшает качество анализа HTS. Эти методы FRET с высоким содержанием обнаруживают мельчайшие изменения FRET с высокой точностью, что необходимо для выяснения новых структурных механизмов низкомолекулярных или пептидных регуляторов, обнаруженных в ходе наших постоянных усилий по HTS. Датчики FRET, которые излучают на более длинных волнах, очень привлекательны для сообщества биосенсоров FRET для открытия лекарств и структурного исследования новых терапевтических целей.

    Ключевые слова: FRET с временным разрешением, биосенсор, скрининг лекарств, SERCA, низкомолекулярный, высокопроизводительный, считыватель планшетов, флуоресценция, флуоресцентные белки

    1. Введение клетки, предлагают мощный подход для измерения молекулярных структурных изменений с помощью переноса энергии флуоресцентного резонанса (FRET) [1] для оценки биомолекулярных механизмов и разработки терапевтических подходов [2]. Это особенно эффективно, когда FRET измеряется по уменьшению времени жизни флуоресценции донора (FLT), повышая точность обнаружения структурных изменений белка в 30 раз по сравнению с измерением FRET по интенсивности [3,4].Однако пропускная способность (скорость, с которой могут быть выполнены последовательные измерения с эквивалентной точностью) для обнаружения FLT ограничена примерно 0,1 в секунду для точности 1% при использовании обычного метода коррелированного по времени счета одиночных фотонов (TCSPC). Недавно разработанная технология, использующая прямую запись формы сигнала (DWR), увеличила пропускную способность высокоточного обнаружения FLT на 5 порядков, до 10 000 в секунду [4]. DWR работает путем прямой оцифровки всей формы волны (тысячи фотонов) из одного интенсивного лазерного импульса с использованием современных микрочиповых лазеров (чрезвычайно воспроизводимая форма лазерного импульса) и запатентованного дигитайзера, который дает чрезвычайно воспроизводимые сигналы [4].Подход DWR позволил (а) обнаруживать структурные изменения белка с высокой точностью во время субмиллисекундных биохимических переходных процессов [5] и (б) высокопроизводительный скрининг (HTS) с использованием первого действительно высокопроизводительного устройства для считывания флуоресценции микропланшетов с наносекундным разрешением. ФЛТ-ПР) [2,6,7]. В FLT-PR пропускная способность ограничена скоростью перемещения пластины, поэтому эффективное увеличение пропускной способности примерно в 100 раз по сравнению с TCSPC. FLT-PR считывает образцы с той же скоростью (сотни в минуту), что и обычный планшет-ридер на основе интенсивности, повышая точность обнаружения FRET при HTS в 30 раз [2, 6, 7].

    Эта повышенная точность обнаружения в сочетании с разработкой флуоресцентных биосенсоров в живых клетках обещает революцию в точности обнаружения лекарств с помощью HTS с использованием больших библиотек соединений. В наших предыдущих исследованиях FLT в живых клетках интересующий белок был слит с зеленым флуоресцентным белком (GFP, донор FRET) и красным флуоресцентным белком (RFP, акцептор FRET), образуя двухцветный внутримолекулярный биосенсор [2]. В других случаях GFP и RFP сливали для разделения взаимодействующих белков, образуя межмолекулярный биосенсор [8].Однако надежность и чувствительность этого подхода ограничены помехами от светорассеяния, клеточной автофлуоресценции и собственной флуоресценции тестируемых малых молекул [9,10]. В настоящем исследовании мы показываем, что эти проблемы значительно облегчаются при использовании флуоресцентных белков (FP), которые поглощают и излучают на более длинных волнах.

    Биосенсоры с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), разработанные с использованием флуоресцентных белков с красным смещением, обладают несколькими потенциальными преимуществами по сравнению с более широко используемыми GFP и RFP [11].Основным преимуществом является улучшенное отношение сигнала к фону, поскольку относительный вклад помех от клеточной автофлуоресценции или других источников резко снижается. Дополнительные потенциальные преимущества включают улучшенные характеристики FP за счет снижения димеризации, более длительного стоксова сдвига или улучшения созревания FP [12]. К счастью, недавно были разработаны генетически кодированные биосенсоры FRET с красным смещением и длиной волны возбуждения более 530 нм для применения в живых клетках [13,14]. Кроме того, эти биосенсоры с красным смещением обычно имеют более длительное время жизни флуоресценции, чем у GFP [15], что должно улучшить динамический диапазон биосенсора.Однако улучшение, которое это обеспечивает для анализов на основе FLT, еще предстоит подробно описать, особенно в приложениях HTS.

    В настоящем исследовании мы демонстрируем оптимизацию биосенсоров FRET с красным смещением для обнаружения FLT на скоростях HTS с использованием недавно разработанного и усовершенствованного высокопроизводительного считывателя микропланшетов, способного измерять наносекундное затухание FLT в формате микропланшета высокой плотности ( 1536 лунок, 5 мкл на лунку), получение данных с полного планшета менее чем за три минуты с точностью измерения на протяжении всего срока службы (стандартное отклонение/среднее значение) 1% или выше.Это остается единственным инструментом, который может практически применить технологию времени жизни флуоресценции к HTS.

    Мы обнаружили, что экспрессия генетически кодируемых биосенсоров, объединяющих GFP и RFP с белком-мишенью, не только обеспечивает ожидаемые преимущества анализа живых клеток, поскольку соединения должны проникать в клетку в действительно физиологических условиях, но также улучшает однородность самого биосенсора, поскольку он устраняет неоднородность, вносимую очисткой белка и мечением флуоресцентными красителями [16,17].Тщательный обзор доступных в настоящее время пар FP с красным смещением () позволил нам выбрать подходящие донорные и акцепторные FP для улучшения наших биосенсоров для обнаружения FLT. К счастью, недавно сообщалось о новой паре FRET для визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM) [18]. Эта пара FRET состоит из mCyRFP1/mMaroon1 (обозначенных здесь для простоты как OFP/MFP).

    Чтобы напрямую сравнить производительность двух биосенсоров, мы заменили GFP и RFP на OFP и MFP в нашем наиболее тщательно протестированном биосенсоре FRET, SERCA2a, сердечном кальциевом насосе человека [1,19,20].В этой конструкции, экспрессированной в клетках НЕК293, донор встроен во внутреннюю петлю, а акцептор размещен на N-конце (С). Приведенные здесь данные показывают, что для мишени SERCA2a OFP / MFP почти удваивает окно сигнала FRET из-за увеличения динамического диапазона времени жизни донора OFP для данного структурного возмущения, вызванного лекарственным средством. Улучшенная чувствительность этой новой пары FRET, вероятно, в значительной степени связана с улучшенным перекрытием между спектрами излучения донора и поглощения акцептора, что приводит к большему значению R 0 (расстояние для 50% FRET) и, таким образом, к значительно большей чувствительности к структурным изменениям. цель (А, В).Тонкие различия в эндогенных линкерах и/или структурах флуоресцентных белков могут изменить ориентацию хромофора, что также может повлиять на R 0 и, таким образом, на чувствительность. У этих биосенсоров с красным смещением есть некоторые незначительные недостатки: немного более низкая молярная поглощающая способность, большая фотолабильность и чувствительность к фотообесцвечиванию [18], но мы обнаружили, что они не оказывают значительного влияния на улучшенное качество HTS по сравнению с GFP / RFP FRET. биосенсор. Так же, как пара CFP/YFP FRET постепенно заменяется парой GFP/RFP с красным смещением, мы прогнозируем, что OFP/MFP станет в будущем предпочтительной парой FRET для приложений с живыми клетками.

    ( A ) Ранее использовавшаяся пара флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) спектры возбуждения eGFP/tagRFP (G/R) (штриховые) и испускания (сплошные). ( B ) Спектры возбуждения и излучения пары FRET mCyRFP/mMaroon (O/M) со смещением в красную сторону. ( C ) Двухцветный внутримолекулярный биосенсор FRET SERCA (2CS) отслеживает структурный статус цитоплазматических доменов SERCA, на который может влиять связывание малых молекул. ( D ) Конфокальная микроскопия стабильной клеточной линии HEK293, экспрессирующей биосенсоры 2CS FRET.

    2. Материалы и методы

    2.1. Культура клеток и создание стабильных клонов

    Клетки HEK293 (первоначально полученные из почки эмбриона человека) поддерживали в среде DMEM, не содержащей фенолового красного, от Gibco (Waltham, MA, USA) с добавлением 2 мМ GlutaMAX (Gibco), 10% эмбриональной бычьей сыворотки ( FBS) от Atlanta Biologicals (Лоуренсвилль, Джорджия, США) и 1 МЕ/мл пенициллина/стрептомицина (Gibco) и выращивали при 37 °C с 5% CO 2 . Линии клеток HEK293 использовали для создания стабильных клонов, сверхэкспрессирующих биосенсоры на основе FRET (содержащие как донор, так и акцептор), и соответствующие контрольные клеточные линии только донора и только акцептора [2].За три дня до скрининга стабильные клеточные линии размножали в колбах T225 от Corning Inc. (Corning, NY, USA). В каждый день скрининга и повторного тестирования FRET примерно 30 миллионов клеток собирали путем обработки Tryple от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США), трижды промывали фосфатным буферным раствором (PBS) без магния или кальция от Thermo Scientific (Waltham). , Массачусетс, США) путем центрифугирования при 300 g, фильтрации с использованием клеточных фильтров 70 мкм (Corning) и разбавления до 10 6 клеток/мл с использованием автоматического счетчика клеток (Invitrogen).В каждый день скрининга жизнеспособность клеток оценивали с использованием анализа с трипановым синим, и оказалось, что жизнеспособность клеток превышает 95%. После ресуспендирования и разбавления в PBS клетки непрерывно и осторожно перемешивали с помощью магнитной мешалки при комнатной температуре, поддерживая клетки в суспензии и равномерно распределяя их во избежание образования скоплений. Субклеточную локализацию каждого биосенсора оценивали с помощью инвертированного конфокального микроскопа Olympus FluoView FV1000 IX2 (Токио, Япония) с детектором FLIM. Сигналы GFP и RFP оценивали с использованием лазерного возбуждения с длиной волны 473 и 561 нм соответственно.Ядра клеток идентифицировали путем окрашивания DAPI с использованием лазерного возбуждения с длиной волны 405 нм.

    2.2. Дозирование жидкости

    Клетки и смеси соединений распределяли в 1536-луночные плоские полипропиленовые планшеты с черным дном производства Greiner (Кремсмюнсте, Австрия). Соединения дозировали с помощью либо автоматического дозатора жидкости Echo Acoustic от Labcyte (Саннивейл, Калифорния, США), либо дозатора жидкости Mosquito от TTP Labtech (Мельбурн, Великобритания). Клетки распределяли при комнатной температуре с помощью дозатора жидкости Multidrop Combi от Thermo (Питтсбург, Пенсильвания, США) при плотности 10 6 клеток/мл либо за 30, либо за 120 минут до скрининга.Для скрининга клетки помещали в планшеты для анализа, содержащие 1280 соединений LOPAC (библиотека фармакологически активных соединений, от Invitrogen), растворенных в ДМСО. Конечная концентрация ДМСО составляла <1%, и готовили контрольные лунки, содержащие клетки и соответствующие [ДМСО]. Те же самые методы применялись для последующего FRET-тестирования воспроизводимых попаданий, идентифицированных на пилотном скрининге. Воспроизводимые хиты FRET для повторного тестирования были приобретены у Tocris (Миннеаполис, Миннесота, США) или Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США), в зависимости от их доступности.

    2.3. Обнаружение FLT и анализ данных

    Подробное описание приборов флуоресценции подробно описано ранее и может быть найдено в нашей предыдущей публикации [9]. Текущий прибор был обновлен до формата микропланшета высокой плотности (1536 лунок, 5 мкл/лунка), что позволяет получать данные с полного планшета менее чем за три минуты с точностью измерения в течение всего срока службы (стандартное отклонение/среднее значение) 1% или выше. Кривые затухания флуоресценции (с верхними характеристиками 0.разрешение 2 пс, 640 точек данных в диапазоне 128 нс) для определения FLT были обнаружены непосредственно, как описано ранее [2,7], за исключением того, что для GFP и OFP использовались два разных источника света. В обоих случаях флуоресценция возбуждалась импульсным микрочиповым лазером, генерирующим наносекундные импульсы. Как описано ранее для GFP, использовался лазер с длиной волны 473 нм (Bright Solutions, Via degli Artigiani, Италия), доставляющий импульсы с энергией ~ 1 мкДж с частотой повторения 5 кГц. Для OFP использовался лазер с длиной волны 532 нм (Teem Photonics SNG-20F-100, Мейлан, Франция) с частотой импульсов ~0.Энергия 3 мкДж при частоте повторения 20 кГц. В каждом случае использовались соответствующие фильтры длин волн для селективного обнаружения излучения донора; для GFP — полосовой фильтр излучения 517/20, а для OFP — полосовой фильтр излучения 586/20. Эти фильтры были выбраны для исключения акцепторной флуоресценции, поскольку для расчета FRET требуется только время жизни донорного флуоресцентного белка (уравнение (1)). Напряжение фотоумножителя (ФЭУ) регулировали таким образом, чтобы пиковые сигналы функции отклика прибора (IRF) и биосенсора FRET были одинаковыми.Наблюдаемую форму волны флуоресценции с временным разрешением анализировали, как описано ранее [2], предполагая одноэкспоненциальное затухание, для определения времени жизни флуоресценции (FLT) для контрольных образцов, содержащих только донор ( τ D ), и образцов биосенсора FRET, содержащих донор плюс акцептор ( τ DA ). Эффективность FRET рассчитывалась из

    Время жизни флуоресценции (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) по одноэкспоненциальной подгонке контролей только для доноров составило 2,58 ± 0.02 нс для GFP и 3,55 ± 0,02 нс для OFP, что согласуется с ранее опубликованными значениями [18,21].

    Для спектрального обнаружения данные были собраны и проанализированы, как описано ранее, для определения спектральных вкладов от донора, акцептора, клеточной автофлуоресценции и рамановского рассеяния воды, и был рассчитан индекс подобия ( SI ), чтобы отметить ложноположительные результаты из-за к помехам от флуоресцентных соединений, как описано ранее [10]. Вкратце, спектры флуоресценции высокого разрешения из 256 контрольных лунок, содержащих ДМСО в % об./об., усредняли, а затем сравнивали с каждой из 1240 лунок, содержащих испытуемые соединения из библиотеки низкомолекулярных соединений LOPAC.Форма спектров лунок, содержащих испытуемые соединения, которые, как было обнаружено, значительно отличались от лунок с контрольным ДМСО, что оценивалось по показателю подобия, были отмечены как ложноположительные.

