Фото лада 2191: Комби — Авторевю

Содержание

Комби — Авторевю

— Оригинальность данного проекта заключается в его силуэте. Нам удалось убедить руководство в том, что для «девяносто первой» машины нужны другие задние двери… Начальнику управления дизайна Андрею Захарову казенные выражения простительны — он ведь работает на ВАЗе с 1977 года. В те годы главным стилистом был ныне покойный Марк Демидовцев, и дизайн вазовских машин вполне отвечал прозвищу Демидовцева, которого за глаза звали Мрак Васильевич. А теперь… ВАЗ-2191, пятидверная Гранта с кузовом лифтбек — почти иномарка!

Ведь были на ВАЗе и раньше удачные машины, скажете вы, — Нива, например. Соглашусь. Да и «восьмерки» с «девятками» были неплохи для тех лет, но вот остальное… «Беременные антилопы» из семейства «десяток», пародийная новая Нива, бесформенный минивэн Надежда, изуродованные Самары-2. Да и после Демидовцева, когда вазовским дизайном рулил Евгений Лобанов, не лучше было — куцые Калины да одутловатые Приоры.

Гранта-седан с ее нелепым ящиком багажника тоже не шедевр, хотя рисовали ее уже под присмотром первого «варяга», пришельца из Renault Энтони Грейда.

И вот теперь передо мной — Гранта-лифтбек.

Дизайн экстерьера начинал разрабатывать Иван Лепешкин, автор Гранты-седана…

…а заканчивал Михаил Зубков, известный по экспериментальному универсалу ВАЗ-2151 и по работе над передком Ларгуса

За долгие годы это первая вазовская машина, на которую не страшно смот­реть. Даже версия Норма на 14-дюймовых стальных колесах и в наименее выигрышном темном цвете не пугает, уже не говоря о серебристом Люксе на 15-дюймовом «литье». С учетом огромного, 18-сантиметрового клиренса, который должен уменьшаться до паспортных 165 мм только под полной нагрузкой, — сущий «купе-кроссовер»! Этакий BMW X-серии по-тольяттински.

В интерьере появились посеребренные ободки дефлекторов. На фото версия Люкс — с бледным сенсорным экраном мультимедийной установки и с неполноценным климат-контролем, который умеет только поддерживать заданную поворотом рукоятки температуру

— Нам пришлось на десять миллимет­ров опустить крышу и на столько же поднять оконную линию. Да, над головами­ задних седоков места стало меньше на восемь миллиметров. Но мы убедили руководство в том, что ценность данного стиля для покупателей будет реальной…

На дисплей комбинации приборов Нормы и Люкса наконец-то можно вывести температуру охлаждающей жидкости

У рычага «механики» не только тросовый привод, но и новый набалдашник

Руководство в данном случае — это бывший уже президент АвтоВАЗа Игорь Комаров: именно под его началом создавались обе Гранты, седан и лифтбек. Даже новый шеф-дизайнер АвтоВАЗа Стив Маттин к этой машине имеет весьма опосредованное отношение — когда он пришел на завод в 2011 году, дизайн был уже почти готов.

Но почему пятидверка так отличается от седана? В лучшую сторону.

— Продакт-плэннинг просил нас сделать лифтбек более мужским, более спортивным. Между собой мы называли эту машину четырехдверным купе…

Светодиодная противотуманка в заднем бампере должна стать фирменной деталью всех Лад

Под уплотнителем на крыше спрятаны вваренные гайки для крепления багажника, но отверстие… заклеено простой изолентой

Английские слова в устах тольяттинских спецов старой закалки звучат странно, но симптоматично. Не «отдел товарной и ценовой политики», а product planning. Конечно, это влияние партнеров по альянсу Renault-Nissan-АвтоВАЗ — и влияние явно благотворное. Разве раньше прислушивались к дизайнерам, как теперь? А Гранта-лифтбек — пожалуй, первый автомобиль, при работе над которым соображения стиля были главнее экономии.

Полная версия доступна только подписчикамПодпишитесь прямо сейчас

я уже подписан

Характеристики, фото, комплектации Lada Granta Liftback (2191) :: Avto.Tatar

14 октябрь 2015 Лада.Онлайн 53 496 1

Комплектация «норма» является промежуточной, оснащение автомобиля лучше, чем в базовой версии, но не дотягивает до «люкса». Ее можно назвать золотой серединой и поэтому многие покупатели выбирают именно такой вариант исполнения. Рассмотрим, что входит в комплектацию Лада Гранта норма, фото интерьера и экстерьера, а также стоимость данного автомобиля.

Сколько бензина можно залить в бензобак Лада Гранта: объём в литрах

Бензобак (топливный бак) — ёмкость в автомобиле где хранится топливо. Обычно бензобак установлен сзади внизу кузова. Такое расположение хорошо влияет на «развесовку» автомобиля. На Лада Гранта бензобак изготовлен из пластика.

Объём топливного бака Лада Гранта

Сколько эта красотка сможет заправить в нашу Гранту?

Объем топливного бака в независимости от комплектации на автомобиле Лада Гранта равен 50 литрам.

Добавьте к этому не более 2 литров, которые будут находиться в топливо-проводе и топливном фильтре, и получите максимальный объём, который возможно заправить в этот автомобиль. Заправляться необходимо только 95-м бензином, именно так рекомендует завод-изготовитель.

Помните, что «заправляться до полного» надо только перед поездкой. Иначе при длительной стоянке под воздействием внешних факторов пары бензина испарятся через специальные отверстия в бензобаке. Особенно это будет заметно в знойную погоду.

При «заправке бака до полного» первый отстрел колонки произойдёт уже на 45 литре. При этом на панели приборов уровень топлива будет указываться «без одного деления до полного». Именно из-за этого возникают споры о том, что бензобак на самом деле меньше заявленного АвтоВазом объёма в технической документации. По моему опыту после первого отстрела в режиме «медленной заливки» возможно залить ещё около 6 литров.

Путём несложных математических операций сложения объём всего бензина в системе получается не менее 51 литра, что соответствует заявленной производителем автомобиля информацией.

П.С. Я заправляюсь только 92-ым бензином.

Внешний вид топливного бака

Топливный бак с автомобиля Лада Гранта б.у.

Чистенький бензобак

Сливного отверстия на бензобаке Лада Гранта не предусмотрено конструкцией, поэтому сливать бензин можно только путём воздействия на топливную рампу или через топливный фильтр.

Когда загорается контрольная лампочка низкого уровня топлива?

Контрольная лампа низкого уровня бензина, когда объём топлива в бензобаке не более 7 литров.

Заправочные объёмы автомобиля Лада Гранта

Для более подробной подачи информации мы создали таблицу со всеми заправочными объёмами автомобиля Лада Гранта. Она представлена ниже.

НаименованиеЗначение

Система смазки двигателя3,5
Система охлаждения двигателя и отопления салона*7,84
Коробка передач3,1
Система гидропривода тормозов0,45
Бачок омывателя ветрового стекла5,0
Топливный бак (ёмкость)50

carfrance.ru

Последовательность действий при демонтаже приборной панели

Причины для разбора, замены приборной панели Гранты лифтбек самые различные: повреждение, установка нового диода, прочие.

  • По периметру выкручиваем три крепежных болта. Аккуратно извлекаем блок в сборе, чтобы не повредить контактные платы, электрическую проводку, клеммы;
  • Снимаем крепление панели приборов Лада Гранта лифтбек;
  • Для замены стрелок тахометра / спидометра нужно подать немного вверх рычаг, провернуть его против часовой стрелки.

После окончательной замены, профилактики собираем конструкцию вновь. Самостоятельный ремонт передней панели Гранта лифтбек окончен.



Объем бака Лады Гранта: технические характеристики

Лада Гранта – достаточно популярный автомобиль у российского потребителя. Его цена приемлема, а эксплуатация обходится намного дешевле иномарки. Однако не все владельцы точно могут указать основные параметры данной машины.

В этой статье мы расскажем, каков объем бака для горючего в Ладе Гранта.

Немного о Гранте

Как известно, производитель создавал Ладу Гранта на основе более ранней модели – Калины. Автомобиль сейчас поставляется на рынок в четырех модификациях:

  • лифтбек;
  • седан;
  • хэтчбек;
  • спорт.

Имеются также три типа комплектации. Как люксовый вариант, так и «Стандарт», и «Норма» снабжены двигателями в 1,6 литра, различной мощности. На первых порах автомобиль поставлялся с силовыми установками на 8 клапанов, но затем появились и на 16.

Во всех модификациях используется 5-позиционная КПП. Это может быть автомат или механика. Приводными являются передние колеса.

Производитель рекомендует использовать для заправки только АИ-95, но многие уверяют, что автомобиль прекрасно себя чувствует, работая и на 92-м.

Согласно нормативу, на сто километров расход топлива составляет:

  • в городских условиях – 8,7-9,3;
  • на автотрассах – 5,8-6,2;
  • смешанный цикл – 7,2-7,3 литра.

Гранта в состоянии развить максимальную скорость более 168 километров за час. На разгон до сотни ей нужно максимум 12 секунд.

Бак для бензина устанавливается на Гранте позади, под кузовом, с правой стороны. Такое расположение позволяет отлично сбалансировать автомобиль, что, в свою очередь, способствует более легкому управлению. Резервуар для топлива изготавливается из пластика.

В числе прочего, конструкторы также в процессе разработки рассматриваемого автомобиля внесли определенные изменения и в устройство подвесок. В частности, в передней был установлен более широкий кастер, это позитивным образом сказалось на устойчивости курсовой транспортного средства.

При этом обновлена была еще и рейка рулевая, она теперь несколько короче той, что ставилась на Калине, благодаря этому требуется всего три оборота рулевого колеса при полном развороте. Это серьезно облегчило управление машиной

Также у передней подвески имеется новый модуль стойки, чья конструкция претерпела ряд изменений и получила в результате совершенно новые характеристики.

Стабилизаторы, придающие устойчивость поперечную, использованы более сильные, равно как и кузовные опоры.

Не обошли при модернизации и заднюю подвеску вниманием. Так Гранта стала первой в истории Волжского автозавода машиной, имеющей отрицательные значения развала колес. И эта мера разрешает намного улучшить управляемость транспортного средства.

Какой объем бензобака

Вне зависимости от модификации Гранты объем ее бака топливного одинаков и составляет ровно 50 литров.

К этому количеству бензина следует еще добавить примерно 2 литра уже поступивших в систему подачи горючего и в топливный фильтр. В итоге максимально заправить Гранту получится на 52 литра.

Как ранее уже отмечалось, производитель машины указывает – использовать следует исключительно 95-й бензин. В свою очередь, отзывы свидетельствуют, что на этой марке машина ездит гораздо экономичнее, чем на дешевом 92. Хотя критики отмечают, что и с последним видом топлива не имеют никаких проблем – исследования доказали: в сумме, траты у них(пускай и незначительно), но выше.

ВНЕШНИЕ ОТЛИЧИЯ

  • Форсунки омывателя перенесены с капота на облицовку ветрового окна (жабо).
  • Появилась наружная электрокнопка отпирания багажника.
  • Новые 15-дюймовые диски колес оригинального дизайна с чередующимися двухразмерными спицами и полированной поверхностью.
  • Новые фары.
  • Новый передний и задний бампера.
  • У седана номерной знак перенесли с заднего бампера на крышку багажника.
  • У лифтбека задний бампер оригинально разделен на две части черной пластиковой вставкой.
  • Новая решетка радиатора.
  • Часть капота (которая ближе к ветровому стеклу) чуть приподнята, чтобы исключить попадание грязи на стекло.
  • Новые крылья.


Лада Гранта объем топливного бака

В качестве топливного бака в любом автомобиле, в том числе и в Лада Гранта присутствует специальная емкость, позволяющая обеспечивать сохранность топлива. У большинства современных машин заправочный резервуар располагается в задней части под днищем. Такой вариант избран производителями не случайно, поскольку это позволяет достичь требуемой развесовки масс. В модели Лада Гранта бак выполнен из пластика.

Как на Гранте активировать иммобилайзер

Как установить багажник на крышу Лада Гранта

Гранта что входит в комплектацию норма Лада Гранта

Каков объем бака в Гранте?

Объем топливного бака для рассматриваемой здесь модели вне зависимости от уровня оснащения составляет 50 литров. К обозначенной величине можно добавить пару литров, содержащихся в топливной магистрали и фильтре системы питания, и получится максимальный объем топлива. Производитель рекомендует использовать «95-й» бензин.

Следует помнить, что склоняться к заправке полного заправочного резервуара рекомендуется перед непосредственной поездкой. Если после заправки подразумевается длительный простой автомобиля, то в таком случае будет происходить испарение топлива под влиянием наружных факторов через систему вентиляции в заправочном резервуаре. Особенно актуальным данный момент является при жаркой погоде.

Когда происходит подача топлива из колонки в бак, и владелец Лада Гранта намерен заправить под «завязку», то факт первого «отстрела» заправочного пистолета происходит на 45-м литре. На соответствующем индикаторе панели приборов будет отображаться символ уровня топлива без последнего светящегося деления. Данный факт вызывает массу горячих споров, сутью которых является мнение, что фактически объем бензобака присутствующего в Лада Гранта, в сравнении с заявленным производителем значением. Учитывая опыт владельцев, можно утверждать, что в режиме «медленной дозаправки» возможно, долить еще примерно шесть литров.

Воспользовавшись азами математики, получаем значение: полный объем бензобака равен 51 литру, а это соответствует заявлениям производителя.

Конструктивная особенность бака?

В баке LADA Granta конструкторы не предусмотрели наличие отверстия для слива топлива. Если возникла такая потребность, то данную процедуру осуществляют через фильтр системы или топливную рампу. При этом объем топливного бака не меняется.

Когда происходит загорание контрольного символа, свидетельствующего о низком уровне топлива?

Лампа уровня активируется по достижении остаточного объема, присутствующего в баке топлива, показателя в 7 литров.

Заправочные объёмы

С целью более информативного восприятия приведенных данных нами создана таблица, отражающая величины заправочных объемов для модели LADA Granta. Она расположена по тексту ниже.

vaz-lada-granta.com



История создания

В 2008 году у АВТОВАЗа родилась идея о постройке нового бюджетного автомобиля с кузовом типа седан на платформе Лада «Калина». И вот уже в марте 2009 года появился первый эскиз автомобиля, а в мае было принято решение об открытии проекта с внутризаводским индексом ВАЗ-2190.

Название для автомобиля выбирали, как говорится всем миром, специально для этого ОАО «АвтоВАЗ» устроил всероссийский конкурс среди автолюбителей «Народному автомобилю — народное название». Победителем конкурса стал житель Красноярска Павел Захаров, именно он предложил назвать автомобиль «Гранта», всего же на конкурс было представлено несколько десятков тысяч названий. В качестве награды Захарову в рамках Московского автосалона 2010 года торжественно вручили автомобиль Lada Kalina.

Разработка автомобиля Лада «Гранта» велась при участии партнера ОАО «АвтоВАЗ» в лице . За основу была взята платформа автомобилей Лада «Калина», так как она на то момент была самой последней и современной и больше всего подходили для бюджетного автомобиля, поскольку «Калина» сама таковой являлась. На создание «Гранты» конструкторам понадобилось два с половиной года, а после последовали дорожные испытания, по результатам которых стало ясно, что автомобиль надежен, безопасен и приспособлен для российских дорог.

После того как работы по созданию в 2011 году появился вместительный автомобиль с длинной колесной базой и приличным дорожным просветом который в этом же году полностью вытеснил седан Лада «Калина». Изначально седан с заводским индексом ВАЗ-2190 был единственным представителем семейства Лада «Гранта» и только в марте 2013 года был официально представлен новый автомобиль с 5-дверным кузовом типа лифтбек, которому был присвоен индекс ВАЗ-2191. В серийное производство лифтбек поступил в мае 2014 года, а его выпуск был налажен на подконтрольном АВТОВАЗу предприятии «ИжАвто».

В начале 2020 года в результате модернизации автомобили семейства Lada Granta получили штатную навигационную систему ГЛОНАСС-GPS с установленной программой «Сити-гид».


LADA Granta лифтбек – Технические характеристики – Официальный сайт LADA

  • Кузов
  • Колесная формула / ведущие…
  • Расположение двигателя
  • Тип кузова / количество…
  • Количество мест
  • Длина / ширина / высота, мм
  • База, мм
  • Колея передних / задних колес,…
  • Дорожный просвет, мм
  • Объем багажного отделения в пассажирском / грузовом…
  • Двигатель
  • Код двигателя
  • Тип двигателя
  • Система питания
  • Количество, расположение…
  • Рабочий объем, куб. см
  • Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об….
  • Максимальный крутящий момент, Нм / об….
  • Рекомендуемое топливо
  • Динамические характеристики
  • Максимальная скорость, км/ч
  • Время разгона 0-100 км/ч, с
  • Расход топлива
  • Городской цикл, л/100 км
  • Загородный цикл, л/100 км
  • Смешанный цикл, л/100 км
  • Масса
  • Снаряженная масса, кг
  • Технически допустимая максимальная масса,…
  • Максимальная масса прицепа без тормозной системы /…
  • Объем топливного бака, л
  • Трансмиссия
  • Тип трансмиссии
  • Передаточное число главной…
  • Подвеска
  • Передняя
  • Задняя
  • Рулевое управление
  • Рулевой механизм
  • Шины
  • Размерность
  • www.lada.ru

дилер LADA в г. Боровичи

  • Кузов
  • Колесная формула / ведущие…
  • Расположение двигателя
  • Тип кузова / количество…
  • Количество мест
  • Длина / ширина / высота, мм
  • База, мм
  • Колея передних / задних колес,…
  • Дорожный просвет, мм
  • Объем багажного отделения в пассажирском / грузовом…
  • Двигатель
  • Код двигателя
  • Тип двигателя
  • Система питания
  • Количество, расположение…
  • Рабочий объем, куб. см
  • Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об….
  • Максимальный крутящий момент, Нм / об….
  • Рекомендуемое топливо
  • Динамические характеристики
  • Максимальная скорость, км/ч
  • Время разгона 0-100 км/ч, с
  • Расход топлива
  • Городской цикл, л/100 км
  • Загородный цикл, л/100 км
  • Смешанный цикл, л/100 км
  • Масса
  • Снаряженная масса, кг
  • Технически допустимая максимальная масса,…
  • Максимальная масса прицепа без тормозной системы /…
  • Объем топливного бака, л
  • Трансмиссия
  • Тип трансмиссии
  • Передаточное число главной…
  • Подвеска
  • Передняя
  • Задняя
  • Рулевое управление
  • Рулевой механизм
  • Шины
  • Размерность
  • msta.lada.ru

    2191280401501 Бампер ВАЗ-2191 задний — 2191-2804015-01

    2191280401501 Бампер ВАЗ-2191 задний — 2191-2804015-01 — фото, цена, описание, применимость. Купить в интернет-магазине AvtoAll.Ru Распечатать

    1

    1

    Применяется: ВАЗ

    Артикул: 2191-2804015-01

    Код для заказа: 574450

    Добавлено пользователем

    4 225 ₽

    В корзину

    Способы оплаты: Наличные при получении VISA, MasterCard, МИР, Google Pay
    Долями Оплата через банк Производитель: NO NAME Получить информацию о товаре или оформить заказ вы можете по телефону 8 800 6006 966. Есть в наличии

    Доступно для заказа1 шт.Данные обновлены: 03.04.2022 в 14:30

    Код для заказа 574450 Артикулы 2191-2804015-01
    Производитель
    NO NAME Каталожная группа: ..Рама
    Ходовая часть
    Ширина, м: 0.9 Высота, м: 0.5 Длина, м: 1.7
    Вес, кг: 3

    Отзывы о товаре

    Вопрос-ответ

    Задавайте вопросы и эксперты
    помогут вам найти ответ

    Где применяется

    Обзоры

    Статьи о товаре

    • Бампер: стиль и безопасность
      16 Октября 2013

      В экстерьере современного автомобиля есть две детали, которые играют важную роль и в дизайне, и в обеспечении безопасности. Детали эти — передний и задний бамперы. О том, что такое бампер, какую он имеет конструкцию, из чего изготавливается и для чего нужен в машине — Вы узнаете из этой статьи.

    • «Хрустальные» ВАЗы: Лада Гранта и Лада Ларгус 9 Апреля 2013

      Сегодня в очередной статье серии ««Хрустальные» ВАЗы или типичные поломки отечественных автомобилей» речь пойдёт о последних разработках Волжского автомобильного завода: Ладе Гранте и Ладе Ларгус. Расскажем об истории создания этих моделей, а также об их характерных неисправностях.

    • Бампер ВАЗ-2191 задний Артикул: 2191-2804015-01 Код для заказа: 574450

      4 225 ₽

      или оформите заказ по телефону 8 800 6006 966
    Наличие товара на складах и в магазинах, а также цена товара указана на 03.04.2022 14:30.

    Цены и наличие товара во всех магазинах и складах обновляются 1 раз в час. При достаточном количестве товара в нужном вам магазине вы можете купить его без предзаказа.

    Интернет-цена — действительна при заказе на сайте или через оператора call-центра по телефону
    8 800
    6006 966. При условии достаточного количества товара в момент заказа.

    Цена в магазинах — розничная цена товара в торговых залах магазинов без предварительного заказа.

    Срок перемещения товара с удаленного склада на склад интернет-магазина.

    Представленные данные о запчастях на этой странице несут исключительно информационный характер.

    12d7e6e53f947001df002a6ace3b0a28

    Добавление в корзину

    Код для заказа:

    Доступно для заказа:

    Кратность для заказа:

    Добавить

    Отменить

    Товар успешно добавлен в корзину

    !

    В вашей корзине на сумму

    Закрыть

    Оформить заказ

    Фаркоп Трейлер 2191 на VAZ Lada Granta 2191 2014-2018гг. недорого

    Фаркоп Трейлер 2191 на VAZ Lada Granta 2191 лифтбэк 2014-2018гг. — это качественное и надежное тягово-сцепное устройство, отличающееся от аналогов высоким качеством используемых материалов и усовершенствованными техническими характеристиками, благодаря чему он прослужит максимально длительный срок службы.

    Компания производитель Трейлер данной модели фаркопа 2191 на VAZ Lada Granta 2191 лифтбэк 2014-2018гг., купить который в нашем интернет-магазине вы сможете по самой выгодной цене, уже давно зарекомендовала себя на отечественном рынке с самой лучшей стороны. В свою очередь это подтверждается безупречным качеством предлагаемой продукции — фаркопов и постоянным высоким спросом на них среди автолюбителей.

    Представленный вниманию наших покупателей фаркоп Трейлер 2191 предназначается для автомобилей VAZ Lada Granta 2191 лифтбэк 2014-2018гг.. К его основным привлекательным характеристикам можно отнести: надежность конструкции, что обеспечивает прочную сцепку — именно этот параметр очень важен при грузоперевозках. Сделав свой выбор в пользу фаркопа Трейлер 2191, вы можете быть спокойны за безопасное передвижение на дороге при транспортировке грузов. Хотелось бы отметить, что современные фаркопы, в том числе и представленная на данной странице модель Трейлер 2191 — это устройства, позволяющие значительно расширить функционал любого автомобиля. Поэтому не стоит пренебрегать возможностями, которое поможет реализовать ТСУ!

    Покупка фаркопа Трейлер 2191 на VAZ Lada Granta 2191 лифтбэк 2014-2018гг.

    Для того чтобы купить данный фаркоп, вы можете воспользоваться несколькими вариантами:

    — сделать стандартный заказ посредством корзины на сайте;

    — сделать заказ, связавшись с нашими консультантами по указанным на сайте номерам;

    — сделать заказ по электронной почте или же заказать обратный звонок для оформления покупки.

    Обращаем внимание на то, что в нашей компании работают профессионалы своего дела с большим практическим опытом, которые помогут вам подобрать необходимую модель фаркопа для вашего автомобиля. Также мы предлагаем нашим покупателям вместе с приобретением ТСУ и дополнительную услугу — установка фаркопа, которая осуществляется нашими мастерами в течении нескольких часов в присутствии заказчика. Также обратите ваше внимание на полезные дополнения для автомобиля: багажники на крышу, автоковрики, автобоксы, защиты картера и другие, которые в широком ассортименте предлагаются на нашем сайте!

    «АвтоВАЗ» отзывает более 14 тыс. Lada Granta из-за проблемы с тормозами — РБК

    Проданные с апреля 2014 года автомобили Lada Granta в комплектации с ABS подлежат отзыву для устранения дефекта тормозной системы. Всего отзыву подлежат более 14 тыс. автомобилей, на которых возможно перетирание тормозной трубки тросом сцепления

    Фото: ТАСС

    Уведомление об отзыве получил от ОАО «АвтоВАЗ» Росстандарт, на сайте которого опубликовано соответствующее сообщение. «Поступила информация от ОАО «АвтоВАЗ» об отзыве 14 659 автомобилей Lada 2191 (Granta) в комплектации с ABS, реализованных с апреля 2014 года по настоящее время. На указанных транспортных средствах возможно перетирание тормозной трубки тросом сцепления», – говорится на сайте ведомства.

    Отмечается, что владельцы автомобилей, попавших под отзыв, могут самостоятельно, не дожидаясь письма от уполномоченного дилера «АвтоВАЗа», связаться с ближайшим дилерским центром и записаться на ремонт. Определить, подпадает ли конкретная машина под отзыв, можно по VIN-коду, сравнив его со списком, опубликованным на сайте Росстандарта.

    Дилеры завода сообщат владельцам автомобилей с потенциальным дефектом письменно или по телефону о необходимости посетить сервисный центр для проведения ремонтных работ. Для устранения дефекта на всех автомобилях установят держатель троса сцепления, который предотвратит соприкосновение троса с тормозной трубкой. При этом возможна замена самой тормозной трубки, если на ней будут обнаружены следы контакта с тросом. Все ремонтные работы будут выполнены бесплатно.

    Первый отзыв партии автомобилей Lada Granta для устранения дефектов произошел через месяц после начала производства этой модели. В январе 2012 года «АвтоВАЗ» объявил о необходимости дополнительной герметизации жгута проводов, под отзыв попали около 600 машин. Представитель завода пояснил тогда, что еще до начала официальных продаж Lada Granta дилерам было отправлено более тысячи автомобилей для демонстрации и проведения тест-драйвов. В ходе пробной эксплуатации была выявлена недостаточная «герметичность щитка передка в зоне выхода жгута проводов».

    Одну из самых крупных отзывных кампаний 2014 года провела General Motors, которая в апреле объявила сразу о нескольких поводах для устранения дефектов. Общее число отозванных машин, по оценкам компании, должно было составить более 7 млн. При этом издержки автопроизводителя оценили в $1,3 млрд. Ранее из-за проблем с системой зажигания автомобили компании попали в 31 аварию, погибли 12 человек. Кроме того, компанию обвинили в том, что она знала о проблеме с зажиганием в автомобилях уже 10 лет, но ничего не предпринимала.

    LADA 21910280401511 Бампер задний — цена и аналоги:

    Год 01.01.2014
    Модификации 21901-41, 21906-40 GRANTA, 21911-40, 21911-41, 21912-42, 21917-41, 21917-42 GRANTA
    Производитель GRANTA (Гранта 2190), GRANTA (Гранта 2191)

    Информация для покупателей

    Просим вас быть бдительными при переводе денежных средств третьим лицам.

    Фильтр

    • срок доставки
    • Доступное количество
    • Сбросить

    Представленные на сайте цены товара LADA 21910280401511 Бампер задний указаны с учетом доставки до пункта самовывоза в городе Новокузнецк.

    Для уточнения стоимости доставки по России Вы можете обратиться к менеджеру нашего интернет-магазина по указанным контактам. Для самостоятельного рассчета доставки воспользуйтесь нашим онлайн-калькулятором рассчета доставки. 

     

     

     

    Чтобы купить LADA 21910280401511:

    1. Определитесь со сроками, выберите необходимое количество и добавьте LADA 21910280401511 в корзину.

    2. Оформите заказ, следуя подсказкам в корзине.

    3. Оплатите заказ, выбрав удобный способ оплаты. Напоминаем, что мы работаем только по 100% предоплате.

    4. Если товар в наличии — Вы можете буквально сразу же получить его в нашем пункте самовывоза.

    Каждая запчасть имеет свою применимость к определённым маркам автомобиля. Обязательно перед оформлением заказа убедитесь, что LADA 21910280401511 Бампер задний подходит к Вашему автомобилю.

    Информация по заменителям (дубликатам, заменам, аналогам) имеет исключительно справочный характер и не гарантирует совместимость с вашим автомобилем! Если Вы не уверены в том, что выбранная Вами деталь подходит к Вашему транспортному средству — обратитесь за помощью к менеджеру по подбору запчастей.