    Для оценки данных HTS фактор качества Z ′ определяли путем оценки прецизионности (стандартное отклонение или стандартное отклонение) и динамического диапазона FRET [22], используя ДМСО в качестве отрицательного контроля и 200 нМ тапсигаргина ( Tg ) в качестве положительный контроль:

    Z’=1-3×(SDTg+SDDMSO)|Среднее значение FRETTg-Среднее значение FRETDMSO|

    (2)

    2.4. Анализ ферментативной активности SERCA хитов FRET

    Функциональные анализы проводили с использованием везикул саркоплазматического ретикулума, полученных из скелетных мышц кролика (SERCA1a) и сердечной мышцы свиньи (SERCA2a) [2]. Для измерения активности АТФазы SERCA в 96-луночных микропланшетах применяли анализ связанной с ферментом NADH-связанной АТФазы. Каждая лунка содержала 50 мМ MOPS (pH 7,0), 100 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2 , 1 мМ EGTA, 0,2 мМ NADH, 1 мМ фосфоенолпируват, 10 МЕ/мл пируваткиназы, 10 МЕ/мл лактатдегидрогеназы. , 1 мкМ ионофора кальция A23187 от Sigma (St.Louis, Миссури, США), и CaCl 2 добавляли для выделения [Ca 2+ ] до 10 мкМ [23]; 4 мкг/мл везикул SR, кальция, соединения и смеси для анализа инкубировали в течение 20 мин. Анализ начинали после добавления АТФ в конечной концентрации 5 мМ (общий объем до 200 мкл), и определяли скорость снижения поглощения НАДН при 340 нм с помощью спектрофотометра для микропланшетов SpectraMax Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, Калифорния, США).

    3. Результаты

    3.1. Пары FRET с красным смещением

    В методе DWR используются высокоэнергетические импульсные лазеры для регистрации тысяч фотонов, испускаемых приблизительно 5000 живыми клетками, экспрессирующими биосенсоры FRET, в каждой лунке объемом 5 мкл.Мы исследовали характеристики флуоресценции нескольких доступных в настоящее время флуоресцентных белков в соответствующих диапазонах длин волн, чтобы найти потенциальные донорные и акцепторные FP со смещением в красную область с идеальными свойствами для анализа времени жизни флуоресценции HTS. Многие факторы влияют на то, подходит ли конкретная пара FRET для измерений FLT. Мы искали донорские отпечатки с длительным временем жизни (> 4 нс) для увеличения динамического диапазона биосенсора. Кроме того, мы ограничили наш поиск FP, которые можно возбудить с помощью чрезвычайно стабильного и быстрого (20 кГц) имеющегося в продаже импульсного лазера с длиной волны 532 нм.После идентификации нескольких кандидатов (), мы исследовали свойства этих FP, чтобы найти пары FRET с максимальным перекрытием между спектрами излучения донора и спектра поглощения акцептора, что указывает на чувствительность к обнаружению больших расстояний из-за их увеличенного расстояния Фёрстера (R 0 ). ). Мы также искали донорные FP с высокими квантовыми выходами и акцепторы с большими коэффициентами экстинкции, оба из которых способствовали увеличению интенсивности сигнала.

    Изучив несколько вариантов, мы выбрали две пары FRET с оранжевыми флуоресцентными донорами и дальнекрасным акцептором.Донорами ОФП были mKO2 и mCyRFP1 и акцептор mMaroon1 (MFP). Расстояние Ферстера (R 0 ) определяли, как описано в Приложении A (уравнение (A1)). Мы обнаружили, что пары FRET mKO2-mMaroon1 и mCyRFP1-mMaroon1 имеют значения R 0 , равные 6,3 нм, что длиннее, чем наша ранее зарегистрированная пара FLT FRET eGFP-tagRFP (5,8 нм). A, B изображают спектры возбуждения и испускания флуоресценции пар eGFP-tagRFP (G/R) и mCyRFP1-mMaroon1 (O/M) FRET, при этом площадь перекрытия (J) между испусканием донора и возбуждением акцептора равна больше для пары O/M FRET.Примечательно, что этот донор OFP можно возбудить с помощью импульсного лазерного источника с длиной волны 473 или 532 нм, хотя менее эффективно при возбуждении с более короткой длиной волны. Наш основной интерес заключается в использовании возбуждения с большей длиной волны для уменьшения флуоресцентных помех для анализов HTS, но возможность мультиплексирования измерений FLT на основе GFP и OFP с одной длиной волны возбуждения, как это было сделано для первых экспериментов FLIM с парой O/M. [18], представляет интерес для будущих исследований, включающих мультиплексные анализы HTS.

    Конструкции флуоресцентных слитых белков, сконструированные с использованием пар O/M FRET, были созданы с использованием стандартных стратегий клонирования молекулярной биологии. К ним относятся нуль-линкерные конструкции с гибким пептидом между FP и биосенсором FRET, который отслеживает структурные изменения сердечного кальциевого насоса человека (SERCA2a), поскольку он перекачивает и хранит ионы кальция в саркоплазматическом ретикулуме, что необходимо для правильного расслабления сердца. Этот двухцветный биосенсор SERCA (2CS) [20] был тщательно оценен с использованием нескольких методов FRET [1,2,19,24], включая одномолекулярный FRET [15].Он служит надежным биосенсором FRET для оценки нашей новой технологии и анализов FRET. FRET отслеживает структурный статус SERCA, на который влияет связывание малых молекул (C). Мы обнаружили сильную корреляцию между функцией SERCA и структурой, нарушенной малыми молекулами, обнаруженную благодаря нашим усилиям по HTS в живых клетках [2,9]. В настоящем исследовании обе конструкции 2CS человека (G/R и O/M) стабильно экспрессировались в клетках HEK293 [10]. Конфокальная микроскопия была проведена для выделения стабильных клонов с правильной локализацией биосенсора 2CS на мембране ER, как показано сетчатым узором, окружающим ядро ​​в D.Также оценивались множественные конструкции 2CS с чередующимися FP, но они не повышали эффективность FRET или улучшали динамический диапазон биосенсоров. Пара mKO2 FRET оказалась непригодной для этого биосенсора из-за ее склонности к образованию агрегатов на мембране ЭР [12]. Поэтому в настоящем исследовании мы сосредоточимся на паре донор/акцептор O/M FRET mCyRFP/mMaroon.

    3.2. Оценка обнаружения FLT с использованием возбуждения импульсным лазером с длиной волны 532 нм

    Основными факторами, усложняющими оптимизацию анализов HTS на основе флуоресценции, являются (a) интерференция флуоресценции от исследуемых соединений и (b) аутофлуоресценция, испускаемая клетками.Для сравнения качества информации, полученной от биосенсоров G/R и O/M, мы провели скрининг библиотеки LOPAC, используя лазерные источники с длиной волны 473 и 532 нм для возбуждения донорских FP. Чтобы отсеять мешающие флуоресцентные соединения в библиотеке LOPAC, отбирали немеченые клетки HEK293 (без экспрессии XFP). Интерференцию оценивали по пиковой интенсивности формы волны FLT, сравнивая контрольные лунки с ДМСО и лунки с низкомолекулярными тестами. Флуоресцентное соединение (ложноположительный результат) отмечалось, если интенсивность пика отличалась (на 10% или более) от среднего значения, наблюдаемого в 256 контрольных лунках с ДМСО на каждом 1536-луночном микропланшете.Было гораздо больше (48) мешающих флуоресцентных соединений при возбуждении с длиной волны 473 нм, чем с использованием возбуждения с длиной волны 532 нм (15), о чем свидетельствуют тепловые карты 1536-луночных планшетов экранов LOPAC в A, B.

    Собственная флуоресцентная интерференция библиотеки низкомолекулярных соединений Библиотеки фармакологически активных соединений (LOPAC), оцененная в формате 1536-луночного планшета с помощью ( A ) лазерного возбуждения с микрочипом 473 нм и ( B ) лазерного возбуждения 532 нм . Спектральный анализ записи стабильной клеточной линии, экспрессирующей ( C ) 2CS (GFP/RFP) при возбуждении 473 нм и ( D ) 2CS (OFP/MFP) при возбуждении 532 нм.

    Спектры излучения (C,D) были записаны с помощью нашего недавно разработанного считывателя спектральных пластин [10]. Эталонные спектры OFP и MFP были сгенерированы с использованием немеченых конструкций FP, транзиентно экспрессированных в клетках HEK293 с лазерным возбуждением 532 нм. Эти спектры использовались для разрешения спектральных составляющих для биосенсоров. Была выполнена линейная минимизация по методу наименьших квадратов с соответствующими эталонными спектрами, которая показала хорошо разрешенную аппроксимацию с плоскими остатками по всем длинам волн спектра и низкими значениями χ 2 .Как аутофлуоресценция (от клеток HEK293), так и неупругое рассеяние света (комбинационное рассеяние воды) намного ниже при возбуждении на 532 нм, чем на 473 нм, по сравнению с сигналом донорной флуоресценции соответствующего биосенсора (C, D). Фактически, от пары OFP/MFP FRET не наблюдалось сигнала автофлуоресценции. Хотя спектры излучения OFP и MFP хорошо разрешены, интенсивность сигнала акцептора MFP довольно низка из-за его низкого квантового выхода, что снижает потенциал этой конкретной пары FRET для экранирования с использованием считывания спектра.Таким образом, основная роль спектральной записи для этой пары FRET на основе OFP заключалась в том, чтобы идентифицировать флуоресцентные соединения как ложноположительные результаты.

    3.3. Динамический диапазон биосенсора FLT и качество анализа HTS (Z’)

    Кривые реакции на концентрацию (CRC) были построены для сравнения конструкций 2CS G/R и O/M человека (). Изменения в течение жизни были проверены на кривой концентрации по 16 точкам в формате 384-луночного планшета с объемом образца 50 мкл на лунку хорошо известного субнаномолярного ингибитора SERCA тапсигаргина ( Tg ).Конструкции G/R и O/M показали сходные значения EC 50 (4,4 ± 1,2 нМ и 2,2 ± 1,3 нМ соответственно). Изменение времени жизни при насыщении Tg составило 258 ± 12 пс (среднее значение ± стандартное отклонение) для биосенсора O/M, что существенно больше, чем значение, наблюдаемое для G/R ​​(136 ± 10 пс) (A). Стандартные отклонения 12 и 10 пс определялись по изменению времени жизни. Это увеличенное «сигнальное окно» (знаменатель в правом члене (уравнения (2)) дает биосенсору O/M существенно повышенное качество анализа, измеряемое Z’ (B).Z’ увеличивается с 0,62 (G/R) до 0,75 (O/M) (B), где значение 0,5 или выше указывает на превосходную точность и динамический диапазон для анализов HTS [22]. Два фактора способствуют увеличению окна сигнала: (а) R 0 (радиус Фёрстера) примерно на 0,6 нм (10%) больше для О/М и (б) время жизни донора для ОФП в отсутствие FRET (контроль ДМСО ) примерно на треть больше, чем у GFP.

    Сравнение кривых концентрация-реакция (CRC) и Z’ известных низкомолекулярных эффекторов SERCA.( A ) 16-точечные кривые концентрация-реакция показывают, что тапсигаргин, специфический ингибитор SERCA, вызывает большее изменение продолжительности жизни для O/M (оранжевый), чем для G/R ​​(зеленый). ( B ) Z’-анализ 2CS, инкубированного с насыщающей дозой 200 нМ Tg из 128 лунок 1536-луночного планшета, показывает больший отклик на O/M, чем на G/R. ( C , D ) 8-точечный CRC показывает, что ингибиторы SERCA циклопиазоновая кислота (CPA) и 2,5-ди-трет-бутил-1,4-бензогидрохинон (BHQ) также вызывают большие изменения продолжительности жизни для O/M чем для Г/Р.

    Для дальнейшей оценки различий во времени жизни флуоресценции и наблюдаемой реакции FRET обоих биосенсоров на другие известные ингибиторы SERCA были проведены эксперименты с 8-точечной кривой зависимости концентрации (CRC) с двумя другими известными ингибиторами SERCA циклопиазоновой кислотой (CPA). и 2,5-ди-трет-бутил-1,4-бензогидрохинон (BHQ) (C,D). Как и в случае Tg , пара О/М дала большее изменение времени жизни, в то время как значения EC 50 были одинаковыми для двух биосенсоров.

    3.4. Пилотная низкомолекулярная библиотека, сравнение HTS

    Два биосенсора живых клеток использовались для скрининга библиотеки LOPAC, результаты проиллюстрированы на: тысяча двести восемьдесят соединений с конечной концентрацией анализа 10 мкМ форматировали на одном 1536-луночном планшете. Остальные лунки, не содержащие тестируемых соединений, заполняли эквивалентным объемом ДМСО. Стабильные клетки НЕК, экспрессирующие биосенсоры 2CS, собирали и разбавляли до одного миллиона клеток на миллилитр в каждый день скрининга.Пять микролитров разбавленных клеток распределяли в каждую лунку 1536-луночного планшета, содержащего все 1280 соединений из библиотеки LOPAC. В отдельные дни для каждого биосенсора проводили три пилотных скрининга. Форму волны затухания флуоресценции из каждой лунки анализировали для определения одноэкспоненциального времени жизни. Затем точность каждого набора данных скрининга оценивалась путем подгонки этих сроков службы к распределению Гаусса, как показано на гистограммах в (A), которое использовалось для определения среднего изменения FRET и стандартного отклонения (SD) для каждого скрининга.Экранный анализ распределения Гаусса указывает на сравнимую точность для биосенсоров G/R и O/M со стандартными отклонениями 8 ± 2 пс и 11 ± 3 пс соответственно. Другим параметром для контроля точности HTS с точки зрения качества данных является коэффициент вариации (SD/среднее значение) {Cornea, 2012 #106}, который оказался менее 0,3% для обоих биосенсоров в наборе тройных скринингов, что указывает на чрезвычайно высокая точность.