    Размещённая на сайте информация (описание, технические характеристики, а так же фотографии) приведена для ознакомления и не является публичной офертой. Не может служить основанием для предъявления претензий в случае изменения характеристик, комплектности и внешнего вида товара производителем без уведомления.

    Фары для новой Lada Granta будут делать узбеки — Российская газета

    Совместное предприятие «УзЧасис» в узбекском городе Наманган с июля начнет выпускать часть комплектующих для обновленной линейки автомобилей Lada.

    В частности, на заводе станут производить фары для модели Granta, которая получит новый фирменный дизайн АвтоВАЗа. Об этом сообщает правительственный портал Республики Узбекистан.

    «Будут изготавливаться и поставляться на предприятия компании АвтоВАЗ передние фары для автомобиля Lada Granta FL, номерные лампы Lada Vesta SW/SW Cross, а также около десяти видов освещающих ламп для автомобилей Lada 2190, Lada 2191, Lada 8450, Lada 1117 и Lada 1119», — отмечается в сообщении.

    СП ООО «УзЧасис» было основано в октябре 2008 года акционерным обществом «Узавтопром» и южно-корейской компанией AMS Co. Ltd. Уставной фонд предприятия составлял 5,95 млн долларов, причем доля узбекской стороны составила 70%. В настоящее время завод специализируется на производстве автомобильных фар и фонарей из полимерных материалов для моделей Chevrolet и Ravon, выпускаемых в Узбекистане и Бразилии. Годовая мощность — 270 тысяч комплектов. На предприятии установлено оборудование из Кореи (LS, Hankook), Германии (OErlicon) и Японии (Meiki, Yaskawa).

    Для реализации проекта с АвтоВАЗом на заводе обещают применять современные технологии индийской компании Neolite Zkw Lightngs Pvt Ltd и немецкой Genter Service GmbH. Дополнительно будет создано 35 новых рабочих мест.

    О новой Lada Granta «РГ» писала уже не раз — машину неоднократно замечали на тестах в Самарской области, а также показывали на эскизах. Известно, что у автомобиля изменится решетка радиатора, будут новые фары, крышки капота и багажника, а также оба бампера. Спереди появится новый «шильдик» с полными парусами, а на задней панели багажника — название Lada, выложенное крупными литерами. Туда же перенесут и номерной знак. Кроме того, Granta получит новую панель приборов и систему дистанционного управления и мониторинга Lada Connect. Она позволит владельцу выполнять ряд простых процедур с машиной со своего смартфона. В техническом плане изменений не ожидается.

    По предварительной информации, обновленную Lada Granta представят на Московском международном автосалоне, который откроется в конце августа текущего года. Производство машины начнется, вероятно, сразу после премьеры.

    Что касается других перечисленных в сообщении моделей, то речь идет о прежней линейке Lada — Granta (седан и лифтбек), Kalina (универсал и хэтчбек) и Largus.

    фотографий авиации такси на JetPhotos

    Если вы ищете фотографии определенного типа самолета, используйте это меню.
    Обратите внимание, что из-за нехватки места в этом меню представлены только некоторые наиболее востребованные самолеты в нашей базе данных. Если самолета, который вы ищете, нет в этом списке, используйте поле «Ключевые слова» ниже в меню поиска.

    Некоторые пункты меню включают общую модель самолета, а также более конкретные варианты этого авиалайнера.Эти варианты обозначаются знаком — перед названием самолета.

    Например, при выборе «Boeing 747» будут показаны результаты со всеми лайнерами Boeing 747 в нашей базе данных, а при выборе «- Boeing 747-200» будут показаны все варианты Boeing 747-200 в нашей базе данных (Boeing 747-200, Boeing 747- 212B, Боинг 747-283F и др.)

    Если вы ищете фотографии конкретной авиакомпании, используйте это меню.

    Обратите внимание, что из-за нехватки места в этом меню представлены только авиакомпании, 10 и более фотографий которых есть в нашей базе данных.Если авиакомпании, которую вы ищете, нет в этом списке, используйте поле «Ключевые слова» ниже в меню поиска.

    Авиакомпании перечислены в алфавитном порядке.

    Если вы ищете фотографии, сделанные в определенной стране или в определенном аэропорту, используйте это меню.

    Все страны, представленные в нашей базе данных, включены в это меню выбора, которое автоматически обновляется по мере роста базы данных.В базе данных должно быть не менее 20 фотографий из определенного аэропорта, прежде чем этот аэропорт будет добавлен в этот список.

    Используйте эту опцию, чтобы включить в поиск только фотографии, сделанные конкретным фотографом.

    Это выпадающее меню, в дополнение к каждому фотографу, доступному в качестве ограничителя поиска, также показывает количество фотографий, находящихся в настоящее время в базе данных для каждого конкретного фотографа, заключенного в скобки.Например, вариант:
    — Пол Джонс [550]
    .. указывает, что в настоящее время в базе данных всего 550 фотографий, сделанных Полом Джонсом.

    Примечание. Общее количество фотографий, заключенное в скобки, обновляется четыре (4) раза в час и может быть несколько неточным.

    Фотографы должны иметь 100 или более фотографий в базе данных, прежде чем их имя будет включено в это меню выбора..
    Выбор «Все фотографы» является выбором по умолчанию для этой опции.

    Если вы ищете определенную категорию фотографий, используйте это меню.

    Вы можете выбрать отображение только фотографий из определенных категорий, таких как «Специальные схемы окраски», «Фото кабины экипажа» и т. д. В этот список постоянно добавляются новые категории.

    Поле «Ключевые слова», пожалуй, самое полезное поле, включенное в нашу поисковую систему.
    Используя это поле, вы можете искать любое слово, термин или комбинацию терминов в нашей базе данных.
    Каждое поле фотографии охватывается процедурой поиска по ключевым словам.

    Поле «Ключевые слова» идеально подходит для поиска таких сведений, как регистрация самолетов, имена фотографов, конкретные названия аэропортов/городов, определенные схемы окраски (например, «Wunala Dreaming») и т. д.
    Чтобы использовать поле «Ключевые слова», начните с выбора поля поиска Keyworld. . Вы можете выбрать конкретное поле базы данных (авиакомпания, самолет и т. д.) или сопоставить ключевое слово со всеми полями базы данных.

    Затем выберите ограничитель ключевых слов. Есть три варианта, из которых можно выбрать:
    — точно
    — начинается с
    — содержит
    Выберите соответствующий ограничитель для вашего поиска, затем введите ключевые слова, которые вы хотите найти, в поле справа.

    Поле поиска по ключевым словам не чувствительно к регистру.

    Используйте этот параметр, чтобы включить в поиск только фотографии, сделанные в определенном году.

    Это выпадающее меню, в дополнение к каждому году, доступному в качестве ограничителя поиска, также показывает количество фотографий, находящихся в настоящее время в базе данных для каждого конкретного года, заключенного в скобки. Например, вариант:
    — 2003 [55000]
    .. указывает, что в настоящее время в базе данных 55 000 фотографий, сделанных в 2003 году.
    *Примечание. Общее количество фотографий, заключенное в скобки, обновляется четыре (4) раза в час и может быть несколько неточным.

    Кроме того, в этом меню можно выбрать десятичные диапазоны (1990–1999 и т. д.). При выборе диапазона десятилетий будут показаны все фотографии, соответствующие другим критериям поиска из выбранного десятилетия.
    Выбор «Все годы» является выбором по умолчанию для этой опции.

    Сайт Fmm2019apk на Strikingly

    После отказа Picasa от дальнейшего продвижения в 2016 году Google сообщил в марте, что проект изменения фотографий рабочей области больше никогда не будет работать для передачи или загрузки фотографий или контроля онлайн-коллекций.Сравнительные проекты существуют, но они могут не иметь такого же невероятного набора устройств для редактирования и простых возможностей обмена онлайн-коллекциями, как бесплатное программное обеспечение Picasa. альтернатива Picasa Чтобы сделать свой выбор более точным, сделайте краткий обзор наиболее часто используемых функций, а затем попытайтесь найти замену, которая лучше всего соответствует набору инструментов Picasa.

     

    Google Photos Администрация, которая заменила Picasa в линейке бесплатных программ организации, может быть наименее требовательной к вашим записям, поскольку ваши веб-альбомы Picasa, по всей вероятности, находятся там на данный момент из-за перехода Google со старой программы на новую. модернизированный. Альтернатива Picasa Вам просто нужно войти на photos.google.com с таким же именем учетной записи Google и секретной фразой, которые вы использовали для Picasa. Google Фото может создавать резервные копии изображений с вашего ПК на серверное пространство в Интернете, и вы можете запрашивать печатные книги своих фотографий в Интернете. Учитывая все обстоятельства, некоторые могут обнаружить, что устройства для редактирования фотографий более ограничены, чем те, которые предлагаются в Picasa.

     

    Заинтригованы технологиями All Things Брошюра Bits будет держать вас в курсе последних новостей Кремниевой долины и инновационного бизнеса. Picasa Альтернатива ImageGoogle Photos, которая вытеснила Picasa в качестве основной фотопрограммы компании, включает в себя каналы и основные элементы управления изменением изображения, но может не дать достаточного количества устройств некоторым любителям фотографии.

     

    Google Photos, который вытеснил Picasa в качестве основной программы управления фотографиями компании, включает в себя каналы и основные элементы управления изменением изображения, но может не дать достаточного количества устройств некоторым любителям фотографии.CreditThe New York Times Предполагая, что «бесплатно» — это правильная стоимость для вас, но вам нужно больше изменять и модифицировать элементы управления, фотопроекты, созданные Apple и Microsoft, могут помочь. Альтернатива Picasa Несмотря на устройства редактирования обрезки и затенения, Photos для Mac и Microsoft Photos для Windows 10 могут исправить эффект красных глаз, вызванный полосой камеры, сортировать изображения с метками, делиться онлайн-коллекциями и скрывать дефекты внутри картина.

    Продвижение Программа GIMP с открытым исходным кодом (GNU Image Manipulation Program) с открытым исходным кодом — это еще одна адаптируемая программа для редактирования фотографий, однако она может быть несколько более специализированной, чем некоторые приложения уровня раздела.Если это спровоцирует ваше преимущество, у GIMP есть онлайн-руководство по клиенту, которое вы можете просмотреть перед загрузкой.

     

    Откройте все больше бесплатных статей. Зарегистрируйтесь или войдите на сайт обмена изображениями Flickr, недавно приобретенный SmugMug, предлагает устройства для редактирования фотографий, терабайт бесплатного дополнительного пространства и поддержку печатных фотокниг. Для тех, кто нуждается в мощных редакторах и коллекциях, которые включены в доску и не будут беспокоиться о том, чтобы заплатить, ADSee Photo Studio и Adobe Photoshop Elements — два проекта, которые стоит рассмотреть. альтернатива picasa Каждый может загрузить бесплатную предварительную версию, чтобы протестировать продукт перед его приобретением. Несмотря на то, что ожидание обучения и адаптации может быть высоким, план Adobe Creative Cloud Photography включает стандартные для бизнеса Adobe Photoshop CC и Adobe Lightroom CC за 10 долларов в месяц.

    Не все проекты по обработке фотографий включают возможность прямого запроса распечаток в Интернете. Когда вам нужны физические дубликаты ваших фотографий, чтобы поделиться ими, вы можете отправить измененные изображения из вашей фотопрограммы и передать их на сайт веб-службы печати, такой как Adorama Pix, Nations Photo Lab, Shutterfly или Snapfish.

     

    Несмотря на то, что это не было открытым исходным кодом, как бесплатный продукт с солидным бизнес-спонсором, клиент рабочей области Picasa оказался очень хорошо известен среди начинающих фотографов, поэтому с новостями о прекращении проекта многие размышляют, где повернуться рядом для их фотографии, в которой нуждается руководство. Альтернатива picasa Picasa была доступна на разных этапах, и, учитывая, что в последнее время она не была включена в комплект для Linux, несмотря на то, что она отлично работала для некоторых клиентов Linux в Wine.

    Стратегии эффективного сбора солнечной энергии с использованием квантовых точек и устройств, чувствительных к красителям

    Автор
    Пунтамбекар, Аджинкья

    Другие участники
    Чакрапани, Видхья; Каранде, Панкадж; Ши, Суфей; Лакшми, К.В.

    Дата выпуска
    2017-12

    Предмет
    Химическая инженерия

    Степень
    Кандидат наук

    Условия использования
    Эта электронная версия является лицензированной копией, принадлежащей Rensselaer Polytechnic Institute, Troy, NY.Авторские права на оригинальное произведение сохраняются за автором.;

    Метаданные
    Показать полную запись товара
    УИН
    https://hdl.handle.net/20.500.13015/2191