    Пилотные экраны библиотеки LOPAC для 2-цветного SERCA2a в живых клетках: ( A ) Гистограммы показывают распределение наблюдаемых изменений за время жизни на отдельных экранах, каждый из которых соответствует распределению Гаусса для определения SD (~ 8 пс для G/R ​​и 11 пс для O/M).( B ) Пиковая интенсивность (мВ) для ложноположительного срабатывания. Внизу: изменение продолжительности жизни в одном 1536-луночном скрининге для G/R ​​( C ) и O/M ( D ). Известный ингибитор SERCA тапсигаргин (10 мкМ) показан стрелкой. Воспроизводимые совпадения (синие) были идентифицированы на трех отдельных экранах.

    Спектральные данные каждого 1536-луночного планшета были получены параллельно с данными о продолжительности жизни, чтобы оценить потенциальные ложноположительные совпадения. Приблизительно 5% соединений LOPAC демонстрировали потенциальную интерференцию флуоресценции.Биосенсор 2CS (O/M) был разработан специально для оптимизации анализов HTS в течение всего срока службы, и простой анализ пиковой интенсивности по формам сигналов времени жизни для 2CS (G/R) и (O/M) показывает как минимум трехкратное снижение в потенциальных флуоресцентных соединениях от биосенсора 2CS (O/M) с красным смещением. B показывает, что существует больше флуоресцентных соединений, отмеченных биосенсором 2CS (G / R) при скрининге с использованием импульсного возбуждения 473 нм, по сравнению с биосенсором 2CS (O / M), возбужденным с использованием импульсного лазерного возбуждения 532 нм.

    Соединения, которые значительно и воспроизводимо изменили время жизни по данным трехкратного скрининга биосенсоров 2CS (G/R) (C) или 2CS (O/M) (D), показаны синим цветом на диаграммах рассеяния для одного 1536-луночного пилотного проекта. экран. Было обнаружено, что десять соединений являются тройными попаданиями биосенсора 2CS (O / M) на основе порога 5 SD после устранения потенциальных ложных срабатываний. Соединения, обнаруженные как совпадения во всех трех скринингах для каждого биосенсора, а также не помеченные как флуоресцентные соединения ни в одном скрининге, были классифицированы как воспроизводимые совпадения.Примечательно, что девять из десяти соединений были идентифицированы с использованием обеих версий биосенсора 2CS. Кроме того, диаграммы разброса всех 1536 лунок на одном скрине показывают значительное снижение количества невоспроизводимых попаданий, обнаруженных биосенсором 2CS (O/M), по сравнению с биосенсором 2CS (G/R), хотя точность немного выше для биосенсора 2CS (G/R). Для простоты соединения, которые увеличили срок службы и снизили FRET, показаны как хиты, которые увеличили FRET, но не были воспроизведены при трехкратном скрининге.Было обнаружено, что изменение продолжительности жизни, обнаруженное из воспроизводимых попаданий, обнаруженных биосенсором 2CS (O / M), демонстрирует большее изменение FRET, что показано реакцией известного ингибитора SERCA тапсигаргина ( Tg ). Биосенсор 2CS (O/M) в целом идентифицировал меньше попаданий, чем версия (G/R), благодаря расширенному динамическому диапазону и уменьшению помех от ложноположительных попаданий.

    3.5. Структурная (FRET) и функциональная (АТФазная активность) взаимосвязь попаданий LOPAC

    Десять воспроизводимых соединений, которые были выбраны в качестве попаданий из пилотного скрининга LOPAC при концентрации 10 мкМ, были дополнительно охарактеризованы исследованиями реакции на концентрацию ().Эти предполагаемые эффекторы SERCA были протестированы с использованием 16-точечных кривых концентрации для структурных анализов FRET с использованием как биосенсоров 2CS, так и двух разных наборов контрольных биосенсоров. Линии контрольных клеток использовали для определения того, взаимодействуют ли соединения с самими флуоресцентными слитыми белками или воздействуют ли они на них. Эти контрольные биосенсоры включали только донорские контроли и донорно-акцепторные «нулевые» линкерные конструкции, стабильно экспрессируемые в клетках HEK293. В идеале ожидается, что Hit соединение должно вызывать дозозависимое изменение FRET для каждого из двух биосенсоров 2CS FRET, но не для контрольных конструкций.Также были проведены анализы активности АТФазы с использованием двух различных очищенных изоформ SERCA для оценки функциональных последствий структурных нарушений.

    Структурные и функциональные анализы воспроизводимых совпадений LOPAC для человеческого SERCA2a, показывающие кривые концентрация-реакция (CRC): ( A ) UCL 2077, ( B ) FPL 64176 и ( C ) IPA3. В первых двух столбцах показаны изменения продолжительности жизни на основе FRET для биосенсора 2CS (слева) или контрольных клеточных линий только для донора 1CS и нулевого линкера (в центре).В правом столбце показаны функциональные данные (активность Са-АТФазы SERCA). Пунктирная линия указывает базовую активность АТФазы без добавления соединения. Составные структуры показаны в виде вставок.

    10 воспроизводимых попаданий LOPAC вызывали зависящие от концентрации изменения FRET, как показано изменением времени жизни (три примера показаны на рис.). Эти же 10 ударов дополнительно изменили функцию АТФазы SERCA, причем большинство из них оказались ингибиторами. Практически во всех случаях пара O/M FRET показала большую реакцию FRET, чем пара G/R FRET.Было обнаружено, что три разных класса эффекторов FRET изменяют 2CS FRET, как показано на правой панели . Подобные кривые FRET концентрация-реакция (CRC) будут полезны для крупномасштабных исследований HTS и медицинской химии по соединениям свинца для классификации хемотипов на основе структурной информации. [25] , показано на A (правая панель).Это соединение дало сигмоидальную аппроксимацию с хорошим разрешением по изменению времени жизни, где большее общее изменение времени жизни было обнаружено для биосенсора (O/M). Значения EC 50 , определенные по аппроксимации Хилла, хорошо согласовывались с обеими версиями биосенсоров 2CS, где 2CS (G/R) продемонстрировал EC 50 , равный 13,8 мкМ, а 2CS (O/M) показал EC . 50 7,2 мкМ. Соответствующие донорские контроли и контроли с нулевым линкером (средняя панель) не показали значительного влияния на FRET, что указывает на отсутствие нецелевых, неспецифических эффектов из-за взаимодействия UCL2077 с самими флуоресцентными белками или изменения их свойств.UCL2077 влиял на Са-зависимую АТФазную активность двух различных изоформ очищенного фермента SERCA. Эффект был двухфазным: обе изоформы активировались при низких концентрациях соединения, но активность достигала максимума около 3 микромолей, а затем снижалась.

    Второй класс совпадений показан на B, где соединение FPL 64176 дает сигмодиальную аппроксимацию Хилла для разных концентраций. Снижение FRET не достигает насыщения при самых высоких концентрациях обеих версий биосенсоров 2CS (левый столбец), а кажущаяся EC 50 обоих была почти одинаковой при 21 ± 3 и 26 ± 4 мкМ для (O /M) и (G/R) биосенсоры соответственно.FPL 64176 также является мощным активатором каналов Ca 2+ L-типа [26]. Как и в предыдущем случае, это соединение не оказывало существенного влияния на FRET для контрольных биосенсоров (средняя панель). Интересно, что FPL 64176 вызывал аналогичную двухфазную активацию АТФазы, как и UCL2077, за исключением того, что он был значительно более эффективным (как с точки зрения EC50, так и % изменения) в отношении сердечной изоформы SERCA2a по сравнению с изоформой SERCA1a, обнаруженной в скелетных мышцах. Поскольку известно, что FPL 64176 изменяет динамику кальция в сердце, вполне вероятно, что некоторые из его эффектов связаны с его взаимодействием с SERCA2a.Структурные данные, полученные из анализов FRET HTS, могут оказаться важными для идентификации новых активаторов SERCA, специфичных для изоформ.

    Последний тип профиля FRET, полученный из воспроизводимых попаданий FRET 2CS, показан на C. Было обнаружено, что соединение IPA-3 резко и значительно снижает FRET обоих биосенсоров 2CS примерно при 10 мкМ. При концентрациях выше 20 мкМ изменение продолжительности жизни показало увеличение FRET обратно к исходному уровню FRET, определенному для исходного контроля.Значения EC50 не были показаны для IPA-3, потому что кривая концентрация-реакция (CRC) не имела сигмоидального тренда. Контрольные флуоресцентные слитые белки для обоих (G/R) и (O/M) биосенсоров продемонстрировали значительные зависящие от концентрации изменения продолжительности жизни флуоресценции. В частности, оба набора одноцветных контролей SERCA только для доноров показали даже большее увеличение продолжительности жизни, чем было обнаружено с помощью биосенсора FRET. Конструкции с нулевым линкером демонстрировали изменение продолжительности жизни в противоположном направлении при более высоких концентрациях, чем для донорских контролей.Эти данные свидетельствуют о том, что IPA-3 изменяет FRET неспецифическим образом, потенциально через его сульфгидрильный фрагмент, который, как известно, образует обратимые ковалентные связи с PAK1 и аллостерически ингибирует функцию. Эти окислительно-восстановительные эффекты сделали IPA3 не поддающимся лечению и остановили клиническую разработку препарата [27]. Было обнаружено, что IPA3 ингибирует АТФазную активность двух протестированных изоформ SERCA с очевидными значениями EC 50 , которые оказались равными 9,5 мкМ (SERCA1a) и 8 мкМ (SERCA2a) на левой панели C.CRC FRET из всех девяти попаданий LOPAC FRET можно найти в файлах . Этот тип структурно-функционального профиля демонстрирует, что соединения, которые взаимодействуют с ферментом SERCA непрямым образом, могут быть обнаружены биосенсором 2CS FRET, а информация о механизме действия может быть получена на ранней стадии процесса поиска лекарств, потенциально экономя большое количество информации. количества энергии и усилий.

    4. Обсуждение

    Основное внимание в этом исследовании уделялось оценке пары FRET OFP/MFP (O/M) и сравнению ее полезности с более широко используемой парой FRET GFP/RFP (G/R).Результаты демонстрируют замечательный набор преимуществ биосенсора с красным смещением. Наша основная мотивация при переходе на более длинные волны заключалась в том, чтобы свести к минимуму помехи от флуоресцентных соединений и клеточной автофлуоресценции, и это было ясно продемонстрировано на (), что привело к уменьшению числа ложных срабатываний в три раза. Более удивительным преимуществом пары с красным смещением является то, что более длительный срок службы OFP и более длинный R 0 еще больше повысили чувствительность нашей недавно разработанной и усовершенствованной технологии HTS и биосенсорных анализов FRET.Кроме того, увеличенное окно сигнала биосенсоров с красным смещением существенно улучшило Z’ наших и без того отличных анализов HTS, основанных на продолжительности жизни (). Может показаться, что это увеличение не сильно меняет результаты, полученные в ходе этих небольших пилотных скринингов, но при тестировании на скрининге миллионов соединений это небольшое увеличение надежности анализа может быть совершенно необходимым для быстрого исключения соединений, имеющих неспецифические взаимодействия. с ферментом SERCA. Это также может быть необходимо для быстрой сортировки наиболее перспективных соединений свинца для дальнейшего функционального тестирования и последующего тестирования на животных моделях сердечно-сосудистых заболеваний.

    Использование биосенсора FRET с красным смещением выгодно для нашей технологии HTS, основанной на времени жизни DWR, поскольку в настоящее время коммерчески доступны более стабильные и надежные импульсные лазеры на микрочипах с возбуждением на длинах волн более 530 нм. В частности, эта работа устанавливает возможность улучшенных анализов HTS, нацеленных на SERCA2a, для открытия соединений, специфичных для сердечной ткани и функции. Эти скрининги могут привести к открытию востребованных низкомолекулярных активаторов SERCA [28].В более общем смысле соединения с улучшенной аффинностью связывания или специфичностью в отношении специфических изоформ SERCA обладают высоким потенциалом в качестве терапевтических средств для лечения сердечной недостаточности, диабета II типа и многих других дегенеративных заболеваний. В более общем плане этот подход, вероятно, найдет широкое применение для любой идентифицированной белковой мишени, для которой осуществима разработка биосенсоров FP.

    5. Выводы

    Мы описали биосенсоры с переносом энергии резонанса флуоресценции с красным смещением (FRET), нацеленные на сердечный кальциевый насос, которые значительно улучшили динамический диапазон, соотношение сигнал-шум и отбор попаданий для высокопроизводительного скрининга (HTS). ).В сочетании с недавно обновленным устройством для считывания микропланшетов HTS эти биосенсоры FRET с красным смещением обеспечивают беспрецедентную точность и качество анализа в наносекундных измерениях затухания флуоресценции (время жизни) для микролитровых объемов образца за три минуты на 1536-луночный планшет. Эта комбинация обещает произвести революцию в высокоточных измерениях FRET живых клеток для открытия крайне необходимых терапевтических средств.

    Благодарности

    Бенгт Свенссон, Разван Л. Корнеа и Дж. Майкл Отри провели полезные обсуждения, а Октавиан Корнеа подготовил рукопись к публикации.Флуоресцентную микроскопию проводили в Центре визуализации UMN, проточную цитометрию — в Институте сердца UMN в Лиллехей, дозирование соединений — в Институте открытия и разработки терапевтических препаратов UMN, а спектроскопию — в Центре биофизических технологий UMN.

    Приложение A

    Рисунок A1

    Пары FRET флуоресцентного белка с красным смещением. ( A ) mCyRFP1/mMaroon, ( B ) mCyRFP1/mScarlett-i, ( C ) mKO2/mMaroon, ( D ) mKO2/tagRFP.Спектры возбуждения и спектры испускания каждого донорного и акцепторного флуоресцентных белков показаны на правом рисунке для каждой пары FRET. Полосовой фильтр флуоресценции 586/20 показан между черными полосами на среднем рисунке для каждой пары FRET. Этот полосовой фильтр должен быть оптимален для определения времени жизни донора без помех со стороны акцептора. На левом рисунке, показанном для каждой пары FRET, показаны спектры возбуждения, где синяя линия указывает на лазерное возбуждение с длиной волны 473 нм, а зеленая линия — с лазерным возбуждением на длине волны 532 нм.

    Рисунок A2

    LOPAC попал в кривые концентрация-реакция (CRC). Зависящие от концентрации изменения FRET нанесены на график для всех девяти перекрывающихся ударов 2CS FRET. На левой панели показаны CRC Δ времени жизни из биосенсора FRET 2CS (G/R) (, черный ) и контрольные клеточные линии из GFP-только (, зеленый, ) и нуль-линкера GFP/RFP G32R (, синий, ). В правой части рисунка показаны CRC Δ продолжительности жизни из биосенсора FRET 2CS (O/M) ( красный ) и контрольные клеточные линии из GFP-only ( оранжевый ) и OFP/MFP O5M нулевой линкер ( синий ).

    FRET происходит путем передачи безызлучательной энергии между диполь-дипольными взаимодействиями, обычно между молекулой донора с более короткой длиной волны в возбужденном электронном состоянии, и молекулой-акцептором с более длинной длиной волны в основном состоянии. Вероятность передачи энергии зависит от спектрального перекрытия между спектрами излучения и поглощения донора и акцептора, квантового выхода флуоресценции донора, молярной абсорбции (коэффициента экстинкции) акцептора, а также расстояния и ориентации диполя. взаимодействие.Вероятность передачи энергии определяется как эффективность FRET ( E ), которая прямо пропорциональна скорости передачи энергии ( k T ) и зависимости R −6 от расстояния между донором и акцептором. Расстояние Форстера ( R 0 ), показанное в (Уравнение (A1)) – это расстояние между конкретной парой FRET донор-акцептор, при котором вероятность эффективности FRET составляет 50%.

    R0=9,790[J(λ)κ2η−4φD]16

    (A1)

    Расстояние Форстера ( R 0 ) определяется площадью перекрытия спектров флуоресценции излучения донора и возбуждения акцептора J ( λ ), относительная ориентация переходных диполей донора и акцептора κ 2 , квантовый выход донора φ D (не в присутствии акцептора), показатель преломления среды η .Коэффициент ориентации ( κ ) обычно принимается равным 2/3. Это подходит для пар доноров и акцепторов, связанных гибкими линкерами, где движение является динамическим и не ограничивается стерически. R 0 больше всего зависит от интеграла перекрытия J ( λ ) конкретной пары FRET. Возможность определения расстояния между двумя флуоресцентными зондами позволяет использовать FRET в качестве мощного инструмента для определения молекулярных взаимодействий и прямого количественного измерения измерения с точки зрения расстояния и, возможно, ориентации.Чувствительность FRET определяется расстоянием Форстера ( R 0 ) и является самой высокой, когда расстояние между донорным и акцепторным зондами составляет около R 0 .

    Авторские вклады

    Концептуализация, Т.М.С., Б.Д.Г., Г.Д.Г. и Д.Д.Т.; Methodology, TMS, BDG, AL, EK, PB и SLY; Программное обеспечение, B.D.G. и К.Ч.П.; Валидация, B.D.G. и С.Л.И.; Формальный анализ, TMS, BDG и SLY; Расследование, А.Л., Е.К., и Т.РС.; Ресурсы, JL; Написание — подготовка первоначального проекта, T.M.S. и ДДТ; Написание-обзор и редактирование, TMS, DDT и GDG; Приобретение финансирования, D.D.T. и Г.Д.Г.

    Финансирование

    Авторы сообщили о получении следующей финансовой поддержки для исследования, написания и/или публикации этой статьи: Эта работа была поддержана грантами NIH R42DA037622 (для G.D.G. и D.D.T.), R01GM27906 (для D.D.T.), R01HL129814 (к ДДТ) и R37 AG026160 (к ДДТ). Т.М.С. был поддержан грантом NIH Minnesota Muscle Training Grant и педагогами K12 IRACDA Training Research в Миннесоте (TREM).

    Конфликт интересов

    Томас владеет акциями и является исполнительным директором Photonic Pharma LLC. Эти отношения были рассмотрены и управляются Миннесотским университетом.

    Ссылки

    1. Хоу З., Ху З., Блэквелл Д.Дж., Миллер Т.Д., Томас Д.Д., Робиа С.Л. 2-цветная кальциевая помпа показывает закрытие цитоплазматической головки со связыванием кальция. ПЛОС ОДИН. 2012;7:e40369. doi: 10.1371/journal.pone.0040369. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]2.Грубер С.Дж., Корнеа Р.Л., Ли Дж., Петерсон К.С., Шааф Т.М., Гиллиспи Г.Д., Даль Р., Зебо К.М., Робиа С.Л., Томас Д.Д. Открытие модуляторов ферментов с помощью высокопроизводительного FRET с временным разрешением в живых клетках. Дж. Биомол. Экран. 2014;19:215–222. doi: 10.1177/1087057113510740. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]3. Страйер Л. Перенос энергии флуоресценции как спектроскопическая линейка. Анну. Преподобный Биохим. 1978; 47: 819–846. doi: 10.1146/annurev.bi.47.070178.004131. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]4.Муретта Дж.М., Кириченко А., Ладохин А.С., Каст Д., Гиллиспи Г.Е., Томас Д.Д. Высокоэффективная флуоресценция с временным разрешением за счет прямой записи сигнала. преподобный наук. Инструм. 2010;81:103101–103108. doi: 10.1063/1.3480647. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5. Муретта Дж.М., Петерсен К.Дж., Томас Д.Д. Прямое обнаружение в режиме реального времени активируемого актином силового удара в каталитическом домене миозина. проц. Натл. акад. науч. США. 2013;110:7211–7216. doi: 10.1073/pnas.1222257110. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]6.Корнеа Р.Л., Грубер С.Дж., Локами Э.Л., Муретта Дж.М., Джин Д., Чен Дж., Даль Р., Бартфай Т., Зебо К.М., Гиллиспи Г.Д. и др. Высокопроизводительный анализ FRET дает аллостерические активаторы SERCA. Дж. Биомол. Экран. 2013; 18:97–107. doi: 10.1177/1087057112456878. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]7. Петерсен К.Дж., Петерсон К.С., Муретта Дж.М., Хиггинс С.Е., Гиллиспи Г.Д., Томас Д.Д. Флуоресцентный считыватель планшетов на весь срок службы: разрешение и точность соответствуют высокой пропускной способности. преподобный наук. Инструм.2014;85:113101. doi: 10.1063/1.4

    7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]8. Ло Ч.Х., Вуннам Н., Льюис А.К., Чиу Т.Л., Браммель Б.Е., Шааф Т.М., Грант Б.Д., Баваскар П., Томас Д.Д., Сакс Дж.Н. Инновационный высокопроизводительный подход к скринингу для обнаружения малых молекул, ингибирующих рецепторы TNF. СЛАС Дисков. 2017;22:950–961. doi: 10.1177/2472555217706478. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]9. Шааф Т.М., Петерсон К.С., Грант Б.Д., Баваскар П., Юэн С., Ли Дж., Муретта Дж.М., Гиллиспи Г.Д., Томас Д.Д. Высокопроизводительный спектральный и пожизненный скрининг FRET в живых клетках для выявления низкомолекулярных эффекторов SERCA. СЛАС Дисков. 2017;22:262–273. doi: 10.1177/1087057116680151. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]10. Шааф Т.М., Петерсон К.С., Грант Б.Д., Томас Д.Д., Гиллиспи Г.Д. Спектральный считыватель планшетов без смешивания: высокопроизводительные и высокоточные анализы FRET в живых клетках. СЛАС Дисков. 2017;22:250–261. doi: 10.1177/1087057116679637.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]11. Вальдек-Вейермайр М., Бишоф Х., Бласс С., Деак А.Т., Клек К., Грайер Т., Роллер С., Рост Р., Эроглу Э., Готтшалк Б. и др. Генерация камелеонов с красным смещением для визуализации Ca 2+ Динамика эндоплазматического ретикулума. Датчики. 2015;15:13052–13068. doi: 10.3390/s150613052. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]12. Крэнфилл П.Дж., Селл Б.Р., Бэрд М.А., Аллен Дж.Р., Лаваньино З., де Груйтер Х.М., Кремерс Г.Дж., Дэвидсон М.В., Устионе А., Пистон Д.В. Количественная оценка флуоресцентных белков. Нац. Методы. 2016;13:557–562. doi: 10.1038/nmeth.3891. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]13. Баджар Б.Т., Лам А.Дж., Бади Р.К., О Ю.Х., Чу Дж., Чжоу X.X., Ким Н., Ким Б.Б., Чунг М., Яблонович А.Л. и др. Флуоресцентные индикаторы для одновременной регистрации всех четырех фаз клеточного цикла. Нац. Методы. 2016;13:993–996. doi: 10.1038/nmeth.4045. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]15.Юнг Г., Брохинке А., Генш Т., Хётцер Б., Шведлер С., Веттил С.К. Флуоресцентные белки I: от понимания к дизайну. Том 11. Спрингер; Берлин/Гейдельберг, Германия: 2011. Время жизни флуоресценции флуоресцентных белков; стр. 69–97. [Google Академия] 16. Роде Дж. А., Томас Д. Д., Муретта Дж. М. Лекарство от сердечной недостаточности изменяет механоэнзимологию сердечного миозинового удара. проц. Натл. акад. науч. США. 2017;114:E1796–E1804. doi: 10.1073/pnas.1611698114. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]17.Муретта Дж.М., Роде Дж.А., Джонсруд Д.О., Корнеа С., Томас Д.Д. Прямое обнаружение в режиме реального времени структурных и биохимических событий в силовом ударе миозина. проц. Натл. акад. науч. США. 2015;112:14272–14277. doi: 10.1073/pnas.1514859112. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]18. Лавив Т., Ким Б.Б., Чу Дж., Лам А.Дж., Лин М.З., Ясуда Р. Одновременная двухцветная флуоресцентная визуализация при жизни с новыми флуоресцентными белками с красным смещением. Нац. Методы. 2016;13:989–992. doi: 10.1038/nmeth.4046. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]19. Палликкут С., Блэквелл Д.Дж., Ху З., Хоу З., Зиман Д.Т., Свенссон Б., Томас Д.Д., Робиа С.Л. Фосфорилированный фосфоламбан стабилизирует компактную конформацию сердечной кальций-АТФазы. Биофиз. Дж. 2013; 105:1812–1821. doi: 10.1016/j.bpj.2013.08.045. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]21. Suhling K., Siegel J., Phillips D., French P.M., Leveque-Fort S., Webb S.E., Davis D.M. Визуализация окружения зеленого флуоресцентного белка.Биофиз. Дж. 2002; 83: 3589–3595. doi: 10.1016/S0006-3495(02)75359-9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]22. Чжан Дж.Х., Чанг Т.Д., Ольденбург К.Р. Простой статистический параметр для использования при оценке и валидации высокопроизводительных скрининговых анализов. Дж. Биомол. Экран. 1999; 4: 67–73. doi: 10.1177/1087057190206. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23. Мюллер Б., Карим К.Б., Неграшов И.В., Кутчай Х., Томас Д.Д. Прямое обнаружение взаимодействия фосфоламбана и Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума в мембранах с использованием резонансного переноса энергии флуоресценции.Биохимия. 2004; 43:8754–8765. doi: 10.1021/bi049732k. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Свенссон Б., Отри Дж.М., Томас Д.Д. Молекулярное моделирование флуоресцентных биосенсоров SERCA. Методы Мол. биол. 2016;1377:503–522. doi: 10.1007/978-1-4939-3179-8_42. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Шах М.М., Джавадзаде-Табатабаи М., Бентон Д.К., Ганеллин К.Р., Хейлетт Д.Г. Повышение возбудимости пирамидных клеток гиппокампа с помощью нового селективного блокатора каналов медленной постгиперполяризации 3-(трифенилметиламинометил)пиридина (UCL2077) Mol.Фармакол. 2006; 70:1494–1502. doi: 10.1124/мол.106.026625. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]26. Чжэн В., Рампе Д., Триггл Д.Дж. Фармакологические, радиолигандные и электрофизиологические характеристики FPL 64176, нового недигидропиридинового активатора каналов Ca 2+ , в сердечных и сосудистых препаратах. Мол. Фармакол. 1991; 40: 734–741. [PubMed] [Google Scholar] 27. Гок А., Аль-Азайзи А., Абдалла М., Аль-Хусейн Б., Кавури С., Ли Дж., Мозес К., Соманат П.Р.Активированная киназа-1 P21 (Pak1) способствует росту опухоли предстательной железы и микроинвазии посредством ингибирования экспрессии трансформирующего фактора роста бета и усиленной секреции матриксной металлопротеиназы 9. Дж. Биол. хим. 2013; 288:3025–3035. doi: 10.1074/jbc.M112.424770. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]28. Фернандес-Тенорио М., Ниггли Э. Стабилизация передачи сигналов Ca 2+ в сердечной мышце путем стимуляции SERCA. Дж. Мол. Клетка. Кардиол. 2018;119:87–95. doi: 10.1016/j.yjmcc.2018.04.015. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

    Грант Двухсотлетие — Национальное историческое место Улисса С. Гранта (Служба национальных парков США)

    Ассоциация Улисса С. Гранта

    Празднование 200-летия со дня рождения Улисса С. Гранта

    Большинство людей знают Улисса С. Гранта как самого высокопоставленного генерала страны во время Гражданской войны в США и президентом на два срока в эпоху Реконструкции. Он также был любящим мужем, преданным отцом четверых детей и человеком, преданным своей стране и идеалам более совершенного союза.Грант — одна из самых важных фигур в истории США XIX века, и его наследие сложное, замечательное и вдохновляющее.

    Присоединяйтесь к Национальному историческому месту Улисса С. Гранта в 2022 году, когда мы отмечаем 200-летие Улисса С. Гранта. В течение года в парке будет проходить более 15 личных программ, посвященных двухсотлетию и рассказывающих людям всех возрастов о наследии Гранта.

    Грант События двухсотлетия, происходящие в апреле

    Выходные гражданской войны – Appomattox
    Суббота, 9 апреля и воскресенье, 10 апреля 157 -я годовщина принятия генералом Грантом капитуляции генерала Ли в здании суда Аппоматтокс, событие, которое считается окончанием Гражданской войны.Мероприятие выходного дня будет включать презентации о капитуляции, солдатских лагерях, демонстрациях исторического оружия, презентации гражданского населения, демонстрацию фотографий 19 го века, мероприятия для детей и информацию об исследованиях ваших предков времен Гражданской войны. Ежедневно в 14:30 Дэн Хоги будет ставить одноактную пьесу от первого лица «Мистер Робот». Грант США: Человек и патриот!» Для полного расписания событий и мероприятий посетите календарь событий парка.