    Abstract
    Фотоэлектрохимические (PEC) солнечные элементы, такие как солнечные элементы на основе квантовых точек (QDSC) и сенсибилизированные красителем солнечные элементы (DSSC), стали двумя наиболее эффективными фотогальваническими элементами третьего поколения, которые могут превзойти потенциал Шокли-Квиссера. предел максимальной эффективности в фотогальванике. Чтобы повысить эффективность, было использовано несколько стратегий, таких как включение люминофоров, плазмонных структур и красителей, передающих энергию.Основная цель этой диссертационной работы — разработать стратегии повышения эффективности УИК выше 15%. Этот отчет состоит из двух разных исследований. Первое исследование включает использование люминофоров с повышающей конверсией для расширения спектрального диапазона поглощения органического сенсибилизирующего красителя, используемого в DSSC. Второе исследование связано с пониманием эффекта электрохимической зарядки квантовых точек CdSe в электролитах, содержащих различные ионы, и их влияния на фундаментальные фотофизические свойства.; Основное внимание в первом проекте уделяется пониманию фундаментальной природы процессов передачи энергии и заряда, происходящих в устройстве DSSC, и разработке стратегий, которые в конечном итоге приведут к повышению эффективности устройства. Несмотря на свой огромный потенциал, DSSC, использующие в своей архитектуре люминофоры, продемонстрировали лишь незначительное улучшение производительности устройства. Отчасти это связано с непониманием механизма процессов передачи энергии от люминофоров в возбужденном состоянии к молекулам красителя-сенсибилизатора.В настоящем исследовании процессы переноса энергии с участием фосфора и органических сенсибилизирующих красителей изучались с использованием стационарной и нестационарной фотолюминесцентной спектроскопии. Результаты этих экспериментов показали, что способ передачи энергии между люминофором и красителем носит излучательный характер, в отличие от резонансной передачи энергии Форстера (FRET), которая обычно наблюдается в случае использования органических релейных красителей. Прототипы солнечных элементов, изготовленные с использованием люминофоров с повышающим преобразованием, продемонстрировали увеличение плотности фототока на 63 % и повышение общей эффективности выработки электроэнергии на 54 % по сравнению с устройствами, не содержащими люминофоров.; Включение люминофора в ячейку также улучшило электрические характеристики в темных условиях, когда устройство генерировало 52 мкВт/см2 мощности, что продемонстрировало их использование в качестве устройств на солнечных батареях в ночное время. В условиях короткого замыкания прибор мог выдавать напряжение 300 мВ в течение 30 часов после удаления источника светового возбуждения. Такое устройство может хорошо подходить для преобразования света в помещении в электрическую энергию и, таким образом, может беспроводным способом погружаться в маломощные устройства, такие как датчики.Несмотря на то, что этот метод был продемонстрирован для DSSC, его можно легко адаптировать для других типов солнечных элементов, таких как тонкослойные твердотельные или полимерные солнечные элементы; Во втором проекте были исследованы фундаментальные оптические и электронные свойства квантовых точек CdSe, часто используемых в ФЭП в качестве поглотителей света, при электрохимическом заряде различными ионными электролитами. Исследованы два режима двухслойной зарядки и оценено их влияние на оптические и электронные свойства КТ.Показано, что механизм зарядки на границе раздела включает интеркаляцию катионов для более мелких ионов, таких как Li+, Na+ или K+, и адсорбцию катионов для более объемных ионов, таких как ионы тетрабутиламмония, где стерические затруднения исключают интеркаляцию. В результате, в то время как адсорбция катионов приводит к увеличению поглощения в среднем инфракрасном спектральном диапазоне, интеркаляция катионов в ядро ​​CdSe приводит к увеличению поглощения от видимого до инфракрасного диапазона спектра, увеличению радиационного времени жизни e-, увеличение на 158% интенсивности краевой фотолюминесценции и сильное излучение в ближней инфракрасной области спектра в результате образования вакансий Se.Природа механизмов зарядки обсуждается с использованием результатов совместных исследований фотолюминесценции, радиационного времени жизни и рентгеновской фотоэмиссии. Электронная и оптическая модуляция с катионной связью, описанная здесь в КТ CdSe, имеет важные последствия для электрохромных интеллектуальных окон, фотогальваники и других устройств.

    Описание
    Декабрь 2017 г.; Инженерная школа

    Кафедра
    Кафедра химической и биологической инженерии

    Издатель
    Политехнический институт Ренсселера, Трой, Нью-Йорк

    Доступ
    Только для преподавателей, сотрудников и студентов Ренсселера.Запросы на доступ можно направлять в библиотеки Rensselaer.

    Фотоконкурс из моего архива Самые популярные фотографы! — Каркасы Высокой Пустыни!

    С более чем 80 работами в фотоконкурсе High Desert Frameworks «Из моих архивов» выбрать награду «Выбор судей» будет непросто! Следующие 5 фотографов получили высшие награды Popular Choice, а 2 художника получили отличные призы Popular Choice!

    Но мы не будем объявлять победителей в обеих категориях до пятницы, 17 апреля.Предположим, у нас достаточно пива для судей, и Zoom нас не подводит!

    Рене М., Бенд, Орегон


    Ребекка Д., Бенд, Орегон
    Лорена В., Прайнвилль, Орегон
    Кассандра Р., Мадрас, Орегон
    Дэвид В., Бенд, Орегон

    А пока….

    Берегите себя, берегите себя и мойте чертовы руки, пожалуйста!

    Награда/Приз судей:

    Высшая награда: одна (1) цифровая копия вашей работы в рамке размером 11 x 14 дюймов +/-. Приблизительная сумма выигрыша $75-$200.00.

    Второе место: одна (1) цифровая копия вашей работы размером 11 x 14 дюймов +/-. Приблизительная сумма выигрыша $15-$32

    Награда/приз зрительских симпатий:

    Победитель высшего балла: Наибольшее количество популярных голосов: 1 в рамке 11 x 14 дюймов +/- Индивидуальная цифровая печать вашей работы. Приблизительная сумма выигрыша $75-$200.00.

    Второе место Победитель: Второй по величине Количество популярных голосов: 1 11 x 14 дюймов +/- Пользовательская цифровая печать вашей работы. Приблизительная сумма выигрыша $15-$32 (Победители, занявшие первое и второе место, не могут быть одним и тем же лицом/участником).

    Но подождите — это еще не все!

    В честь недавнего торжественного открытия High Desert Frameworks www.Frame.Pics, онлайн-портала цифровой печати и кадрирования в Центральном Орегоне, 5 лучших фотографов В ОБЕИХ категориях получат бесплатную распечатку изображения размером 11×14 по своему выбору. Фотографы-победители будут объявлены в пятницу, 17 апреля, и к понедельнику они должны получить электронное письмо с информацией о загрузке и получении. Хотдог!

    Распечатайте то, что вам нравится — кадрируйте то, чем вы дорожите

    www.Рамка.Фото


    Для получения дополнительной информации о пользовательских вариантах кадрирования изображений, сканировании с высоким разрешением, изобразительном искусстве и индивидуальной цифровой печати посетите наш офис в центре города Бенд, штат Орегон, , или свяжитесь с нами по телефону или через Интернет ! Мы лучший выбор в обрамлении картин Bend и во всем Центральном Орегоне.

    Каркасы Высокой Пустыни!
    61 NW Oregon Avenue Suite 101 Bend Oregon 97703
     
    www.highdesertframeworks.ком
    (541) 647-2191

    Мы — ваши цифровые услуги и индивидуальное решение для кадрирования в Центральном Орегоне.    

    STELLAR CUSTOM FRAMING
    ШИРОКОФОРМАТНАЯ ЦИФРОВАЯ ПЕЧАТЬ И СКАНИРОВАНИЕ
    ИЗОБРАЗИТЕЛЬНАЯ И ГРАФИЧЕСКАЯ ПЕЧАТЬ ПО ЗАПРОСУ
    СОХРАНЕНИЕ ЖИЗНЕННЫХ СОБЫТИЙ И ВОСПОМИНАНИЙ


    3 4 4

    Выбор местных жителей в Центральном Орегоне

    Подпишитесь на нашу рассылку:   Оставайтесь на связи!

    Они разговаривают!
    Наши клиенты делятся любовью! Узнайте больше:   Отзыв/отзыв

    Позвоните нам, и мы организуем доставку, или вы можете заказать онлайн по телефону: Самовывоз/доставка .

    Куда и что дальше? Шкаф прибран, и мои туфли стоят в ряд. За холодильником нет комков пыли. Я ненавижу зум!

    Как и многие из вас, мы спрашиваем: «Куда дальше и что дальше». Мы не уверены на 100%, что будет дальше, но мы справимся с этим. Мы не только справимся с этим, но и станем сильнее. Ежедневно мы пользуемся возможностью подумать, быть благоразумными и благодарными. Да, благодарен. Благодарен за поддержку сообщества, поскольку мы все в этом вместе.Похоже, COVID-19 затронул всех нас, одних больше, других больше. Наши сердца обращены к тем, кто непосредственно пострадал.

    2021 год! А мы по-прежнему открыты, по-прежнему обрамляем, по-прежнему печатаем и работаем до мозга костей! Двухнедельный мораторий, введенный губернатором в ноябре 2020 года, закончился, и мы почти полностью открыты, но с некоторыми ограничениями. Нет никаких изменений в требованиях о покрытии лица и требованиях физического дистанцирования в 6 футов или более. Мы сообщим вам, где вы можете подождать.Как и с марта 2020 года, мы предлагаем услуги по вывозу/доставке и помощь на обочине. Просто спроси! Хотя это и не требуется, мы настоятельно рекомендуем вам назначить встречу для печати и оформления. Забронируйте здесь: https://bit.ly/HDFW_Appointment

    Если у вас есть какие-либо вопросы относительно наших услуг, позвоните нам по телефону 541-647-2191 или свяжитесь с нами!

    Спасибо и удачных вам каникул — До скорой встречи!

    Пожалуйста, мойте руки!

    Мы используем этот пост, чтобы информировать вас о влиянии COVID-19 на High Desert Frameworks, часах работы, вариантах получения и доставки, а также о других важных темах.Пожалуйста, посетите этот пост, так как мы будем обновлять его по мере изменения ситуации. Панель баннеров в верхней части нашего веб-сайта будет ссылаться на этот пост до тех пор, пока в нем больше не будет необходимости.

    Поскольку мы продолжаем оставаться открытыми, мы работаем над тем, чтобы держать себя и магазины в чистоте, а также практикуем крылатую фразу «социальное дистанцирование». Если у вас есть проекты, звоните. У нас есть услуги по вывозу и доставке, которые вы можете заказать онлайн по адресу: Pickup/Delivery. Мы надеемся увидеть вас в ближайшие недели или когда вы почувствуете себя комфортно.

    Желаем всем вам безопасной и здоровой весны и не только. После того, как вы прочитаете наши обновления, пожалуйста, найдите время, чтобы понюхать розы, отправьтесь в уединенную прогулку со своей собакой и, если вы еще этого не сделали, наведите порядок в шкафу и загляните за холодильник!

    Верно,

    Мирна и команда High Desert Frameworks!

    61 NW Oregon Avenue Suite 101

    Downtown, Bend OR 97703

    541-647-2191

    www.HighDesertFrameworks.com

    Перед записью на прием ознакомьтесь с нашей Политикой социального и физического дистанцирования!

    Обновления

    2021 год! А мы по-прежнему открыты, по-прежнему обрамляем, по-прежнему печатаем и работаем до мозга костей! Двухнедельный мораторий, введенный губернатором в ноябре 2020 года, закончился, и мы почти полностью открыты, но с некоторыми ограничениями.Нет никаких изменений в требованиях о покрытии лица и требованиях физического дистанцирования в 6 футов или более. Мы сообщим вам, где вы можете подождать. Как и с марта 2020 года, мы предлагаем услуги по вывозу/доставке и помощь на обочине. Просто спроси! Хотя это и не требуется, мы настоятельно рекомендуем вам назначить встречу для печати и оформления. Бронируйте здесь: https://bit.ly/HDFW_Appointment

    18 ноября 2020 г. : МЫ ОТКРЫТЫ! Губернатор штата Орегон Кейт Браун ввела двухнедельный мораторий на розничную торговлю и другие отрасли.Как это повлияет на High Desert Frameworks? Как розничный бизнес, нам разрешено оставаться открытыми, но мы ограничены 75% вместимостью нашего розничного выставочного зала. Это означает, что мы можем видеть не более 2 групп людей с максимальным количеством 4-5 человек в выставочном зале в любое время. Мы можем помочь вам с цифровой печатью и индивидуальным дизайном рамы и будем работать с каждым из вас в соответствии с государственными требованиями. Нет никаких изменений в требованиях о покрытии лица и требованиях физического дистанцирования в 6 футов или более.Мы сообщим вам, где вы можете подождать. Как и с марта 2020 года, мы предлагаем услуги по вывозу/доставке и помощь на обочине. Просто спроси! Хотя это и не требуется, мы настоятельно рекомендуем вам назначить встречу для печати и оформления. Забронируйте здесь: https://bit.ly/HDFW_Appointment

    Если у вас есть какие-либо вопросы относительно наших услуг, позвоните нам по телефону 541-647-2191 или свяжитесь с нами!

    Спасибо и удачных вам каникул — До скорой встречи!

    По состоянию на 1 июля 2020 г. … Штат Орегон требует от вас носить маски, лицевые щитки или покрытия для лица в этом месте, если не применяется исключение.Мы будем носить лицевые покрытия в соответствии с требованиями округа и штата Орегон.

    По состоянию на 15 мая 2020 года… Мы работаем в обычном режиме розничной торговли для виртуального и INSTORE Framing/Digital дизайна, работаем с доставкой и самовывозом по предварительной записи или без нее. Вопросы? Звоните 541-647-2191. Если вы хотите записаться на прием, нажмите здесь: https://bit.ly/HDFW_Appointment…

    22 мая 2020 г. : Приходите с нами! Мы открыты в выходные, посвященные Дню памяти.

    Наши часы работы:

    Пятница с 10:00 до 17:30

    Суббота с 10:00 до 14:00 (или позже, но звоните),

    Закрыто в воскресенье.

    Понедельник с 10:00 до 17:30.

    Принесите проект! Встречи предлагаются, но не обязательны: https://bit.ly/HDFW_Appointment…

    Не стесняйтесь загружать свое изображение на www.Frame.Pics, и мы распечатаем его и подготовим к встрече с вами. К вашему сведению — теперь у нас есть три варианта загрузки для ваших потребностей в цифровой печати: Посетите: http://bit.ly/HDFW_Upload

    Наш вопрос: Как сыновья и дочери ветеранов и родители военнослужащих, мы просим вас помнить тех, кто заплатил окончательная цена за безопасность и безопасность нашей демократии.День памяти был посвящен памяти мужчин и женщин, погибших во время службы в вооруженных силах США. В этот понедельник, пожалуйста, найдите минутку и почтите память этих солдат. Спасибо!

    15 мая 2020 г.: Мы работаем в обычном режиме и предоставляем полный спектр услуг, включая розничные продажи, индивидуальное оформление, цифровые услуги, такие как сканирование, цифровая реставрация фотографий, мелко- и широкоформатная печать. Вам не нужна запись на прием, но вы можете запросить ее по адресу: https://bit.ly/HDFW_Appointment…

    Мы полностью продезинфицировали витрину нашего розничного магазина и запланировали усиленную уборку несколько раз в день и после каждого визита клиента.Мы разместили знаки, одобренные штатом Орегон, с информацией о предотвращении COVID-19, симптомах и надлежащей дезинфекции. С 15 мая 2020 г. при работе с вами мы будем носить маски для лица в соответствии с требованиями округа и штата Орегон. Вы можете не носить лицевое покрытие, поскольку оно не требуется для наших клиентов. У нас есть дозатор дезинфицирующего средства для рук, нитриловые перчатки, дезинфицирующие салфетки, салфетки и одноразовые ручки для вашего использования. Отдельные помещения магазина закрыты для посещения, в том числе туалет.Мы сообщим вам район, в котором вы можете перемещаться, отмеченный синей лентой. Пожалуйста, уважайте границы. Если вам нужно посмотреть образцы лепнины и матов на нашем конструкторском столе, мы пригласим вас посмотреть/одобрить, а также попросим вас не трогать. Мы всегда будем наслаждаться расстоянием не менее 6 футов. Наши консультации по проектированию за последние несколько недель дали отличные результаты, и наши клиенты очень довольны нашими процессами, процедурами и протоколами безопасности. Спасибо за ваше понимание в это время, и мы все привыкаем возвращаться к почти нормальной жизни.