    200 День рождения Гранта
    Среда, 27 апреля
    Время уточняется
    Присоединяйтесь к нам на праздновании 200 дня рождения Улисса С.Грант с различными мероприятиями и презентациями. В течение дня вы можете помочь сделать открытки для ветеранов в домах ветеранов штата Миссури в честь двухсотлетия Гранта. Сюзанна Корбетт, историк еды и кулинарный инструктор, проведет программу о тортах и ​​десертах 19 го века в столовой Белой Гавани. Рейнджер парка Ник Сакко и член правления Ulysses S. Grant Association Джон Самсон проведут презентацию о Гранте в театре парка. В тот вечер Independent Silver Band выступит на территории парка с часовым концертом, который начнется в 18:30.Эта программа представлена ​​в партнерстве с Ассоциацией Улисса С. Гранта/Университетом штата Миссисипи.

    Run Through History
    Суббота, 23 апреля
    9:00 – 10:30
    Присоединяйтесь к гиду по парку Эштону Фарреллу для 90-минутной пробежки в умеренном темпе на 3 мили от дома Улисса С. Гранта, Уайт-Хейвен, на кладбище Святого Павла и обратно. Бегуны изучат историю Грантвуд-Виллидж и первоначальное местонахождение хижины Гранта «Хардскрэббл». Столик нужно заказывать заранее.Звоните 314-842-1867 доб. 230.

    Национальный день юных рейнджеров – Грант США 200
    Суббота, 23 апреля
    11:00 – 15:00
    Это официальный запуск нашей программы US Grant 200 Junior Ranger! Мы разработали буклет с мероприятиями для детей всех возрастов, чтобы узнать больше о жизни Гранта и получить значок US Grant 200 Junior Ranger. Кроме того, у нас будут другие интересные практические занятия для всей семьи.

    Прогулка по истории
    Воскресенье, 24 апреля
    14:00 – 16:00
    Присоединяйтесь к гиду по парку Эштону Фарреллу, чтобы совершить 90-минутную прогулку в 3 милях от Ulysses S.Дом Гранта, Белая Гавань, на кладбище Святого Павла и обратно. Пешеходы изучат историю Грантвуд-Виллидж и первоначальное местонахождение хижины Гранта «Хардскрэббл». Столик нужно заказывать заранее. Звоните 314-842-1867 доб. 230.

    Грант и лошади в Белой Гавани
    Суббота, 30 апреля
    10:00 – 16:00
    На протяжении всей жизни Гранта лошади играли важную роль. Он любил ездить верхом, тренироваться и ухаживать за лошадьми с тех пор, как был маленьким мальчиком. Лошади также были жизненно важны для него как солдата и фермера.На этом мероприятии посетители узнают больше о лошадях и об отношении Гранта к ним на протяжении всей его жизни. Многочисленные лошади от местных владельцев ранчо и частных лиц будут в парке, проводя как формальные, так и неформальные демонстрации. У нас также будут презентации о верховой езде Гранта, седлах, истории гонок и практических занятиях для детей.

    Текущие специальные мероприятия

    Возьмите Гранта во второе мировое турне
    Возьмите «Плоский грант» в центре посетителей парка, чтобы раскрасить его и взять с собой в путешествие.Поделитесь своими селфи с Грантом в социальных сетях во время путешествия с #USGrant2ndWorldTour (доступен в середине марта). Национальный день юных рейнджеров, 23 апреля. Мероприятия будут посвящены всем аспектам жизни Гранта.

    Сделайте открытки для отправки ветеранам штата Миссури
    В честь дня рождения Гранта мы будем делать и отправлять открытки ветеранам в домах ветеранов штата Миссури, информируя их о двухсотлетии Гранта и о том, как Грант признателен ветеранам.По выходным в апреле и в день рождения Гранта (27 апреля) у нас будут накрыты столы с принадлежностями для посетителей, которые помогут сделать открытки.

    Другие события и мероприятия:

    • Премьер-министр страны Курт Филдс, имитатор Гранта, посещает парк вечером во вторник, 17 мая.
    • Специальные тематические экскурсии по поместью Улисса С. Гранта в Белой Гавани в течение всего лета.

    • Прогулки по галерее, сенсорные столы и диалоговые программы в музее парка в течение всего лета.

    • Серия вечерних летних концертов с музыкой из стран, которые Грант посетил во время своего мирового турне.

    • выступления рейнджеров и специальные приглашенные докладчики в течение года.


    Чтобы узнать больше о национальных усилиях по празднованию двухсотлетия Гранта, посетите веб-сайт Ассоциации Улисса С. Гранта.

    Любые вопросы о программах Bicentennial можно направлять менеджеру программ парка по телефону 314-842-1867 доб.223. Календарь программ парка будет часто обновляться. Нажмите на ссылки ниже, чтобы быть в курсе последних событий в Национальном историческом музее Улисса С. Гранта!

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка браузера на прием файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

    Иностранные студенты беспокоятся о барьерах, которые мешают им поехать в Канаду

    ВАНКУВЕР — Перспективная студентка из Пакистана, которая будет поступать в Университет Саймона Фрейзера в Ванкувере, говорит, что она «сходит с ума шаг за шагом», преодолевая препятствия на пути к получению образования, которые значительно усложнил COVID-19.

    Зохра Шахабуддин сказала, что провела бессонные ночи, беспокоясь о том, чтобы собрать документы для подачи заявления на получение студенческой визы в Канаду.

    Ее виза была одобрена на прошлой неделе. Она будет работать над получением степени магистра в области издательского дела.

    «У меня не было возможности взволноваться по поводу приезда в Ванкувер», — сказала она со смехом.

    «Мой разум занят. Сначала это была виза, теперь перелеты и карантин».

    Иностранные студенты, приезжающие в Канаду в этом году, поскольку случаи заболевания COVID-19 растут и сокращаются в различных частях мира, сталкиваются с многочисленными препятствиями, такими как невыполнение виз, отсутствие прививок, карантинные меры и меньшее количество доступных рейсов.

    Представитель Министерства иммиграции, беженцев и гражданства Канады заявила, что департамент продолжал принимать и обрабатывать заявки на получение разрешения на учебу на протяжении всей пандемии.

    Он обновил свой веб-сайт, чтобы показать, что полные заявки на получение разрешения на учебу, поданные на осенний семестр 2021 года до 15 мая, будут обработаны к 6 августа. Однако некоторые заявки могут занять больше времени, поскольку они неполные, говорится в заявлении Нэнси Карон.

    «На фоне глобальной пандемии и связанных с ней проблем мы хотели указать целевую дату для тех, кто планирует начать учебу осенью», — сказала она.

    По ее словам, департамент выдал почти 100 000 разрешений на учебу за первые четыре месяца 2021 года по сравнению с примерно 66 000 за тот же период прошлого года и около 96 000 с января по апрель 2019 года.

    Мухаммед Саад был принят в Centennial College в Торонто для получения диплома в области управления проектами, и ему сделали первую прививку вакцины Oxford-AstraZeneca.

    Он сказал, что беспокоится о доступе ко второму снимку.

    «Это зависит от поставок», — сказал он.«Моя вторая доза в середине июля. Я надеюсь, что в это время вакцина будет доступна в Пакистане».

    Несколько университетов потребуют, чтобы студенты, проживающие в общежитиях, были вакцинированы против COVID-19 в сентябре.

    У студентов, которые не могут получить доступ к вакцине до заселения, будет 14 дней, чтобы сделать это, сказала Сэнди Уэлш, вице-ректор по работе со студентами Университета Торонто.

    Западный университет также заявил, что у тех, кто не может получить доступ к вакцинам, будет 14 дней, чтобы пройти вакцинацию в кампусе.

    По словам Кэрон, те, кто не полностью вакцинирован, должны будут следовать требованиям федерального правительства.

    По ее словам, чтобы считаться полностью вакцинированными, те, кто въезжает в Канаду, должны будут показать, что они получили обе прививки или комбинацию вакцин Pfizer-BioNTech, Moderna, AstraZeneca или одну дозу Johnson & Johnson не менее чем за 14 дней до въезда в страну.

    Шахабуддин сказал, что это означает, что ей придется найти еще 2000 долларов, чтобы остаться на карантине. Она планирует сделать прививки после приезда в Канаду.

    «Как иностранный студент, я уже плачу много денег», — сказала она. «Это дополнительные расходы».

    Многие университеты предлагают жилье на время карантина.

    Уэлш сказал, что студентам будет предложен транспорт из аэропорта, ежедневные звонки для проверки здоровья и другие виды поддержки.

    Следующей заботой Шахабуддина является болезнь во время путешествия, а также последующие медицинские расходы.

    Это те же самые опасения, которые Канадская федерация студентов слышала от других, сказал Бипин Кумар, представитель этой организации от иностранных студентов.

    «По крайней мере, одна из вещей, которую мы слышим, касается того, будет ли дополнительная медицинская страховка, предлагаемая частными компаниями, покрывать студентов на случай, если они заболеют из-за поездки», — сказал он.

    «Многие путешествуют до того, как они приедут в Канаду, и обычно страховка предоставляется только после того, как они зарегистрируются с 1 сентября».

    По его словам, федерация работает с университетами и правительствами провинций, чтобы получить более подробную информацию.

    Али Хассан, который был принят в Йоркский университет в Торонто, сказал, что процесс получения визы продвигается медленно, и у него может не хватить времени на поездку, поэтому он рад, что университет предлагает онлайн-курсы.

    «Но я немного беспокоюсь», — сказал он, добавив, что проверяет свою электронную почту несколько раз в день на предмет одобрения.

    «Я надеюсь», — добавил Хассан. «Я надеюсь, что смогу приехать в Канаду этой осенью».

    В этом семестре ряд университетов будут предлагать сочетание онлайн- и очных занятий, поскольку студенты преодолевают препятствия, вызванные пандемией.

    Мэтью Рэмси, представитель Университета Британской Колумбии, сказал, что у студентов будет возможность пройти онлайн-курсы, если они не смогут приехать в Канаду в этом семестре.

    «Мы будем работать с ними в каждом конкретном случае, чтобы они могли получить доступ к своим курсам, будь то онлайн или лично».

    границ | Микроскопия Phasor Histone FLIM-FRET Картирует наноразмерную архитектуру хроматина в масштабе всего ядра в отношении генетически индуцированных разрывов двухцепочечной ДНК

    Введение

    Внутри ядра живой клетки ДНК свернута вокруг гистоновых белков в нуклеосомы и компактирована в мульти- слоистая трехмерная (3D) структура, называемая хроматином (Luger et al., 2012; Бикмор, 2013 г.; Бонев и Кавалли, 2016). В любой момент времени двухцепочечный разрыв ДНК (DSB) может произойти в любом месте этой динамической структурной структуры, и каким-то образом система клеточного наблюдения, называемая «реакцией на повреждение ДНК» (DDR) (Jackson and Bartek, 2009), имеет способность мгновенно обнаруживать индукцию DSB и задействовать механизм восстановления для этого типа генетического повреждения (Kalousi and Soutoglou, 2016; Hauer and Gasser, 2017; Marnef and Legube, 2017). Первоначально хроматин рассматривался как препятствие для восстановления DSB, которое DDR должен сначала «открыть», а затем восстановить после разрешения DSB.Однако совсем недавно стало очевидно, что статус уплотнения хроматина DSB играет более активную роль в передаче сигналов о повреждении ДНК и выборе пути восстановления DSB (Soria et al., 2012; Lemaître et al., 2014; Clouaire and Legube, 2015; Поло и Альмоузни, 2015). Было показано, что локальная реорганизация в архитектуре сети хроматина пространственно-временно модулирует прибытие и удержание различных факторов репарации ДНК в сайтах DSB (Hinde et al., 2014; Smith et al., 2019). Т.о., чтобы понять, как целостность генома поддерживается на клеточном уровне, возникает потребность в изучении репарации DSB в контексте хроматина и трехмерного ядерного ландшафта живой клетки.

    События «открытия» и «уплотнения» хроматина, которые следуют за индукцией DSB (Klement et al., 2014; Kalousi et al., 2015; Thorslund et al., 2015; Luijsterburg et al., 2016), подкрепляются наномасштабными изменениями в пространстве между нуклеосомами (Hauer and Gasser, 2017), и эта динамика происходит в пространственном масштабе, который значительно ниже дифракционного предела оптической микроскопии (Luger and Hansen, 2005; Ou et al., 2017; Ohno et al., 2018; Ochs et al., 2019; Whelan and Rothenberg, 2021). Таким образом, с целью визуализировать любые изменения локальной структуры хроматина, вызванные DDR, видимыми в живой клетке, мы недавно продемонстрировали, что резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) между флуоресцентно мечеными гистонами является чувствительным считыванием близости нуклеосом в реальном времени во время DSB. восстановление (Лу и др., 2019), которые могут быть пространственно картированы по всей нуклеоплазме с помощью векторного подхода к микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM) (Liang et al., 2020). Из сочетания обнаружения FLIM FRET между гистоном h3B, меченным в eGFP (h3B-eGFP), и mCherry (h3B-mCh) с индукцией DSB с помощью лазерного микрооблучения в ближней инфракрасной области (NIR) мы количественно оценили событие быстрого разуплотнения хроматина, центральное для ДНК. репарационный локус, который был окружен границей компактных фокусов хроматина, и обнаружили, что эта структура хроматина имеет решающее значение для своевременного накопления факторов репарации ДНК в сайте DSB (Lou et al., 2019). Таким образом, этот фазорный гистоновый анализ FLIM-FRET потенциально может стать бесценным инструментом для биологов, изучающих репарацию DSB, поскольку он имеет достаточное пространственно-временное разрешение, чтобы выявить то, что обычно является невидимым слоем регуляции клеточного DDR.

    Здесь, в этом исследовании, мы демонстрируем способность анализа фазорных гистонов FLIM-FRET для пространственного картирования архитектуры хроматина в отношении повреждения ДНК в DSB, индуцируемом с помощью клеточной системы AsiSI (DIvA) (Iacovoni et al., 2010). Клетки DIvA содержат индуцируемый 4-гидрокситамоксифеном (4OHT) рестрикционный фермент AsiSI, который позволяет индуцировать приблизительно 100 сайт-специфических DSB по всему геному при обработке 4OHT (Iacovoni et al., 2010; Массип и др., 2010; Аймард и др., 2014). Таким образом, путем мультиплексирования фазового гистона FLIM-FRET с иммунофлуоресценцией (IF) против фосфорилированного серина 139 варианта гистона 2AX (γh3AX) мы можем пространственно картировать уплотнение хроматина по всему ядру на уровне близости нуклеосом относительно местоположения DIvA DSB. Из анализа изображения этого трехцветного эксперимента с несколькими ядрами DIvA мы пришли к выводу, что в соответствии с нашим предыдущим исследованием с использованием лазерного микрооблучения NIR (Lou et al., 2019), что индукция DSB индуцирует событие глобального уплотнения хроматина, которое окружает участки повреждения ДНК, которые статистически представляют ядерные местоположения, находящиеся в более «открытом» состоянии хроматина. В то время как преимущество NIR-лазерного микрооблучения как метода индукции DSB заключалось во временном разрешении, важным преимуществом клеточной системы DIvA является доступ к пространственной неоднородности, которая лежит в основе этого количественного ответа хроматина. Таким образом, в последнем эксперименте, чтобы продемонстрировать эту полезность, мы проводим эксперимент с четырьмя цветами, который позволяет изучить структуру хроматина, о которой сообщает гистоновая FRET, как функцию пути репарации DSB.Мы ожидаем, что эта уникальная способность анализа векторного гистона FLIM-FRET в DIvA наряду с IF может облегчить открытие того, как именно структура хроматина регулирует ответ на повреждение ДНК DSB.

    Результаты

    Фазорная гистоновая микроскопия FLIM-FRET в сочетании с IF картирует общеядерные изменения уплотнения хроматина по отношению к индукции DSB в клеточной системе DIvA. Чтобы количественно оценить локальное и глобальное состояние уплотнения хроматина в архитектуре ядра в отношении нескольких сайт-специфических DSB, здесь мы объединяем анализ FLIM-FRET фазового гистона с IF γh3AX в клеточной системе DIvA.FRET — это оптическое явление, которое сообщает о взаимодействии флуоресцентного белка с белком в масштабе 1–10 нм, а в контексте хроматина, меченного донорно-акцепторными флуоресцентными гистонами (Llères et al., 2009), FRET сообщает о близости нуклеосом с разрешением в наномасштабе. . Таким образом, чтобы реализовать гистоновый FRET в клеточной системе DIvA, мы сначала трансфицировали клетки DIvA с помощью h3B, помеченного eGFP (h3B-eGFP), в отсутствие (донорский контроль) по сравнению с присутствием mCherry (h3B-mCh) (рис. 1A, B). Затем в фиксированных и промытых ядрах DIvA, экспрессирующих донорский контроль по сравнению с парой FRET донор-акцептор, мы получили данные FLIM в канале h3B-eGFP (донор), где тушение времени жизни донора в присутствии h3B-mCh (акцептор) сообщает о гистоновом FRET. (Рисунки 1C,D).Количественная оценка этого донорского контроля по сравнению с экспериментом FRET гистона в клеточной системе DIvA с помощью векторного подхода к анализу времени жизни позволила охарактеризовать эффективность FRET компактного хроматина как 16% (т.е. сдвиг времени жизни донора с 2,5 до 2,1 нс) (рис. 1C). и определение палитры на основе курсора для пространственного сопоставления компактного (красные пиксели) и открытого хроматина (бирюзовые пиксели) во всех ядрах DIvA (рис. 1D).

    РИСУНОК 1 . Phasor histone FLIM-FRET в сочетании с γh3AX IF выявляет индукцию DSB в клеточной системе DIvA, чтобы вызвать уплотнение хроматина по всему ядру. (A, B) Фиксированные ядра DIvA, экспрессирующие h3B-eGFP (A) в отсутствие (слева) по сравнению с присутствием (справа) h3B-mCh (B) (масштабная линейка 10 мкм). (C) Векторное распределение h3B-eGFP в отсутствие (донорский контроль) по сравнению с присутствием h3B-mCh (гистоновый FRET-эксперимент) с наложенной теоретической траекторией FRET (черная кривая), которая простирается от времени жизни нетушеного донора (бирюзовый курсор, 2,5 нс). Эта траектория FRET позволяет охарактеризовать эффективность FRET гистонов как 16% (красный курсор, 2.1 нс) и определение палитры для обнаружения открытого (бирюзового) и компактного (красного) хроматина. (D) FLIM-карты h3B-eGFP в отсутствие (слева) по сравнению с присутствием (справа) h3B-mCh, псевдоокрашенные в соответствии с палитрой FRET, определенной на векторной диаграмме панели (C) . (E) IF против γh3AX в DIvA до и после 2 часов обработки 4OHT (масштабная линейка 20 мкм). (F–H) Фиксированные ядра DIvA, коэкспрессирующие гистоновую пару FRET h3B-eGFP (F) и h3B-mCh (G) с IF против γh3AX (H) в отсутствие (слева) по сравнению с присутствием (справа) после 2 часов обработки 4OHT (масштабная линейка 10 мкм). (I) FLIM-карты клеток, представленные на панелях (F-H) , псевдоокрашенные в соответствии с палитрой FRET, определенной на панели (C) . (J) Количественное определение доли пикселей в векторном курсоре, который сообщает об отсутствии FRET (открытый хроматин) по сравнению с FRET гистонов (компактный хроматин) в клетках, представленных на панели (I) . (K) Количественное определение доли пикселей в векторном курсоре, который сообщает о гистоновом FRET (компактном хроматине) в нескольких клетках до и после 2 часов обработки 4OHT (N = 11 и 47 клеток соответственно, три биологических повтора).На графике с прямоугольниками и усами показаны минимум, максимум и выборочная медиана. * p < 0,05 (непарный t -тест).

    Чтобы затем использовать гистоновый FRET в качестве считывания архитектуры сети хроматина в отношении участков индукции DSB в клеточной системе DIvA, мы сначала подтвердили с помощью IF для γh3AX Alexa Fluorophore 647 (γh3AX-AF647) в клетках DIvA, зафиксированных через 2 часа после 4 Лечение -гидрокситамоксифеном (4OHT), при котором в геноме образуются множественные DSB (рис. 1E). Затем, благодаря тщательному планированию эксперимента с многоцветной визуализацией, целью которого было измерение FRET гистонов между h3B-eGFP и h3B-mCh (рис. 1F, G) в присутствии γh3AX-AF647 IF (рис. 1H), мы пространственно сопоставили компактные и открытые хроматин в присутствии множественных фокусов DSB по сравнению с отсутствием (рис. 1I) без артефактов от добавления 4OHT (дополнительный рисунок S1).Количественная оценка этого эксперимента с мультиплексной визуализацией путем расчета доли пикселей, демонстрирующих гистоновый FRET (наши показания компактного состояния хроматина) (рис. 1J), выявила генетическую индукцию DSB, которая инициирует значительное уплотнение хроматина по всему ядру при применении к нескольким клеткам (рис. 1K). . Этот результат наряду с качественным сравнением локализации γh3AX-AF647 с гистоновым FRET после обработки 4OHT (рис. 1H, I, справа) позволяет предположить, что сайты DSB занимают несколько «открытых» областей хроматина, которые существуют в пределах обнаруженного события уплотнения хроматина по всему ядру.Таким образом, для дальнейшего изучения этого наблюдения мы затем провели анализ масок на основе γh3AX-AF647 карт FRET гистонов, полученных после обработки 4OHT, чтобы обеспечить количественную оценку локального (внутри сайта DSB) по сравнению с глобальным (вне сайта DSB) хроматина. ответ на индукцию DSB.

    Для создания маски, позволяющей анализировать гистоновый FRET-анализ уплотнения хроматина внутри и снаружи очагов DSB (рис. 2A–D), был использован порог, основанный на γh3AX-AF647 IF (рис. 2E). Эта бинарная маска позволила выбрать пиксели на карте FLIM, которые занимают сайты DSB по сравнению с окружающей нуклеоплазмой (рис. 2F), и количественно определить долю пикселей, демонстрирующих гистоновый FRET в любой среде (рис. 2G).Из применения этого анализа к нескольким клеткам после обработки 4OHT (рис. 2H) мы подтвердили, что сайты DSB статистически находятся в более «открытом» состоянии хроматина, чем окружающая среда хроматина, которая была уплотнена при индукции DSB (рис. 1). Интересно, что эта дифференциально регулируемая реорганизация локальной и глобальной структур хроматина, которая была вызвана генетическим разрезанием нескольких DSB в разных ядерных местоположениях, находится в прямом согласии с нашим предыдущим исследованием, в котором FRET гистонов сочетался с лазерным микрооблучением NIR для разрезания нескольких DSB на одном уровне. единственное ядерное расположение (Lou et al., 2019). Таким образом, в то время как NIR-лазерное микрооблучение было выгодным с точки зрения временного разрешения и позволяло наблюдать за ранними изменениями в структуре хроматина DSB, явным преимуществом клеточной системы DIvA для оценки гистонового FRET хроматина DSB во время восстановления является потенциал для этого анализа. исследуйте любую пространственную неоднородность, которая лежит в основе этой реакции.

    РИСУНОК 2 . Масочный анализ гистонов FRET в клеточной системе DIvA на основе IF показывает, что хроматин «открыт» в местах индукции DSB. (A–C) Ядро DIvA, коэкспрессирующее пару гистонов FRET h3B-eGFP (A) и h3B-mCh (B) , которое было зафиксировано с помощью IF против γh3AX (C) через 2 ч после обработка 4OHT (шкала 10 мкм). (D) FLIM-карта клетки, представленная на панелях (A–C) , псевдоокрашенная для отображения FRET гистонов (красные пиксели) по сравнению с не-FRET (бирюзовые пиксели). (E) Маски на основе γh3AX IF, представленные на панели (C) , которые выбирают хроматин внутри (слева) по сравнению с внешним (справа) DSB DIvA. (F) Псевдоокрашенные гистоновые карты FRET с порогом, определяемым масками, представленными на панели (E) , применяемые для выбора внутри (слева) по сравнению с внешними (справа) DSB. (G) Доля пикселей, сообщающих о FRET (компактном хроматине) по сравнению с отсутствием FRET (открытый хроматин) на замаскированных картах FLIM, представленных на панели (F) . (H) Количественное определение фракции гистонового FRET (компактного хроматина) внутри и снаружи DSB после 2 часов обработки 4OHT в нескольких клетках (N = 29 клеток, три биологических повтора).На графике с прямоугольниками и усами показаны минимум, максимум и выборочная медиана. **** p < 0,0001 (спаренные t — тест).

    Анализ изображения фазового гистона под контролем IF Данные микроскопии FLIM-FRET, полученные в клетках DIvA, определяют количественную организацию сети хроматина и позволяют исследовать гетерогенность очагов DSB. Чтобы продемонстрировать потенциал микроскопии фазовых гистонов FLIM-FRET и IF в клетках DIvA, чтобы обеспечить как 1) количественное понимание пространственной организации компактного хроматина в масштабах всего ядра по отношению к DSB, так и 2) исследование гетерогенности в локальном ответе хроматина на DSB, здесь мы выполнили два типа анализа изображений, чтобы получить карты FLIM гистонов FRET.Первый тип анализа извлекает локализацию очагов компактного хроматина с высоким FRET по всему ядру на карте FLIM, рассматривает их как частицы и затем количественно определяет их пространственное распределение с точки зрения размера частиц. Из применения этого анализа к ядрам DIvA, которые не подвергались обработке по сравнению с обработанными 4OHT (рис. 3A, B), мы обнаружили, что извлеченная сеть очагов компактного хроматина с высоким FRET (рис. 3C) претерпевает пространственную реорганизацию в ответ на индукцию DSB, что приводит в увеличении площади очагов (рис. 3D,E).Этот результат, наряду с обнаружением того, что индукция DSB инициирует событие уплотнения хроматина по всему ядру на уровне близости нуклеосом (рис. 1, 2), предполагает, что в дополнение к этой глобальной, но наномасштабной реорганизации в структуре хроматина, которая происходит вне DSB сайты, ответ на повреждение ДНК DSB также инициирует субмикронные изменения в организации сети хроматина более высокого порядка (Рис. 3).

    РИСУНОК 3 . Анализ частиц гистонового FRET на картах FLIM клеток DIvA выявляет субмикронные изменения в организации сети компактного хроматина при индукции DSB. (A) Ядро DIvA, экспрессирующее пару гистоновых FRET (h3B-eGFP и h3B-mCh), которое было зафиксировано с помощью IF против γh3AX до (вверху) по сравнению с после (внизу) 2 ч обработки 4OHT (шкала бар 10 мкм). (B) FLIM-карты клеток, представленных на панели (A) , псевдоокрашенные для сообщения о FRET гистона (красные пиксели) по сравнению с отсутствием FRET (бирюзовые пиксели). (C) Локализация очагов компактного хроматина, извлеченная из карт FRET гистонов, представленных на панели (B) . (D) Увеличение интересующей области (белая рамка) на картах локализации, представленных на панели (C) . (E) Гистограмма размера очагов компактного хроматина, обнаруженных с помощью гистоновой FRET в DIvA, до (синий) и через 2 ч (желтый) после обработки 4OHT (N = 6 клеток, два биологических повтора).

    Чтобы далее исследовать гетерогенность в локальном ответе хроматина, о котором сообщает гистоновая FRET в сайтах DSB DIvA, мы выполнили IF против не только γh3AX, который, как ожидается, выделит общую популяцию присутствующих DSB, но также и различные белки репарации ДНК, которые выделяют DSB субпопуляция настроена на репарацию по одному из двух доминирующих путей репарации DSB.В частности, мы провели анализ по маске под контролем IF карт FRET гистонов, полученных в ядрах DIvA, коэкспрессирующих h3B-eGFP и h3B-mCherry, которые обрабатывали 4OHT в течение 2 ч (рис. 4A–C) и фиксировали с помощью IF против 1 ) опухолевой супрессор p53, связывающий белок 1 (53BP1-AF405), который выделяет DSB, помеченные для негомологичного соединения концов (NHEJ) (рис. 4D–F), и 2) белок, предрасположенный к раку молочной железы 1 типа (BRCA1-AF647), который выделяет DSB, помеченные для гомологичная рекомбинация (HR) (рис. 4G-I). В совокупности эти эксперименты позволили количественно оценить уплотнение хроматина внутри и снаружи очагов DSB, отмеченных для NHEJ (рис. 4J) и HR (рис. 4K), а также исследовать, происходит ли восстановление DSB NHEJ по сравнению с HR в различных средах хроматина (рис. 4L). .