    Пожалуйста, ознакомьтесь с нашими требованиями к посещениям на странице https://bit.ly/Positive_Focused

    Спасибо. Если у вас есть вопросы, звоните по телефону 541-647-2191. До скорого!

    10 мая 2020 г.: Поздравляем всех мам с Днем матери! Сегодня не ваш типичный бранч. Мы верим, что вы приготовили фантастический воскресный завтрак для мамы в вашей жизни. Если вы не смогли встретиться лицом к лицу, мы надеемся, что вы отлично поболтаете по телефону, в масштабе или в режиме реального времени.Сейчас совсем другие времена, но это также означает, что нам просто нужно импровизировать, сохранять позитивный настрой, быть благодарными и призывать всех максимально использовать каждый момент.

    Как уже известно большинству жителей штата Орегон, губернатор Браун и наш местный округ открывают 15 мая секции розничных магазинов и других секторов экономики. Есть еще некоторые вопросы, требующие уточнения, что именно означает «открытый», и по мере получения дополнительной информации мы будем обновлять этот пост.

    15 мая мы откроем наши двери для пешеходов, но мы настоятельно рекомендуем записаться на прием.Если у вас назначена встреча, вы будете в начале очереди, и вам не придется ждать, пока вас впустят в наш магазин. Мы можем разрешить только 1 человеку или 1 семейной группе находиться в магазине фреймов одновременно. Пожалуйста, забронируйте свои встречи здесь: Назначение кадрирования, включая получение завершенных проектов кадрирования и Назначение цифровых услуг, включая получение завершенных цифровых проектов.

    Наш розничный магазин дезинфицируется несколько раз в течение дня и после каждого посещения покупателя. У нас есть бесконтактный дозатор с дезинфицирующим средством для рук, и мы просим вас использовать дезинфицирующее средство, когда вы входите.Полную информацию о нашей политике социального дистанцирования можно найти по адресу: Positive Focused. В настоящее время мы поощряем, но не требуем, чтобы клиенты носили защитные маски. Мы будем носить лицевые покрытия в соответствии с указаниями губернатора Брауна и округа Дешут.

    Будем рады сотрудничеству с вами!

    20 апреля 2020 г.: Мы открыты для обрамления/цифрового дизайна, работы вывозятся и забираются по предварительной записи. Прежде чем записаться на прием, ознакомьтесь с нашей политикой в ​​отношении вашего визита: https://bit.ly/Positive_Focused… Запишитесь на прием здесь: https://bit.ly/HDFW_Appointment… Отдельное спасибо всем, кто находится на передовой! Оставайтесь сильными — Спасибо!

    16 апреля 2020 г.: Как многие из вас уже знают, ситуация улучшилась на Западном побережье, в штате Орегон и особенно в Центральном Орегоне. Большинство, если не все предприятия, пытаются вернуться к нормальной жизни, но, вероятно, в течение некоторого времени это будет больше похоже на «новую норму». Мы по-прежнему приветствуем вас по предварительной записи для индивидуального обрамления и цифровой печати.Пожалуйста, позвоните по номеру 541-647-2191, прежде чем посетить нас. Перед запланированной встречей прочитайте: https://bit.ly/Positive_Focused Наш открытый статус:  https://bit.ly/Covid_Update  Мы с нетерпением ждем встречи с вами! Запишитесь на прием: https://bit.ly/HDFW_Appointment

    Некоторые последние новости … High Desert Frameworks объявила об открытии онлайн-портала цифровой печати и кадрирования в Центральном Орегоне, расположенного по адресу: WWW.FRAME.PICS С Frame.Pics вы можете загрузить свои цифровое изображение, кадрирование, размер, а затем отправка для печати на различных носителях, включая фотобумагу, холст, металлические отпечатки и многое другое.Мы ожидаем предложить наши варианты загрузки и быстрого кадрирования очень скоро.

    Берегите себя, берегите себя — мойте свои чёртовы руки!

    6 апреля 2020 г.: Ждём вас по предварительной записи! Мы открыты для кадровой и цифровой работы и получаем ее только по предварительной записи. Пожалуйста, позвоните по номеру 541-647-2191, прежде чем посетить нас. Перед запланированной встречей прочитайте: https://bit.ly/Positive_Focused Наш открытый статус:  https://bit.ly/Covid_Update  Мы с нетерпением ждем встречи с вами! Запишитесь на прием: https://bit.ly/HDFW_Appointment  Будьте в безопасности, будьте в безопасности, оставайтесь позитивными, оставайтесь благодарными. Информацию о цифровой печати в Интернете можно найти по адресу: bit.ly/Scan-Print. Отдельное спасибо всем, кто находится на передовой! Оставайтесь сильными — Спасибо!

    27 марта 2020 г.: Мы открыты для высадки и выдачи только по предварительной записи. Пожалуйста, позвоните по номеру 541-647-2191, прежде чем посетить нас. Если у вас запланирована встреча с нами, чтобы забрать или забрать вас, вы знаете о наших общих обязанностях по адресу: Прочтите перед вашим визитом.Если в любое время у вас есть вопросы, пожалуйста, позвоните нам по телефону (541) 647-2191 или отправьте электронное письмо перед посещением или для записи на прием . Мы с нетерпением ждем встречи с вами.

    24 марта 2020 г.: Мы хотим опубликовать в Интернете нашу уже написанную политику социального дистанцирования.

    Прежде чем записаться на прием, ознакомьтесь с нашей Политикой социального и физического дистанцирования!

    Если у вас запланирована встреча с нами для доставки или встречи, вы знаете о наших общих обязанностях.Если в любое время у вас есть вопросы, пожалуйста, позвоните нам по телефону (541) 647-2191 или отправьте электронное письмо перед посещением или для записи на прием . Мы с нетерпением ждем встречи с вами.

    23 марта 2020 г. : По распоряжению губернатора Кейт Браун и исполнительному распоряжению № 20-12 художественные галереи могут оставаться открытыми, если они работают только по предварительной записи И имеют строгие и обязательные письменные правила «социального или физического дистанцирования». Если вы хотите посетить High Desert Frameworks, вы должны связаться с нами (541-647-2191 или написать нам по электронной почте — info (at) highdesertframeworks.com) и согласитесь с нашей письменной политикой до вашего визита. Нам разрешено продолжать предлагать доставку и сбор на обочине. Просто позвоните нам заранее (541-647-2191), и мы встретим вас у входной двери. Много парковочных мест. Если у вас есть остаток, причитающийся при получении, мы можем обработать платеж с помощью кредитной карты по телефону. Поскольку мы предлагаем услуги доставки, вы также можете заказать доставку по адресу: Доставка. Все сборы за доставку будут отменены для обрамления менее 250,00 долларов США. Если у вас есть какие-либо вопросы, пожалуйста, позвоните нам по телефону 541-647-2191.Спасибо и берегите себя — помните: мойте чертовы руки!

    23 марта 2020 г.: Сегодня, понедельник, 23 марта, мы открыты и ждем распоряжения губернатора Брауна. Работает с 10:00 до 17:30 — в обычном режиме. Мы будем информировать вас по мере изменения ситуации. Как было объявлено ранее, у нас есть доступные варианты доставки, включая высадку и получение на обочине, а также через наш фургон. Вопросы? Свяжитесь с нами по телефону 541-647-2191.

    21 марта 2020 г.: Сегодня мы объявили, что помимо наших обычных вариантов доставки мы предлагаем доставку и самовывоз на обочине.Просто позвоните нам заранее (541-647-2191), и мы встретим вас у входной двери. Много парковочных мест. Если у вас есть остаток, причитающийся при получении, мы можем обработать платеж с помощью кредитной карты по телефону. В нашем магазине мы продолжаем дезинфицировать точки соприкосновения после каждого визита клиента вместе со всеми нашими рабочими инструментами и не только. Берегите себя и мойте свои чертовы руки! Пожалуйста.

    21 марта 2020 г.: В это интересное и трудное время мы немного повеселились.Наш фотоконкурс «Из моих архивов» запущен и проводится с датой окончания 15 апреля 2020 г. (не волнуйтесь, налоговая дата перенесена на 15 июля). Вход бесплатный, и вы можете выиграть 1 из 4 замечательных призов. Чтобы принять участие или проголосовать за своего фаворита, посетите: www.Take.Pics. Расскажи другу, поделись публикацией и участвуй! Повеселитесь тогда…. Мойте свои чертовы руки! Пожалуйста.

    20 марта 2020 г.: Мы работаем в обычном режиме. Наши поставщики все еще отгружают, и мы все еще работаем. Поскольку мы являемся магазином с ограниченным контактом с общественностью, мы планируем оставаться открытыми и рекомендуемый процесс для обеспечения безопасной и чистой окружающей среды.С учетом сказанного, если у вас есть проекты по обрамлению или цифровой печати, мы можем реализовать их для вас. Воспользуйтесь нашими услугами по вывозу/доставке по мере необходимости или приезжайте. По любым вопросам звоните: 541-647-2191. Загрузите свои проекты цифровой печати на: Digital Printing. Мы продолжаем дезинфицировать точки соприкосновения в нашем магазине после каждого визита клиента вместе со всеми нашими рабочими инструментами и не только.

    17 марта 2020 г.: Мы объявляем, что плата за доставку не взимается для проектов на сумму более 250 долларов США. Услуги по вывозу и доставке и информацию можно найти по адресу: Pickup/Delivery.

    11 марта 2020 г.: Наш первоначальный пост и направление нашего плана совместной работы. Наш оригинальный пост можно найти по адресу: «Объятия, рукопожатия и «дай пять» — наши главные приоритеты…». Мы рекомендуем вам еще раз взглянуть на него.

    1979 Greco Japan GOB II 750 Электрическая бас-гитара со сквозным грифом Артикул


    Описание

    Здравствуйте, я продаю через eBay из Японии, поэтому я могу предоставить вам лучший сервис.

    Этот товар распродан по всей Японии и его очень трудно достать!!

    В порядке живой очереди.

    ◆ Косметическое состояние:

    Подробное состояние товара смотрите на фотографиях.

    1979 Греко Япония GOB II 750 через шею электрический бас

    Производитель: GRECO

    Model No: GOB II 750 Electric Bass

    Serial No: G 796659

    Год: 1979

    Сделано в 1979 году на основе серийного номера Greco Japan

    Цвет: Натуральный цвет ( Глянцевая древесная кожа)

    шея: прямо ( Номер влево))

    Truss Rod:

    Вес: 4254г

    Есть покраска, вмятины, ржавчины, царапины, пыль и чувство использования

    Чистка, полировка, регулировка каждой детали и замена струн прежним владельцем

    Сквозной гриф модель  с интегрированной конструкцией корпуса и грифа

    Нет шага за шеей, вибрация корпуса  вибрация  передается на шею, что выгодно для Sustain

    Тип пассивного управления:

    , 1 звукосниматель, 1 регулятор громкости, 1 регулятор тембра

    Небольшое уменьшение ладов, но все еще в прекрасном состоянии благодаря полировке (без дребезга) 12F 1струна около 2.0 мм

    Видны царапины и вмятины, но проблем с деталями нет

    С жестким футляром (без названия производителя, неизвестно, настоящий он или нет, но размер подходит для гитары без ощущения дребезжания, и шея покрыта плавающим наконечником)

    ◆ Рабочий статус:

    Нормальный

    ◆В комплекте

    Все, что вы можете увидеть в этом наборе фото будет включено в этот комплект.

    Вы можете наслаждаться воспроизведением музыки.

    ★ Этот продукт также доступен на других сайтах ЕС. Мы обновим его как можно скорее, но если этот продукт продается на другом сайте ЕС до того, как он будет продан на eBay, нам очень жаль, но мы отменим транзакцию. на этом сайте.

    ★ Я изучил товар(ы) и включил свои наблюдения как можно точнее в описание выше. Обратите внимание, что некоторые описания могут быть основаны на моем собственном мнении.Пожалуйста, внимательно прочитайте его и поймите состояние товара (ов) перед началом торгов.

    Оплата

    Пожалуйста, оплатите в течение 3 дней после закрытия аукциона.

    Доставка

    Доставка по всему миру из Токио. Для товаров с жесткими футлярами мы обычно упаковываем жесткий футляр и содержимое прокладочным материалом (обычно пузырчатой ​​пленкой). Проблем с этим способом доставки пока не было. Однако, если вы хотите, чтобы жесткий футляр был включен в картон, я могу отправить его этим способом, если вы доплатите 10 долларов.Это относится только к продуктам, которые изначально имеют жесткий футляр.

    этот товар отправляется в течение 1 рабочего дня после подтверждения оплаты.

    (воскресенье и праздничные дни нерабочие дни)

    Доставка со страховкой и номером грузоперевозки занимает 4-7 дней.

    * Мы не можем использовать службу EMS (Почта Японии) для некоторых стран Центральной Азии (Казахстан, Кыргызстан, Таджикистан и т. д.). Если ваш адрес доставки находится в этих регионах, пожалуйста, свяжитесь с нами перед началом торгов.

    Возврат

    Возврат принимается ТОЛЬКО в том случае, если товар не соответствует описанию.

    Международные покупатели — обратите внимание:

    * Импортные пошлины, налоги и сборы не включены в стоимость товара или стоимость доставки. Эти обязанности ответственность покупателей.
    * Пожалуйста, свяжитесь с таможней вашей страны, чтобы определить эти дополнительные расходы до торгов/покупки.
    * Эти расходы обычно взимаются транспортной (доставочной) компанией или когда вы забираете товар — не путайте их с дополнительными расходами на доставку.
    * Мы не маркируем товары ниже их стоимости и не помечаем товары как «подарки» — правила США и других стран запрещают такое поведение.

    Обратная связь:    Обратная связь очень важна для всех участников сообщества.
     Пожалуйста, оставьте отзыв, как только вы получите посылку, мы оставим то же самое для вас. Спасибо!
     Если что-то случилось, пожалуйста, свяжитесь с нами, прежде чем оставить отзыв, мы предложим вам удовлетворительный результат.
     Мы являемся серьезным продавцом и ответим как можно скорее.

    Дрожжевой биосенсор FRET освещает передачу сигналов цАМФ

    Abstract

    Сигнальный каскад цАМФ-PKA у почкующихся дрожжей регулирует адаптацию к изменяющимся условиям окружающей среды.Мы разработали yEPAC, биосенсор на основе FRET для измерения цАМФ в дрожжах. Мы использовали этот датчик с проточной цитометрией для высокопроизводительного количественного определения на уровне отдельных клеток во время динамических изменений в ответ на внезапные переходы питательных веществ. Мы обнаружили, что характерный пик цАМФ дифференцируется между различными переходами источника углерода и довольно гомогенен среди одиночных клеток, особенно для переходов на глюкозу. Пики опосредованы комбинацией внеклеточного восприятия и внутриклеточного метаболизма.Более того, пик цАМФ подчиняется закону Вебера; его высота зависит от относительного, а не абсолютного изменения уровня глюкозы. Наконец, наши результаты показывают, что высота пика цАМФ передает информацию о предполагаемых темпах роста. В заключение, наш датчик yEPAC открывает новые возможности для понимания физиологии дрожжей, передачи сигналов и метаболической адаптации.

    Введение

    Saccharomyces cerevisiae , или почкующиеся дрожжи, представляют собой одноклеточный организм, который живет в постоянно меняющихся условиях, к которым он должен адекватно адаптироваться, чтобы оставаться конкурентоспособным.Для этого дрожжевые клетки чувствуют изменения в доступности питательных веществ и генерируют сигналы, которые они используют в качестве сигналов для адаптации своего физиологического поведения, такого как клеточный метаболизм и рост. Для дрожжей наиболее предпочтительным источником углерода является глюкоза, и у них развились различные сигнальные пути, реагирующие на ее концентрацию 1–3 . Одним из таких путей является путь цАМФ-ПКА. Активация цАМФ-PKA происходит, когда дерепрессированные клетки перемещаются в среду, содержащую обильный источник ферментируемого углерода.Это приводит к временному повышению уровня цАМФ в короткие промежутки времени (т.е. секунды-минуты) и последующему расслаблению до повышенного устойчивого уровня 4,5 . Активация пути цАМФ-ПКА происходит двумя различными путями. Во-первых, импорт и метаболизм сбраживаемых сахаров активирует Ras, стимулируемый внутриклеточным закислением 4,6–15 . Ras, в свою очередь, активирует аденилатциклазу Cyr1 с образованием цАМФ. Во-вторых, рецептор Gpr1, связанный с G-белком, воспринимает внеклеточную глюкозу и активирует Cyr1 через Gpa2 (белок G α ) 4,6,10,16–23 .Повышенные уровни цАМФ приводят к активации PKA, вызывая диссоциацию регуляторной субъединицы Bcy1 от субъединиц PKA 24–26 . Активированный PKA ингибирует связанные со стрессом факторы транскрипции Msn2, Msn4 и протеинкиназу Rim15 27–30 . Более того, PKA индуцирует расщепление трегалозы и гликогена 31–33 и повышает уровни гликолитического активатора фруктозо-2,6-бифосфата 34–36 . В целом, активация пути цАМФ-PKA вызывает переход от медленного роста или стрессоустойчивого физиологического состояния к быстрорастущему ферментативному состоянию.

    Повышение уровня цАМФ носит временный характер из-за его быстрой деградации фосфодиэстеразами 1 и 2 37–39 . Более того, сам сигнальный каскад ингибируется за счет ингибирования по обратной связи через активную PKA (которая ингибирует различные компоненты передачи сигналов цАМФ). Кроме того, передача сигналов цАМФ ингибируется Ira1, Ira2 (который ингибирует Ras) и Rgs2 (который ингибирует Gpa2), и эти ингибирования также вызывают временный характер ответа 37,38,40–44 . Несколько исследований предполагают, что гликолитический промежуточный продукт фруктоза-1,6-бисфосфат является активатором Ras и определяет базовые уровни цАМФ 90–620 6,10,45 90–621 .

    Несмотря на значительный прогресс в области передачи сигналов цАМФ-ФКА у дрожжей, все еще остаются различные вопросы. По большей части характеристики были выполнены с использованием исключительно глюкозы (или фруктозы) в качестве ферментируемого источника углерода. Следовательно, ответы цАМФ на многие другие источники углерода или на стрессовые условия все еще в значительной степени не изучены. Это в основном связано с тем, что определение цАМФ с помощью обычных наборов для анализа является довольно трудоемким. Поскольку обычно изучается только несколько условий, характеристики ввода-вывода сигналов cAMP-PKA немногочисленны.Также до сих пор неизвестно, возникает ли гетерогенность в ответах цАМФ одиночных клеток; Межклеточная гетерогенность особенно актуальна для промышленной биотехнологии, где гетерогенность, сигнализирующая о глюкозе, может влиять на эффективность производства 46–49 .

    Чтобы ответить на эти вопросы, мы разработали генетически закодированный биосенсор для цАМФ. Мы адаптировали датчик FRET на основе EPAC, первоначально разработанный для клеток млекопитающих 50,51 , для использования в почкующихся дрожжах. Полученный датчик дрожжи-EPAC (yEPAC) содержит пару FRET, которая оптимальна для дрожжей, измеряет цАМФ с высокой селективностью и показывает сильное изменение отношения FRET.Это впервые дает возможность удобного внутриклеточного измерения цАМФ в живых одноклеточных дрожжах. Мы охарактеризовали ответы цАМФ на уровне отдельных клеток и в ответ на различные переходы питательных веществ. Кроме того, мы использовали проточную цитометрию для количественной оценки клеточной гетерогенности в динамике цАМФ во время переходов источника углерода. В совокупности полученные измерения цАМФ с помощью нового биосенсора выявили несколько новых идей, в том числе сильную зависимость высоты пика цАМФ от добавленного источника углерода и условий предварительного роста.Более того, использование yEPAC показало нам, что на фоне брожения амплитуда ответа цАМФ (высота пика) является мерой относительного изменения (т.е. кратности) концентрации глюкозы, а на дыхательном фоне высота пика при добавление сахара, по-видимому, предсказывает степень ферментативного роста.

    Материалы и методы

    Конструирование плазмид флуоресцентных белков

    Ранее были сконструированы FRET-пары mCherry-T2A-mTurquoise2 (mTq2), tagRFP-T2A-mTq2, tagRFPT-T2A-mTq2 и tdTomato-T2A-mTq2 в pDRF1-GW 52 .mCherry-mTq2, tagRFP-mTq2 и tagRFPT-mTq2 в векторе экспрессии C1 млекопитающих в стиле clontech были получены от Mastop et al. 53 , расщепленный с использованием NheI и NotI (New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, США) и лигированный лигазой T4 (New England Biolabs) в дрожжевом экспрессионном векторе pDRF1-GW 52 , расщепленный теми же рестрикционными ферментами.

    mTq2 в pDRF1-GW создавали путем проведения ПЦР с использованием KOD-полимеразы (Merck-Millipore, Burlington, Massachusetts, USA) на mTq2-C1 ​​с использованием прямого праймера 5′-AGGTCTATATAAGCAGAGC-3′ и обратного праймера 5′-TAGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG- 3′.Затем продукт и pDRF1-GW расщепляли с помощью NheI и NotI, и продукт ПЦР лигировали в pDRF1-GW с использованием лигазы Т4, генерируя mTq2 в pDRF1-GW.

    yEPAC конструкция

    mTq2Δ-Epac (CD,ΔDEP)-cp173Venus-cp173Venus (Epac-Sh288) был любезным подарком доктора. Кис Джалинк. ПЦР с KOD-полимеразой проводили на tdTomato-C1 с использованием прямого праймера 5’-TAGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’ и обратного праймера 5’-GCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’. Затем продукт ПЦР и Epac-Sh288 расщепляли с использованием SacI и NotI (New England Biolabs).Продукт ПЦР лигировали в Epac-Sh288 с использованием лигазы Т4, заменяя cp173Venus-cp173Venus на tdTomato. Адаптированный сенсор и pDRF1-GW расщепляли с использованием NheI и NotI, а сенсор лигировали в pDRF1-GW с образованием yEPAC (mTurquoise2Δ-Epac(CD,ΔDEP)-tdTomato в pDRF1-GW).

    Трансформация дрожжей

    Штаммы, использованные в этом исследовании, описаны в таблице 1. Эти штаммы были трансформированы точно так, как описано Gietz and Schiestl 54 .

    Характеристика in vitro

    Клетки W303-1A WT, трансформированные pDRF1-GW и yEPAC, выращивали в течение ночи при 200 об/мин и 30°C в 1x дрожжевой азотно-основной (YNB) среде без аминокислот (Sigma Aldrich, Stl.Louis, Миссури, США), содержащий 100 мМ глюкозы (Boom BV, Meppel, Нидерланды), 20 мг/л гемисульфата аденина (Sigma-Aldrich), 20 мг/л L-триптофана (Sigma-Aldrich), 20 мг/л л -гистидин (Sigma Aldrich) и 60 мг/л L-лейцина (SERVA Electrophoresis GmbH, Гейдельберг, Германия). На следующий день клетки разбавляли и выращивали до OD600 приблизительно 3 в 50 мл той же среды. Далее клетки выдерживали на льду и дважды промывали ледяным 20 мл 0,01 М буфера Kh3PO4/K2HPO4 при pH 7, содержащем 0,75 г/л ЭДТА (AppliChem GmbH, Дармштадт, Германия).После последней промывки клетки ресуспендировали в 2 мл 0,01 М буфера Kh3PO4/K2HPO4, содержащего 0,75 г/л ЭДТА. Клетки дважды промывали 1 мл охлажденного льдом 0,1 М буфера Kh3PO4/K2HPO4 при pH 7,4, содержащего 0,4 г/л MgCl2 (Sigma-Aldrich). Клетки переносили в пробирки с завинчивающимися крышками, предварительно заполненные 0,75 г стеклянных шариков (425-600 мкм), и лизировали с использованием FastPrep-24 5G (MP Biomedicals, Санта-Ана, Калифорния, США) с 8 импульсами со скоростью 6 м/с и 10 секунд на всплеск. После этого лизаты центрифугировали в течение 15 минут при 21000 g, а бесклеточные экстракты быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C для последующего использования.

    Для каждого образца 5 лунок черного 96-луночного микротитрационного планшета (Greiner Bio-One) заполняли 40 мкл бесклеточного экстракта. Спектры флуоресценции регистрировали после последовательных добавлений цАМФ (Sigma-Aldrich) с использованием планшетного ридера CLARIOstar (BMG labtech, Ортенберг, Германия). Спектры регистрировали при возбуждении 430/20 нм и испускании 460-660 нм (полоса пропускания 10 нм). Спектры флуоресценции корректировали с учетом фоновой флуоресценции (путем корректировки флуоресценции W303-1A WT, экспрессирующего пустую плазмиду pDRF1-GW), и отношения FRET рассчитывали путем деления флуоресценции донора на флуоресценцию акцептора.Данные соответствовали уравнению Хилла (уравнение 1) 51 , где цАМФ обозначает концентрацию цАМФ, K d — константу диссоциации, а n — коэффициент Хилла.

    Раствор ConA

    Конканавалин A (ConA) готовили, как описано Hansen et al., 2015 55 . Вкратце, 5 мг ConA (тип IV, Sigma Aldrich) растворяли в 5 мл PBS при pH 6,5, 40 мл H 2 O, 2,5 мл 1 M MnCl 2 и 2,5 мл 1 M CaCl 2. и хранили при -80°С.

    Микроскопия

    Штаммы, использованные в этом исследовании, описаны в таблице 1. Эти штаммы (экспрессирующие yEPAC) выращивали в течение ночи при 200 об/мин и 30°C в среде 1x YNB без аминокислот, содержащей 20 мг/л гемисульфата аденина, 20 мг /л L-триптофана, 20 мг/л L-гистидина, 60 мг/л L-лейцина и либо 1% этанола (об./об., VWR International, Рэднор, Пенсильвания, США), 1% глицерина (об./об. v, Sigma Aldrich), 100 мМ пирувата (Sigma Aldrich) или 111 мМ галактозы (Sigma Aldrich). Затем клетки разбавляли в той же среде и выращивали до максимальной OD600, равной 1.5 и с минимум 5 клеточными делениями. Культуры переносили на 6-луночный титрационный микропланшет, содержащий покровные стекла, предварительно обработанные ConA, для иммобилизации клеток. После этого покровное стекло помещали в камеру для клеток Attofluor (Thermofisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) и добавляли 1 мл свежей среды. Образцы визуализировали с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа Nikon Ti-eclipse (Nikon, Минато, Токио, Япония) при 30°C, оснащенного системой TuCam (Андор, Белфаст, Северная Ирландия), содержащей 2 Andor Zyla 5.5 камер sCMOS (Андор) и источник питания SOLA 6-LCR-SB (Lumencor, Beaverton, OR, USA). Флуоресцентные сигналы получали с использованием возбуждающего фильтра 438/24 нм. Излучение отделялось дихроичным фильтром с длинным проходом (LP) 552 нм в системе TuCam. Пара эмиссионных фильтров 483/32 нм и 593/40 нм использовалась для обнаружения эмиссии донора и акцептора соответственно (все фильтры от Semrock, Lake Forest, IL, USA). Возмущения выполняли, добавляя 1x среду YNB, содержащую те же аминокислоты, что и описанные ранее, с 10x концентрированным источником углерода или KCl в клеточную камеру до желаемой концентрации.Для каждого условия было получено не менее 2 биологических повторов. Клетки сегментировали и измеряли флуоресценцию с помощью собственного макроса FiJi (NIH, Bethesda, MD, USA).

    Таблица 1. штаммов S. cerevisiae , использованных в данной статье.

    Эксперименты по выращиванию

    Клетки, экспрессирующие pDRF1-GW и yEPAC, выращивали до середины, как описано для микроскопии, в среде, содержащей 1% этанола. Затем клетки промывали и ресуспендировали до OD600, равной 1, в той же среде, но без источника углерода.Клетки переносили до OD 0,05 в 48-луночный титрационный микропланшет, содержащий 480 мкл свежей среды либо с 0,1% этанола, либо с 10 мМ галактозы, либо с 10 мМ глюкозы. Клетки выращивали в планшет-ридере Clariostar при 30°C и орбитальном встряхивании со скоростью 700 об/мин. OD600 измеряли каждые 5 минут.