    РИСУНОК 4 . Анализ гетерогенности FRET гистонов DSB в клеточной системе DIvA на основе IF. (A, B) Ядро DIvA, коэкспрессирующее пару гистонов FRET h3B-eGFP (A) и h3B-mCh (B) , обработанное 4OHT в течение 2 ч и зафиксированное IF против различной репарации ДНК белки. (C) FLIM-карта клетки, представленная на панелях (A, B) , псевдоокрашенных для сообщения гистона FRET (красные пиксели). (D) IF против белка репарации ДНК NHEJ 53BP1 (53BP1-AF405) в клетке, представленной на панелях (A–C) . (E,F) Псевдоокрашенная карта FRET гистонов с панели (C) с маской на основе сигнала 53BP1-AF405 (D) применена для выбора фокусов NHEJ DSB (E) и доли пикселей отчет о гистоновом FRET (красные пиксели) внутри и снаружи этой маски (F) . (G) IF против белка репарации ДНК HR BRCA1 (BRCA1-AF647) в клетках, представленных на панелях (A–C) . (H,I) Псевдоокрашенная FRET-карта гистонов с панели (C) с маской на основе сигнала BRCA1-AF647 (G) применена для выбора фокусов HR DSB (H) и доли пикселей сообщение гистона FRET (красные пиксели) внутри и снаружи этой маски (I) . (J) Количественная оценка фракции гистонового FRET (компактного хроматина) внутри и снаружи 53BP1 выявила DSB NHEJ после 2 часов обработки 4OHT в нескольких ядрах (N = 18 клеток, два биологических повтора). (K) Количественная оценка фракции гистонового FRET (компактного хроматина) внутри и снаружи BRCA1 выявила DSB HR после 2 часов обработки 4OHT в нескольких ядрах (N = 12 клеток, два биологических повтора). (L) Количественное сравнение доли гистонового FRET (компактного хроматина) внутри очагов, меченных γh3AX (все DSB), по сравнению с очагами 53BP1 (NHEJ DSB) и очагами BRCA1 (HR DSB), нормализованными к доле гистонового FRET в окружающей среде. нуклеоплазма (N ≥ 12 клеток, две-три биологические повторности).На графике с прямоугольниками и усами показаны минимум, максимум и выборочная медиана. В (J,K) , **** p < 0,0001 (парное t -тест). В (L) , * p < 0,05 и ns > 0,05 (непарный t — тест).

    Из этого анализа мы обнаружили, что сайты NHEJ и HR DSB статистически находятся в более «открытом» состоянии хроматина, чем окружающая их неповрежденная среда хроматина (рис. 4J, K), что согласуется с нашим анализом, управляемым γh3AX (рис. 2H). ).Кроме того, что интересно, если мы примем во внимание базовый статус уплотнения хроматина каждого проанализированного ядра DIvA (т. е. нормализованный по отношению к доле FRET в пикселях за пределами сайтов DSB), мы обнаружим, что, хотя очаги DSB 53BP1, отмеченные для NHEJ, существенно не отличаются от Очаги γh3AX DSB, очаги BRCA1 DSB, отмеченные для HR, статистически более «открыты», чем очаги γh3AX DSB (рис. 4L). Молекулярный механизм и физиологическая функция того, почему очаги HR DSB более «открыты», требуют дальнейшего изучения; однако это согласуется с предыдущими исследованиями, которые связывают BRCA1 с ролью в деконденсации хроматина (Bochar et al., 2000; Ye et al., 2001), и это предполагает, что гетерогенность с точки зрения структуры хроматина действительно существует как функция пути репарации DSB.

    Обсуждение

    В этом исследовании мы применили фазовую гистоновую микроскопию FLIM-FRET для измерения уплотнения хроматина по всему ядру на уровне близости нуклеосом и продемонстрировали, что этот анализ может количественно определять субмикронные изменения в пространственной организации этого наномасштаба. особенность при индукции DSB в клеточной системе DIvA.Сочетая эту технологию с иммунофлуоресценцией против модификаций гистонов, которые выделяют сайты DSB (например, γh3AX) и белки репарации ДНК, участвующие в разрешении DSB (например, 53BP1 и BRCA1), мы также подчеркиваем способность фазового гистона FLIM-FRET исследовать пространственную гетерогенность в локальная структура хроматина DSB как функция выбора пути репарации DSB — NHEJ по сравнению с HR. При этом мы обнаружили, что DIvA DSB индуцируют глобальное уплотнение хроматиновой сети, которое уменьшает среднее расстояние между нуклеосомами и реорганизует их в более крупные кластеры, параллельно с локальным открытием хроматина в сайтах DSB — особенно тех, которые помечены для репарации посредством HR.Интересно, что этот результат, который связан с индуцированием множественных сайт-специфических DSB в разных местах по всей нуклеоплазме DIvA, полностью согласуется с нашим предыдущим исследованием, в котором применялся фазовый гистон FLIM-FRET в клетках HeLa, подвергнутых микрооблучению NIR лазером, который индуцирует несколько DSB в одном месте ядра (Lou et al., 2019). Т.о., «открытие» хроматина в сайте DSB наряду с уплотнением хроматина окружающей ДНК, по-видимому, является универсальным механизмом для эффективной репарации DSB, независимо от того, индуцируются ли они генетически или источником радиации.

    Следующий вопрос: какую биологическую функцию выполняют обнаруженные изменения в структуре хроматина для разрешения ДР? В контексте репарации ДНК уже есть доказательства, полученные с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения, что наномасштабная реорганизация в структуре хроматина регулирует доступ и удержание белков репарации ДНК в сайтах DSB (Ochs et al., 2019; Whelan and Rothenberg, 2021). В соответствии с этой линией в нашем предыдущем исследовании, в котором использовалось лазерное микрооблучение NIR, мы обнаружили, что компактная граница хроматина локуса репарации DSB служит для модуляции подвижности и доступа опухолевого супрессора фактора репарации NHEJ 53BP1 к центральной «открытой» области. этого типа геномного поражения (Lou et al., 2019). Таким образом, учитывая продемонстрированный потенциал анализа гистоновой FRET для изучения структуры хроматина DSB, здесь как функции выбора пути репарации ДНК в сочетании с IF в DIvA, будущие эксперименты будут посвящены лучшему пониманию того, какова роль структуры хроматина DSB в контроль доступа 53BP1 по сравнению с BRCA1 и определение того, играет ли хроматин роль в решении перейти к разрешению DSB через NHEJ по сравнению с HR.

    Материалы и методы

    Культура клеток, транзиторная трансфекция и IF

    Клетки DIvA (первоначально предоставленные Gaëlle Legube, LBCMCP, CNRS, Тулуза, Франция) выращивали в модифицированной Дульбекко среде Игла (Lonza) с добавлением 10% бычьего роста сыворотка (Gibco), 1x Pen-Strep (Lonza) и 1 мкг/мл пуромицина (Thermo Fisher Scientific) при 37°C в 5% CO 2 .Затем клетки DIvA высевали за 24 часа до трансфекции на чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм и временно трансфицировали h3B-eGFP и h3B-mCherry с использованием липофектамина 3000 в соответствии с протоколом производителя. Временно трансфицированные клетки DIvA затем обрабатывали (или оставляли без обработки) 300 нМ 4OHT в течение 2 часов, а затем фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 минут, пермеабилизировали 1 мг/мл Triton X-100 в течение 15 минут при комнатной температуре и блокировали. с 1% бычьим сывороточным альбумином в течение 30 мин. Между каждым из этих этапов фиксации проводили три цикла промывания фосфатно-солевым буфером (PBS).Для IF против γh3AX (S139) (каталожный номер 9718S, Cell Signaling), 53BP1 (каталожный номер 4937S, Cell Signaling) и BRCA1 (каталожный номер SAB2702136-100UL, Sigma) фиксированные клетки DIvA инкубировали с первичным антителом (1: 200) в течение ночи при 4°C, а затем вторичное антитело, меченное Alexa Fluor 405 (AF405) или Alexa Fluor 647 (AF647), на 1 ч при комнатной температуре. Между каждым из этих этапов IF также выполняли три этапа промывания PBS. В целом, отмывка PBS не только имела решающее значение для фиксации и IF, но также противодействовала вызванному 4OHT сдвигу времени жизни флуоресценции h3B-eGFP, который не был связан с гистоновым FRET (дополнительные рисунки S1A-E).

    Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия и сбор данных FLIM

    Все измерения микроскопии фиксированных клеток проводились на лазерном сканирующем микроскопе Olympus FV3000, подключенном к импульсному лазеру с длиной волны 488 нм, работающему на частоте 80 МГц, и приставке ISS A320 FastFLIM. Во всех экспериментах использовали иммерсионный объектив × 60 с числовой апертурой 1,2, и клетки получали изображения при комнатной температуре. Перед получением данных FLIM в донорском канале (h3B-eGFP) для анализа FRET гистонов были получены многоканальные изображения интенсивности (двух-, трех- и четырехцветные) для каждого выбранного ядра DIvA, чтобы убедиться, что акцептор FRET (h3B-mCh) присутствовал в избытке h3B-eGFP (т.т. е., соотношение акцептор-донор > 1) и регистрировать локализацию разрывов DSB, помеченных либо h3AX (γh3AX-AF647), либо 53BP1 (53BP1-AF405) и BRCA1 (BRCA1-AF647). Это включало последовательную визуализацию двухфазного светового пути в программном обеспечении Olympus FluoView. Первый этап был настроен на отображение h3B-eGFP и h3B-mCh с помощью твердотельных лазерных диодов, работающих на длинах волн 488 и 561 нм соответственно, при этом результирующий сигнал направлялся через дихроичное зеркало 405/488/561/6033 на два внутренних фотоумножителя GaAsP настроены на сбор 500–540 нм и 600–700 нм.Вторая фаза была настроена на изображение 53BP1-AF405 и BRCA1-AF647 или просто γh3AX-AF647 с использованием твердотельных лазерных диодов, работающих на 405 и 633 нм соответственно, при этом результирующий сигнал направлялся через 405/488/561 /633 к двум внутренним фотоумножителям GaAsP, настроенным на сбор 420–460 нм и 600–700 нм. Затем в каждом выбранном ядре DIvA была отображена карта FLIM h3B-eGFP в том же поле зрения (размер кадра 256 × 256 пикселей, 20 мкс/пиксель, 90 нм/пиксель, интеграция 20 кадров) с использованием программного обеспечения ISS VistaVision. .Это включало возбуждение h3B-eGFP внешним импульсным лазером с длиной волны 488 нм (80 МГц), а результирующий сигнал направлялся через дихроичное зеркало 405/488/561/633 на внешний детектор фотоумножителя (H7422P-40 Hamamatsu), который был установлен с полосовым фильтром 520/50 нм. Затем сигнал донора в каждом пикселе впоследствии обрабатывался картой сбора данных ISS A320 FastFLIM box для определения времени жизни флуоресценции h3B-eGFP. Все данные FLIM были предварительно откалиброваны по флуоресцеину при pH 9, который имеет однократное экспоненциальное время жизни, равное 4.04 нс.

    Анализ FLIM-FRET

    Затухание флуоресценции, зарегистрированное в каждом пикселе полученного FLIM-изображения, было количественно определено с помощью векторного подхода к анализу времени жизни (Digman et al., 2008; Hinde et al., 2012). Как описано в ранее опубликованных статьях (Hinde et al., 2012; Liang et al., 2020), это приводит к тому, что каждый пиксель изображения FLIM дает одну точку (фазор) на векторном графике, который при использовании в реципрокный режим позволяет сопоставить каждую точку векторного графика с каждым пикселем изображения FLIM.Поскольку вектора следуют простой векторной алгебре, можно определить дробный вклад двух или более независимых молекулярных видов, сосуществующих в одном и том же пикселе. Например, в случае двух независимых видов все возможные веса дают векторное распределение вдоль линейной траектории, соединяющей вектора отдельных видов в чистом виде. В то время как в случае FRET-эксперимента, когда время жизни молекулы-донора изменяется при взаимодействии с молекулой-акцептором, реализация всех возможных векторов, тушащихся с разной эффективностью, описывает кривую траекторию FRET на векторной диаграмме, которая следует классическому определению FRET-эффективность.

    В контексте представленных экспериментов FRET с гистонами координаты фазора (g и s) негашеного донора (h3B-eGFP) и фона (клеточная автофлуоресценция) были впервые определены независимо в фиксированных клетках DIvA, трансфицированных по сравнению с нетрансфицированными h3B. -eGFP. Это позволило определить базовый уровень, от которого траектория FRET может быть экстраполирована, а затем использована для определения динамического диапазона эффективности FRET, которые описывают организацию сети хроматина в клеточной системе DIvA (Lou et al., 2019; Лян и др., 2020). Из наложения этой траектории FRET на комбинированное векторное распределение, измеренное для h3B-eGFP в фиксированных клетках DIvA, совместно трансфицированных с h3B-mCh, мы обнаружили, что сеть хроматина DIvA демонстрирует состояния уплотнения, которые варьируются от 0 до 16% в эффективности FRET. Это соответствует сдвигу времени жизни донора h3B-eGFP примерно с 2,5 нс (g = 0,39 ± 0,05, s = 0,49 ± 0,05) до 2,1 нс (g = 0,47 ± 0,05, s = 0,50 ± 0,05). Поэтому мы определили два курсора с центром в этих векторных координатах для пространственной карты, где хроматин открыт (бирюзовый курсор) по сравнению с компактным (красный курсор) во время сбора данных FLIM в фиксированном ядре DIvA.Кроме того, для количественной оценки степени компактизации хроматина DIvA до и после индукции DSB в нескольких ядрах мы рассчитали долю пикселей, считающихся компактными (т. Е. Состояние FRET в красном курсоре). Вся количественная оценка FLIM-FRET была выполнена в программном обеспечении SimFCS, разработанном в LFD.