    Визуализация времени жизни флуоресценции и спектральная визуализация

    Клетки W303-1A WT, экспрессирующие mCherry-mTq2, mCherry-T2A-mTq2, tagRFP-mTq2, tagRFP-T2A-mTq2, tagRFPT-mTq2, tagRFPT-T2A-mTq2, tdTomato-mTq2 и tdTomato-T2A-mTq2 выращивали в течение не менее 2 недель на чашках с 2% агарозы, содержащих 6.8 г/л YNB без аминокислот, 100 мМ глюкозы, 20 мг/л гемисульфата аденина, 20 мг/л L-триптофана, 20 мг/л L-гистидина и 60 мг/л L-лейцина. FLIM в частотной области выполнялся, как описано ранее 53 . Вкратце, 18 фазовых изображений были получены с помощью усилителя изображения с радиочастотной модуляцией (Lambert Instruments II18MD, Гронинген, Нидерланды), настроенного на частоту 75,1 МГц, соединенного с ПЗС-камерой (Photometrics HQ, Тусон, Аризона, США) в качестве детектора. mTq2 возбуждали с помощью лазерного диода с прямой модуляцией 442 нм (PicoQuant, Берлин, Германия).Излучение регистрировали с помощью фильтра 480/40 нм. Времена жизни рассчитывались на основе фазового сдвига излучаемого света (τϕ). Для каждого образца регистрировали по 3 повторности.

    Спектры излучения донорно-акцепторного слитого белка или неслитых эквимолярных экспрессированных донора и акцептора получали, как описано ранее 53 . Вкратце, возбуждение осуществлялось при 436/20 нм, а излучение проходило через дихроичное зеркало 80/20 (пропускание/отражение) и LP-фильтр 460 нм. Индивидуальные спектры корректировали по уровню экспрессии путем количественного определения интенсивности акцептора путем возбуждения при 546/10 нм и обнаружения с помощью LP-фильтра при 590 нм.Для каждого образца было измерено 3 повторения.

    Проточная цитометрия

    Штаммы W303-1A, экспрессирующие yEPAC, pDRF1-GW и mTq2, выращивали, как описано для микроскопии. Проточную цитометрию выполняли с использованием сортировщика клеток BD INFLUX (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) с соплом 140 мкм и давлением оболочки 6 фунтов на кв. дюйм для обработки образцов. Сортировщик был оснащен твердотельным лазером мощностью 200 мВт с длиной волны 488 нм, сфокусированным на отверстии 1, и твердотельным лазером мощностью 75 мВт с длиной волны 561 нм, сфокусированным на отверстии 3, с лазерной задержкой 18.17 мкс и твердотельный лазер мощностью 100 мВт с длиной волны 445 нм, сфокусированный на точечном отверстии 5 с лазерной задержкой 37,11 мкс. ФЭУ (фотоумножители) для лазера с длиной волны 445 нм и лазера с длиной волны 488 нм были ассимилированы в массивах тригональных детекторов, которые используют последовательные отражения света — переходя от самых длинных длин волн к самым коротким — чтобы сначала собрать самые тусклые сигналы излучения. Тригональная матрица 445 нм была сконфигурирована с полосовым фильтром 610/20 нм в детекторе А и полосовым фильтром 520/35 нм (предшествующим фильтром LP 502 нм) в детекторе В.Тригональная матрица 488 была сконфигурирована с полосой пропускания 610/20 нм (предшествующей 600LP) в детекторе A, полосой пропускания 530/40 нм (предшествующей LP 520) в детекторе B и полосой пропускания 488/10 в детекторе C (SSC). ). ФЭУ для лазера 561 были ассимилированы в восьмиугольной детекторной матрице. Излучение акцептора измеряли в детекторе D, который был отфильтрован с полосой пропускания 610/20 (предшествовал фильтр 600LP). Для каждого условия было получено не менее 2 биологических повторов. Все события были скорректированы с учетом фоновой флуоресценции (средняя флуоресценция клеток, экспрессирующих pDRF1-GW), с поправкой на просачивание (средняя флуоресценция клеток, экспрессирующих mTq2 только в акцепторном канале) и отфильтрованы для насыщения или низких значений флуоресценции и рассеяния.Влияние экспрессии сенсора на коэффициенты FRET рассчитывали путем построения графика соотношений FRET в зависимости от экспрессии tdTomato, полученных с помощью лазера с длиной волны 561 нм и полосового фильтра 610/20 нм.

    Чувствительность к рН

    Клетки, экспрессирующие yEPAC-R279L и mVenus-mTq2, выращивали до ОП 600 максимум 1,5 в среде YNB, содержащей 100 мМ глюкозы. Клетки промывали 3 раза и ресуспендировали в буфере Citric Acid/Na 2 HPO 4 при различных pH, содержащем 2 мМ ионофора 2,4-динитрофенола, для уравновешивания уровней pH.После этого отношения FRET регистрировали с использованием широкопольного микроскопа, как описано выше.

    Анализ данных

    Все данные были проанализированы и визуализированы с использованием R версии 3.5.1 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия). Для анализа подвижные и мертвые клетки удаляли вручную. Кроме того, были исключены клетки с низкой флуоресценцией (т.е. ниже 50 единиц флуоресценции). Затем флуоресценция акцептора была скорректирована на просадку (12% от общей флуоресценции донора), а коэффициенты FRET были нормализованы к среднему коэффициенту FRET до возмущения (базовый уровень).Кинетику доза-реакция согласовывали с использованием уравнения 2, где Peak max обозначает максимальную высоту пика, которая может быть получена, глюкоза представляет собой количество введенной глюкозы, а K 0,5 представляет собой количество глюкозы, вызывающее половину максимальной высоты пика.

    Результаты

    Разработка универсального сенсора EPAC для количественного определения цАМФ в дрожжах

    В дрожжах постоянное измерение уровней цАМФ в живых одиночных клетках по-прежнему представляет собой проблему, так как отсутствует заслуживающий похвалы сенсор цАМФ FRET для дрожжей, а текущий стандарт Определение цАМФ по-прежнему основывается на усредненном по популяции определении цАМФ с использованием клеточных экстрактов в отдельные моменты времени.Поэтому мы взяли оптимизированный для млекопитающих датчик EPAC 56 и заменили тандемный акцептор cp173Venus на tdTomato, поскольку этот флуоресцентный белок оказался лучшим акцептором в дрожжах с приемлемым созреванием, более высокой фотостабильностью, яркостью и устойчивостью к pH по сравнению с Венера (рис. S1) 52,57 . Кроме того, tdTomato является хорошим акцептором для mTq2 с эффективностью FRET 23%, значительной сенсибилизированной эмиссией и отсутствием влияния уровней экспрессии на коэффициенты FRET (рис.S1, таблица S1), что делает его очень подходящим для логометрических измерений флуоресценции. Мы назвали этот датчик yEPAC.

    Калибровка yEPAC in vitro показала потерю FRET при добавлении цАМФ, поэтому в этой статье отношения FRET представлены как отношения CFP/RFP. Мы определили, что yEPAC имеет K D 4 мкМ для цАМФ, что немного ниже по сравнению с исходным датчиком (рис. 1А) и находится в диапазоне физиологических уровней цАМФ у дрожжей 37,58–60 . Мы провели различные контрольные эксперименты, чтобы охарактеризовать производительность и потенциал yEPAC.Мы подтвердили, что добавление глюкозы к клеткам, выращенным на неферментируемом источнике углерода, действительно давало переходный пик цАМФ до исходных нормализованных значений FRET 1,7 (рис. 1В). Кроме того, мутация Cyr1 K1876M и введение R279L в de cAMP-связывающий домен показали значительное уменьшение ответа cAMP (Fig. 1B), как и ожидалось 61,62 . Небольшой отклик варианта сенсора R279L, вероятно, вызван осмотическими изменениями, так как добавление неметаболизируемого сахарного сорбита дало идентичный отклик этого сенсора (рис.С1Д). Важно отметить, что датчик yEPAC не влиял на рост при различных источниках углерода (рис. S2). Однако, наоборот, мы обнаружили небольшое влияние скорости роста на уровни FRET датчика (рис. S3). Это делает датчик менее подходящим для сравнения базальных уровней цАМФ при различных скоростях роста. Датчик имел улучшенное временное разрешение по сравнению с обычно используемыми наборами для анализа цАМФ, поскольку мы могли регистрировать ответы цАМФ до 15 минут с 3-секундным интервалом времени (рис. 1С, фильм S1).

    Рис. 1.

    yEPAC характеристика. A) In vitro кривая доза-реакция цАМФ для yEPAC. Точки указывают среднее значение FRET для 5 повторов, планки погрешностей указывают стандартное отклонение. Сплошная линия показывает подгонку Хилла (уравнение 1). B) Клетки W303-1A WT, экспрессирующие yEPAC, или невосприимчивые клетки yEPAC-R279L и W303-1A, обладающие мутацией Cyr1 K1876M , выращивали на 1% EtOH или 1% глицерина и пульсировали глюкозой при t=0 минут. Были получены сигналы FRET и нормализована базовая линия, линии показывают средние отношения FRET, заштрихованные области обозначают стандартное отклонение.C) Клетки W303-1A, выращенные в пирувате, подвергались импульсному воздействию 100 мМ глюкозы при t=0 минут. На врезке показаны первые 3 минуты после импульса. Отношения FRET нормализованы к исходному уровню, сплошные линии показывают средние отношения FRET, пунктирные линии показывают средние отношения FRET, серые линии показывают траектории одиночных клеток, заштрихованные области обозначают SD. D) Динамическое частотное распределение значений FRET после добавления 2 и 100 мМ глюкозы соответственно. Клетки W303-1A WT предварительно выращивали на 1% EtOH, регистрировали базовый уровень (не показано на графике) и добавляли пульс глюкозы в 0 секунд.Точки времени группировались каждые 5 секунд. Проценты даны по объему, сокращения: EtOH, этанол, и Соотношения FRET были нормализованы по базовой линии.

    yEPAC также можно использовать в проточной цитометрии, которая представляет собой полезное дополнение к микроскопии, поскольку позволяет брать образцы от сотен до тысяч одиночных клеток в секунду. Однако этот метод не может измерять FRET в одних и тех же клетках с течением времени. Мы протестировали этот метод с добавлением 2 или 100 мМ глюкозы к выращенным в этаноле клеткам (рис. 1D). Мы получили отношения FRET 300-700 клеток в секунду, чтобы определить ответы цАМФ.Динамика была сопоставима с данными микроскопии (рис. 1D и S4). Следует отметить, что мы не наблюдали неответчиков, в том числе и при добавлении 2 мМ глюкозы.

    Таким образом, разработанный нами датчик yEPAC можно использовать для надежного измерения цАМФ в отдельных клетках дрожжей без побочных эффектов. Кроме того, мы показываем, что наш датчик можно использовать с проточной цитометрией в дополнение к обычным показаниям микроскопии, расширяя его возможности.

    Высоты пиков цАМФ подчиняются закону Вебера-Фехнера

    После использования насыщающих количеств глюкозы (рис.1B, C и D), мы изучили, как уровни цАМФ изменятся в ответ на более низкие количества глюкозы. Мы воздействовали на выращенные в этаноле клетки W303-1A с глюкозой в диапазоне от 0 до 50 мМ. Нормализованные высоты пиков этих переходов показали насыщающую дозозависимую реакцию с K 0,5 3,0 мМ и максимальной высотой пика 1,38 нормированных значений FRET (фиг. 2А).

    Рисунок 2.

    Эксперименты по доза-реакция и закон Вебера-Фехнера для цАМФ. A) Клетки W303-1A, экспрессирующие yEPAC, выращивали на 1% этаноле, и им пульсировали различные концентрации глюкозы.Сопоставление высоты пиков с концентрацией глюкозы показывает кинетику насыщения с K 0,5 3,0 мМ. Точки указывают среднее значение, планки погрешностей указывают стандартное отклонение, серая линия показывает соответствие с использованием уравнения. 2. B) Клетки W303-1A, экспрессирующие yEPAC, предварительно инкубировали при 5 или 10 мМ глюкозы и проводили 2,9-кратную замену глюкозы. Линии показывают средний ответ, заштрихованные области обозначают стандартное отклонение. C) Клетки W303-1A, экспрессирующие yEPAC, выращивали на 1% EtOH и добавляли либо 100 мМ глюкозы, либо 100 мМ глюкозы с 250 мМ KCl.Линии показывают средние ответы, заштрихованные области обозначают стандартное отклонение. D) Популяционный ответ цАМФ клеток, экспрессирующих yEPAC. Клетки инкубировали при различных начальных количествах глюкозы (изображенных под каждым графиком) и добавляли различные количества глюкозы (изображенные над каждым графиком). Точки показывают средний ответ популяции, планки погрешностей указывают стандартное отклонение. E) Высоты пиков нанесены на график в зависимости от логарифмической кратности различных переходов уровня глюкозы, точки указывают среднее значение, планки погрешностей указывают стандартное отклонение. F) Высоты пиков нанесены на график относительно абсолютной глюкозы, добавленной для переходов, точки указывают среднее значение, планки погрешностей указывают стандартное отклонение.

    Данные доза-реакция были получены на фоне нулевого уровня глюкозы и показали, что дрожжевые клетки способны обнаруживать небольшие количества глюкозы. Однако мы предположили, что любые преимущества, которые клетки могут получить, реагируя на изменение доступности сахара, будут в значительной степени зависеть от количества сахара, уже присутствующего в окружающей среде (т. е. фонового уровня). Это означает, что клетка должна реагировать на небольшие изменения уровня глюкозы, когда уровень глюкозы низкий, но должна быть менее чувствительна к таким же (абсолютным) изменениям, когда уровень глюкозы уже высок.Поэтому мы проверили, соответствует ли величина индуцированной глюкозой высоты пика цАМФ относительному изменению (то есть кратному изменению) концентрации глюкозы вместо абсолютного изменения, , т.е. , подчиняется ли оно закону Вебера-Фехнера 63 . Мы инкубировали клетки в средах с различной фоновой концентрацией глюкозы с последующим добавлением различных количеств глюкозы (рис. 2Б, Г, Д, Е). Действительно, мы обнаружили сравнимые ответы между переходами с одним и тем же относительным изменением, но с разным абсолютным количеством пульсирующей глюкозы (рис.2Б). Поскольку системы, обнаруживающие относительные изменения, суммируют входные данные с положительными и отрицательными ответами 64 , мы также протестировали одновременное применение двух таких входных данных. Во-первых, мы идентифицировали солевой стресс как отрицательный фактор, поскольку он временно снижал уровни цАМФ (рис. S5). Действительно, добавление к клеткам солевого стресса снижает высоту пика, индуцированного глюкозой (рис. 2С), что указывает на то, что высота пика цАМФ может измерять относительные изменения глюкозы. Нормализованная высота пиков уменьшалась с увеличением количества предварительно инкубированной глюкозы, что показывает, что клетки действительно изменяют высоту пиков цАМФ в зависимости от их фонового уровня (т.е. уровень глюкозы до инкубации). Более того, нормализованные высоты пиков лучше соотносятся с кратным изменением уровня глюкозы, чем с абсолютным изменением уровня глюкозы (рис. 2E и 2F).