    Сегментация фокусов DSB и анализ очагов FLIM-FRET

    Для количественной оценки локальной структуры хроматина очагов DSB по сравнению с неповрежденной архитектурой хроматина в ядрах DIvA мы применили пороговую маску интенсивности, основанную на изображении интенсивности IF белка DSB для FLIM. карты псевдоокрашены в соответствии с гистоном FRET (компактный хроматин) по сравнению с отсутствием FRET (открытый хроматин).Это включало 1) сглаживание IF-изображения каждого ядра DIvA локализации DSB (т. е. γh3AX-AF647, 53BP1-AF405 или BRCA1-AF647) с помощью пространственного медианного фильтра 3 × 3, 2) преобразование этого сглаженного изображения в бинарную маску на основе на пороге интенсивности, который был достаточно жестким, чтобы отклонить неспецифическое окрашивание IF, но сохранить фокусы DSB, 3) применить маску, управляемую IF, к связанной с ней карте FLIM, псевдоокрашенной в соответствии с гистоновым FRET, и 4) количественное определение доли компактных хроматин внутри (т.т. е., фокусы DSB) по сравнению с внешней (т. е. нуклеоплазменной) маской, контролируемой IF.

    Анализ размеров очагов компактного хроматина

    Для количественного определения размера очагов компактного хроматина, обнаруженных на карте FLIM, псевдоокрашенных в соответствии с гистоном FRET (компактный хроматин) по сравнению с отсутствием FRET (открытый хроматин), было экспортировано бинарное изображение очагов компактного хроматина. из программного обеспечения SimFCS в ImageJ, а затем была применена процедура анализа частиц, которая идентифицировала частицы на основе следующих критериев: 1) размер частиц был от 0 до бесконечности, 2) все соседние ненулевые пиксели считались одной частицей, и 3) отверстия внутри соединенных пикселей считались частью идентифицированной частицы.Площадь идентифицированных частиц рассчитывали как количество пикселей, умноженное на площадь одного пикселя.

    Подготовка статистики и рисунков

    Статистический анализ был выполнен с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Рисунки были подготовлены с использованием Adobe Illustrator, Microsoft PowerPoint, SimFCS и ImageJ.

    Заявление о доступности данных

    Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без неоправданных оговорок.

    Авторские взносы

    JL и EH задумали исследование, разработали эксперименты и написали рукопись. JL и ZL провели эксперимент. JL и AS проанализировали данные.

    Финансирование

    JL был поддержан проектным грантом Австралийского исследовательского совета (NHMRC) (DP180101387), а EH был поддержан Австралийским стипендией развития карьеры NHMRC (APP1124762), стипендией Австралийского исследовательского совета будущего (FT200100401) и Фондом Джейкоба. Лекция Хаймсона и Беверли Мекленбург.

    Конфликт интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Примечания издателя

    Все претензии, изложенные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют претензии их дочерних организаций или издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или претензии, которые могут быть сделаны его производителем, не гарантируются и не поддерживаются издателем.

    Благодарности

    Мы благодарим д-ра Gaëlle Legube и Thomas Clouaire за предоставление DSB, индуцируемого с помощью клеточной системы AsiSI (DIvA). Мы благодарим Платформу биологической оптической микроскопии Мельбурнского университета за предоставление доступа к конфокальному лазерному сканирующему микроскопу Olympus FV3000.

    Дополнительный материал

    Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2021.770081/full#supplementary-material

    Ссылки

    Aymard, F., Bugler, B., Schmidt, C.K., Guillou, E., Caron, P., Briois, S., et al. (2014). Транскрипционно активный хроматин рекрутирует гомологичную рекомбинацию при двухцепочечных разрывах ДНК. Нац. Структура Мол. биол. 21, 366–374. doi:10.1038/nsmb.2796

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Бошар Д. А., Ван Л., Бения Х., Кинев А., Сюэ Ю., Лейн В. С. и др. (2000). BRCA1 связан с человеческим комплексом, связанным с SWI/SNF. Сотовый 102, 257–265.doi:10.1016/s0092-8674(00)00030-1

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Дигман, М. А., Кайолфа, В. Р., Замаи, М., и Граттон, Э. (2008). Фазорный подход к анализу флуоресцентных изображений в течение жизни. Биофизический журнал 94, L14–L16. doi:10.1529/biophysj.107.120154

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Хайнд Э., Дигман М. А., Уэлч К., Хан К. М. и Граттон Э. (2012). Биосенсор Förster Resonance Energy Transfer Detection с помощью фазового подхода к флуоресцентной микроскопии с изображением в течение всей жизни. Микроск. Рез. Тех. 75, 271–281. doi:10.1002/jemt.21054

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Хинде Э., Конг Х., Йокомори К. и Граттон Э. (2014). Динамика хроматина при репарации ДНК, выявленная с помощью парного корреляционного анализа молекулярного потока в ядре. Биофизический журнал 107, 55–65. doi:10.1016/j.bpj.2014.05.027

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Яковони Дж. С., Карон П., Лассади И., Николя Э., Массип Л., Труш Д. и соавт. (2010). Профилирование γh3AX с высоким разрешением вокруг двухцепочечных разрывов ДНК в геноме млекопитающих. EMBO J. 29, 1446–1457. doi:10.1038/emboj.2010.38

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Калуси А., Хоффбек А.-С., Селеменакис П. Н., Пиндер Дж., Сэвидж К. И., Ханна К. К. и др. (2015). Ядерный онкоген SET контролирует репарацию ДНК за счет удерживания KAP1 и HP1 в хроматине. Cel Rep. 11, 149–163.doi:10.1016/j.celrep.2015.03.005

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Клемент К., Люйстербург М.С., Пиндер Дж.Б., Сина К.С., Дель Неро В., Винтерсингер К.М. и др. (2014). Противоположные действия по ремоделированию хроматина классов ISWI и CHD организуют репарацию гетерохроматической ДНК. J. Cel Biol 207, 717–733. doi:10.1083/jcb.201405077

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Леметр К., Грабарц А., Цурула К., Андронов Л., Фурст А., Панкотай Т. и соавт. (2014). Положение ядра диктует выбор пути восстановления ДНК. Гены Дев. 28, 2450–2463. doi:10.1101/gad.248369.114

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Лян З., Лу Дж., Сципиони Л., Граттон Э. и Хинде Э. (2020). Количественная оценка уплотнения широкого хроматина ядра с помощью векторного анализа резонансной передачи энергии гистонов Фёрстера (FRET) в данных микроскопии флуоресцентной визуализации в частотной области (FLIM). Краткие данные 30, 105401. doi:10.1016/j.dib.2020.105401

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Ллер Д., Джеймс Дж., Свифт С., Норман Д. Г. и Ламонд А. И. (2009). Количественный анализ уплотнения хроматина в живых клетках с использованием FLIM-FRET. J. Cel Biol 187, 481–496. doi:10.1083/jcb.200

    9

    Полный текст CrossRef | Google Scholar

    Лу Дж., Сципиони Л., Райт Б. К., Бартолек Т. К., Чжан Дж., Масамсетти В.П. и др. (2019). Микроскопия Phasor Histone FLIM-FRET количественно определяет пространственно-временную перестройку архитектуры хроматина во время реакции на повреждение ДНК. Проц. Натл. акад. науч. США 116, 7323–7332. doi:10.1073/pnas.1814965116

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Люгер К., Дечасса М. Л. и Треметик Д. Дж. (2012). Новый взгляд на структуру нуклеосом и хроматина: упорядоченное состояние или беспорядочное дело? Нац. Преподобный Мол. Цель биол. 13, 436–447. doi:10.1038/nrm3382

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Люйстербург, М. С., де Крийгер, И., Вигант, В. В., Шах, Р. Г., Сминк, Г., де Гроот, А. Дж. Л., и др. (2016). PARP1 связывает CHD2-опосредованную экспансию хроматина и отложение h4.3 с репарацией ДНК путем негомологичного соединения концов. Мол. Цел. 61, 547–562. doi:10.1016/j.molcel.2016.01.019

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Массип Л., Карон П., Яковони Дж.С., Труш Д. и Легубе Г. (2010). Расшифровка хроматинового ландшафта, вызванного разрывами двойных цепей ДНК. Клеточный цикл 9, 3035–3044. doi:10.4161/cc.9.15.12412

    Полный текст CrossRef | Google Scholar

    Окс Ф., Каремор Г., Мирон Э., Браун Дж., Седлачкова Х., Раск М.-Б. и др. (2019). Стабилизация топологии хроматина защищает целостность генома. Природа 574, 571–574. doi:10.1038/s41586-019-1659-4

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Оу, Х.Д., Фан С., Диринк Т.Дж., Тор А., Эллисман М.Х. и О’Ши С.С. (2017). ChromEMT: визуализация трехмерной структуры и уплотнения хроматина в интерфазных и митотических клетках. Наука 357, eaag0025. doi:10.1126/science.aag0025

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Smith, R., Lebeaupin, T., Juhász, S., Chapuis, C., D’Augustin, O., Dutertre, S., et al. (2019). Развертывание поли(АДФ-рибозы)-зависимого хроматина способствует ассоциации ДНК-связывающих белков с ДНК в местах повреждения. Рез. нуклеиновых кислот. 47, 11250–11267. doi:10.1093/nar/gkz820

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Сориа Г., Поло С. Э. и Альмоузни Г. (2012). Prime, Repair, Restore: активная роль хроматина в реакции на повреждение ДНК. Мол. Сел 46, 722–734. doi:10.1016/j.molcel.2012.06.002

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Thorslund, T., Ripplinger, A., Hoffmann, S., Wild, T., Uckelmann, M., Виллумсен, Б., и соавт. (2015). Пары гистонов h2 инициация и усиление передачи сигналов убиквитина после повреждения ДНК. Природа 527, 389–393. doi:10.1038/nature15401

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Уилан Д. Р. и Ротенберг Э. (2021). Картирование клеточных комплексов резекции двухцепочечных разрывов во время гомологичной рекомбинации со сверхвысоким разрешением. Проц. Натл. акад. науч. США 118, e2021963118. doi:10.1073/pnas.2021963118

    PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

    Ye, Q., Hu, Y.-F., Zhong, H., Nye, A.C., Belmont, A.S., and Li, R. (2001). BRCA1-индуцированное крупномасштабное развертывание хроматина и аллель-специфические эффекты предрасполагающих к раку мутаций. J. Cel Biol. 155, 911–922. doi:10.1083/jcb.200108049

    Полный текст CrossRef | Google Scholar

    Активность ГТФаз Rho-семейства во время клеточного деления, визуализированная с помощью зондов на основе FRET | Журнал клеточной биологии

    кДНК RBD эффекторных белков, включая mDia1 человека (аминокислоты 1–176), мышиный рхотекин (аминокислоты 1–88), мышиный рофилин (аминокислоты 37–107), PKN человека (аминокислоты 13–98) и кДНК Rac1/Cdc42-связывающий домен PAK (аминокислоты 68–150) амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами, несущими сайты распознавания ферментов рестрикции на их 5′-конце, и субклонировали в pCR ® -Blunt II-TOPO ® (Invitrogen).Плазмиды для мониторов RhoA конструировали, используя, по существу, ту же процедуру, что и для конструирования pRaichu-Ras (Mochizuki et al., 2001). С амино-конца Raichu-RhoA-1202, -1208, -1125, -1126, -1206 и -1212 состояли из YFP (а.о. 1-228), спейсера (Leu-Asp), дикого типа или мутантов RhoA человека (1–189 а.о.), спейсер (Thr-Gly-Gly-Gly-Gly-Thr), RBD эффекторных белков, спейсер (Gly-Gly-Arg) и CFP (1–237 а.о.). Raichu-1110X, -1111X, -1214X, -1220X, -1104X, -1105X, -1218X и -1224X состоял из YFP (аминокислоты 1–228), спейсера (Leu-Asp), RBD эффекторных белков, спейсер (Thr-Gly-Gly-Gly-Gly-Thr), RhoA человека (1–189 а.о.), спейсер (Gly-Gly-Arg), CFP (1–237 а.о.), спейсер (Ser-Arg), и карбоксиконцевой участок Ki-Ras4B (169–188 а.о.).Raichu-RhoA-1237X, -1238X и -1239X состояли из YFP (а.о. 1-228), спейсера (Leu-Asp), RBD PKN, спейсера (Thr-Gly-Gly-Gly-Thr-Gly- Gly-Gly-Gly-Thr), RhoA дикого типа или мутанты RhoA человека (1–189 а.о.), спейсер (Gly-Gly-Arg), CFP (1–237 а.о.), спейсер (Gly-Arg-Ser -Arg) и CAAX-бокс Ki-Ras4B (а.о. 169–188; рис. 1А). В Raichu-RhoA/RhoA-CT карбокси-концевая область RhoA (173–193 а.о.) была заменена областью Ki-Ras4B в Raichu-RhoA-1237X.

    Эффекторные белки, используемые в каждом зонде, перечислены в Таблице I.В Raichu-RhoA-1239X Asn был заменен на Thr 19 RhoA. В других пробах RhoA был либо диким типом, либо мутантным Gln 63 Leu (Q63L), как указано в таблице I. В этой статье, если не указано иное, мы использовали модифицированный YFP [Thr 66 Gly, Val 69 LEU, SER 73 ALA, MET 154 EAL 164 ALA, SER 176 GLY 176 GLY 174 THR 204 TYR] и CFP [LYS 27 ARG, TYR 67 TRP, Asp 130 Gly, Asn 147 Iso, Met 154 Thr, Val 164 Ala, Asn 165 His, Ser 176 Gly] в качестве акцептора и донора соответственно.Нуклеотидная последовательность кодирующих областей pRaichu-RhoA-1237X, которая использовалась в этом отчете как Raichu-RhoA/K-Ras-CT, была депонирована в банке данных GenBank/EMBL/DDBJ (под номером доступа AB074297).

    Raichu–1502/Raichu–RBD состоял из YFP (аминокислоты 1–228), спейсера (Leu-Glu), RBD Rhotekin (аминокислоты 1–88), спейсера (Gly-Gly-Arg) и CFP ( аа 1–237). В Raichu–1502/Raichu–RBD – мономерная Венера [Phe 47 Leu, Thr 66 Gly, Val 69 Leu, Ser 73 Ala, Met 154 Ala Thr, Val 94492 176 Гли; и Thr 204 Tyr, Leu 222 Lys, Phe 224 Arg] (Nagai et al., 2002; Zacharias et al., 2002) использовали в качестве YFP. В Raichu-Raichu-RBD-X карбоксиконцевая область RhoA была слита с Raichu-RBD.

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.