    Затем мы проверили, вызывает ли фиксированный импульс кратности изменения уровня глюкозы, примененный последовательно к одной и той же популяции, сходную пиковую реакцию (рис. 3). Действительно, мы обнаружили, что и в этом случае нормализованная по исходному уровню высота пика масштабируется с относительным изменением уровня глюкозы, а не с абсолютным количеством. (рис. 3А, Б). Для отдельных ячеек мы обнаружили лишь слабую корреляцию между нормализованными высотами пиков первого и второго возмущений.(рис. 3С). Это указывает на то, что на уровне одной клетки относительное изменение довольно зашумлено, где реакция популяции устойчива. Однако увеличение времени между изменениями кратности может улучшить обнаружение закона Вебера-Фехнера на уровне одной клетки. В соответствии с этим мы обнаружили, что возмущения в течение более короткого промежутка времени (т.е. каждые 10 минут) показали ухудшение реакции по закону Вебера-Фехнера (рис. S6). В этих переходах клетки в значительной степени теряют способность обнаруживать относительные изменения уровня глюкозы. Это говорит о том, что минимальные временные масштабы, в которых клетки могут адаптировать свой порог глюкозы, составляют порядка 20-30 минут, и, следовательно, механизм, вероятно, включает изменения в экспрессии белка.

    Рис. 3.

    Закон Вебера-Фехнера для тех же ячеек во времени. A) Клетки W303-1A, экспрессирующие yEPAC, предварительно инкубировали с 2 мМ глюкозой. После этого клетки переводили на 4 мМ глюкозы при t=0 минут и снова переводили на 8 мМ при t=25 минут, что каждый раз приводило к двукратному изменению. Сплошная линия показывает средний ответ популяции, пунктирная линия показывает средний ответ, нормализованный к первым 5 минутам. Б) Ответы переходов, выполненных на графике А, нормализованные к последним 3 кадрам перед каждым переходом.Сплошная линия показывает средний ответ популяции, пунктирная линия показывает средний ответ. Цвет указывает на переход. C) Отношение нормализованных высот пиков одиночных ячеек между первым и вторым переходами. Заштрихованные области указывают SD. Точки представляют одиночные клетки, значение r показывает коэффициент корреляции Спирмена (p <0,01).

    В заключение мы показываем, что ответы цАМФ чувствительны к изменениям уровня глюкозы, когда клетки находятся в среде с низким содержанием глюкозы. В среде с высоким содержанием глюкозы ответы цАМФ масштабируются, делая реакцию цАМФ относительно текущего уровня глюкозы, в котором находятся клетки.

    Ответы цАМФ зависят от перехода от источника углерода

    Сигнальный каскад цАМФ хорошо известен и характеризуется переходами от неферментируемых источников углерода к глюкозе. Однако для других переходов доступно меньше данных. Поэтому мы количественно оценили реакцию цАМФ на переходы между различными источниками углерода. Клетки W303-1A WT выращивали в среде, содержащей 1% этанола (об./об.), 1% глицерина (об./об.), 100 мМ пирувата или 111 мМ галактозы, а затем обрабатывали насыщающими количествами глюкозы, фруктозы, галактозы, маннозы. или различные олигосахариды.Это привело к 18 различным переходам, для которых отслеживали уровни цАМФ (рис. 4).

    Рисунок 4.

    yEPAC FRET-отклики различных углеродных переходов. A) Клетки, растущие на различных неферментативных источниках углерода (обозначенных над каждым графиком), обрабатывали различными сахарами, обозначенными цветом линии, в 0 минут. Линии показывают средние отношения FRET, нормализованные к исходному уровню, заштрихованные области обозначают стандартное отклонение. B) Клетки, растущие на 1% этаноле, обрабатывали различными ди- или трисахаридами и регистрировали ответы FRET.Линии показывают средние отношения FRET, нормализованные к базовому уровню, заштрихованные области указывают SD, сахар добавляли при t=0 минут. C) Высота пиков переходов, показанных на рисунках A и B, в зависимости от максимальной скорости роста, которая может быть получена с добавленными источниками углерода. Точки показывают среднее значение популяции, планки погрешностей указывают стандартное отклонение, пунктирная линия показывает кривую, зависящую от глюкозы (полученную путем построения кинетики доза-эффект в зависимости от кинетики Монода).

    Среди добавленных сахаров только сахароза, глюкоза и фруктоза индуцировали четкие пики цАМФ.Добавление сахарозы давало самый высокий пик, а фруктозы — самый низкий. Клетки, обработанные галактозой или маннозой, не показывали пика цАМФ. Манноза известна как антагонист Gpr1 22,23 , а галактоза не является активатором Gpr1, что предполагает, что Gpr1 регулирует высоту пика цАМФ. Примечательно наблюдение, что клетки, подвергнутые импульсному воздействию маннозы, показали повышение уровня цАМФ через 15 минут, даже несмотря на то, что первоначальный пиковый ответ отсутствовал. Динамика цАМФ также зависела от условий перед ростом: клетки, выращенные на глицерине и пирувате, давали значительно более высокие пики цАМФ по сравнению с клетками, выращенными на этаноле и галактозе (критерий Уилкоксона, p<0.01). В соответствии с результатами динамического потока-FRET мы не наблюдали субпопуляций или неответчиков в большинстве переходов (рис. S7 и S8). Иногда мы обнаружили, что для других сахаров, кроме глюкозы, некоторые клетки демонстрировали отклоненную динамику цАМФ по сравнению с ответом популяции. Эти клетки не показывают пика цАМФ или постоянно увеличивают уровни цАМФ на протяжении всей цейтраферной записи. Следовательно, передача сигналов цАМФ кажется очень надежной для переходов глюкозы, но менее надежной для других сахаров.

    Переход от одного основного источника углерода к другому может изменить максимально достижимую скорость роста клеток.Мы задались вопросом, могут ли высоты пиков цАМФ содержать информацию об этой новой потенциальной скорости роста. Рисунок 4C действительно предполагает такое соотношение: все данные кажутся лежащими на кривой. Эта кривая очень хорошо согласуется с зависимой от глюкозы кривой, полученной, когда кинетика реакции на дозу на рисунке 2А (максимальная высота пика 1,38 и K 0,5 = 3,0 мМ) построена в зависимости от скорости роста, полученной из опубликованной кинетики Моно с максимальной скоростью роста. 0,37 ч -1 и Ks 0,1 мМ 65 .Обратите внимание, что высота пика цАМФ показывает резкое увеличение, когда может быть достигнута скорость роста выше 0,3 ч -1 , что примерно соответствует началу избыточного метаболизма 66 .

    Таким образом, наши результаты показывают, что динамика цАМФ зависит от контекста и что, по крайней мере, для протестированных здесь переходов от EtOH к сахарам, высота пика соответствует скорости роста, которая может быть достигнута в новой среде.

    Динамика цАМФ зависит как от передачи сигналов Gpr1, так и от метаболизма сахара

    Наконец, мы исследовали, какие компоненты сигнального каскада влияют на пик цАМФ во время переходов.Сигнальные мутанты цАМФ выращивали на среде, содержащей 1% EtOH, и пульсировали 2% глюкозой (фиг. 5). Делеция либо Gpr1, либо всех трех ферментов, фосфорилирующих глюкозу (hxk1Δ, hxk2Δ, glk1Δ тройной мутант), либо мутация в Cyr1 (Cyr1 K1876M ) влияли на переходный пик цАМФ. Примечательно, что мутант hxk1Δ, hxk2Δ, glk1Δ по-прежнему демонстрировал четкий пик цАМФ (хотя и уменьшенный по сравнению с WT). Этот мутант не проявляет транзиторного внутриклеточного подкисления при добавлении глюкозы (поскольку глюкоза не может метаболизироваться), что указывает на то, что генерация пика цАМФ зависит не только от подкисления или метаболизма в этом отношении.Удаление другого входа через связанный с мембраной Gpr1-сенсор имело аналогичный эффект на ответ пика цАМФ. Поскольку известно, что эти две ветви регулируют ответы цАМФ, мы предполагаем, что остаточный ответ цАМФ для обоих мутантов вызван другой ветвью передачи сигналов цАМФ, которая все еще функционирует.

    Рисунок 5.

    yEPAC FRET-ответы различных сигнальных мутантов. Различные сигнальные мутанты цАМФ на фоне W303-1A подвергались импульсному воздействию 100 мМ глюкозы в 0 минут. Линии показывают средние отношения FRET, нормализованные к исходному уровню, заштрихованные области обозначают стандартное отклонение.

    Обсуждение

    Мы представляем биосенсор на основе FRET для динамического обнаружения цАМФ в одиночных клетках дрожжей. Хотя недавно был опубликован другой биосенсор cAMP EPAC на основе FRET для почкующихся дрожжей 67,68 , мы считаем, что наш yEPAC имеет значительные улучшения. Он показывает высокий диапазон FRET, вплоть до нормированного изменения отношения 1,7 (рис. 1B). Кроме того, анализы роста показывают, что датчик не оказывает неблагоприятного воздействия на физиологию дрожжей (рис. S2). Небольшая разница в аффинности цАМФ yEPAC по сравнению с исходным сенсором может быть вызвана другим используемым акцептором, возможным незначительным изменением конформации сенсора или различиями в характеристиках, таких как виды-хозяева и используемые буферы.Сигнальные мутанты и невосприимчивый вариант yEPAC показали хорошую селективность сенсора в отношении цАМФ. Однако мы обнаружили небольшое смещение базовых уровней FRET yEPAC-R279L при различных скоростях роста (рис. S3). Происхождение этого отклонения в настоящее время неизвестно и подлежит будущим исследованиям и усовершенствованию датчиков. Полученные данные проточной цитометрии дали высокое временное разрешение по сравнению с обычными анализами цАМФ. Эти результаты показали четкий вторичный пик (рис. S4) при высоких концентрациях глюкозы.Этот пик также присутствовал (например, на рис. 4А), но не всегда наблюдался в наборе данных микроскопии. Это колебательное поведение соответствует предсказаниям, полученным в результате моделирования, но в данном исследовании более подробно не изучалось 69 .

    Следует отметить, что ни проточная цитометрия, ни микроскопия не выявили явных неответчиков на переходы глюкозы (рис. S7 и S8). Однако мы наблюдали некоторую гетерогенность переходов с сахарами, не активирующими Gpr1 23 . Поэтому мы предполагаем, что эта гетерогенность возникает из-за вариаций в метаболизме сахара, как это наблюдалось ранее при переходах от источника углерода 57,70 .Эти результаты показывают, что сигнальный каскад цАМФ является надежным, в отличие от того, что было обнаружено для pH 70 , а недавно также для внутриклеточной динамики АТФ 57 . По-видимому, как показано ранее 71 , передача сигналов глюкозы или ее метаболизм представляют собой разные задачи для дрожжевых клеток.

    В природе дрожжевые клетки, вероятно, сталкиваются со значительными колебаниями доступности глюкозы, начиная от полного отсутствия и заканчивая насыщающим количеством глюкозы. До сих пор было неизвестно, как сигнальный путь цАМФ реагирует на повышение уровня глюкозы, когда глюкоза уже присутствует в окружающей среде.Мы проверили эти переходы и обнаружили, что высота пика цАМФ, по-видимому, измеряет изменения уровня глюкозы относительно фонового уровня глюкозы, свойство, известное как закон Вебера-Фехнера. Наш анализ для проверки закона Вебера-Фехнера предполагает, что каждая ячейка выполняет базовую нормализацию. Это может дать дополнительные преимущества за счет снижения изменчивости среди клеток 64,72–74 . Однако клеткам нужно время, чтобы установить базовый уровень между последовательными добавлениями глюкозы, поскольку сокращение периода между добавлениями глюкозы больше не давало масштабирования высоты пика цАМФ с относительным кратным изменением (рис.С6).

    Для надежного тестирования закона Вебера-Фехнера уровни цАМФ должны быть ниже значений насыщения датчика yEPAC. Мы подтвердили это, сравнив нормализованную высоту пиков в ответ на количество насыщающей глюкозы (т.е. 50 мМ глюкозы), когда клетки предварительно инкубировали при 2, 5, 10 и 20 мМ глюкозы (рис. 2D). Нормализованные высоты пиков были сопоставимы, что указывает на то, что уровни цАМФ еще не насыщают сенсор. Кроме того, предварительная инкубация с глюкозой от 2 до 20 мМ не оказывала неспецифического воздействия на датчик yEPAC, поскольку yEPAC-R279L почти не проявляет никакой реакции после импульсной обработки 100 мМ глюкозы (рис.S9), что как минимум в 5 раз больше, чем используется для характеристики закона Вебера-Фехнера. Таким образом, наши данные показывают, что путь цАМФ в дрожжевых клетках может обнаруживать (и адаптироваться) к небольшим добавлениям глюкозы, когда уровни глюкозы были низкими, но не сигнализирует об этом изменении, когда уровни глюкозы уже высоки. Когда клетки уже полностью ферментированы, растут на глюкозе, пик не может указывать на увеличение скорости роста, а скорее может сигнализировать о том, сколько сахара присутствует и должны ли клетки продолжать инвестировать в ферментацию и биосинтез рибосом.

    Ситуация изменилась, когда мы добавили различные источники углерода к полностью дышащим клеткам, предварительно выращенным на этаноле. На этом фоне была обнаружена устойчивая связь между высотой пика и ожидаемой скоростью роста на импульсном сахаре для различных сахаров, и она соответствовала прогнозируемой скорости роста для различных концентраций глюкозы на основе кинетики роста Моно. Это говорит о том, что высота пика информирует о росте. Обычно считается, что сигнальный каскад цАМФ опосредует переключение на ферментативный (т.е. высокая скорость роста) режим. Это согласуется с нашими данными, согласно которым высота пика цАМФ резко возрастает в начале ферментации, , т.е. , в условиях, которые обеспечивают скорость роста выше 0,3 ч -1 , рис. 4C). Тем не менее, наши результаты также показывают, что клетки без четкого пика цАМФ (например, клетки с импульсным введением маннозы) по-прежнему имеют высокую скорость роста, не демонстрируя временного пика цАМФ. Также промышленно важный штамм CEN.PK, который имеет мутацию K1876M в Cyr1 61 , не показывает пика, но ферментирует.Таким образом, хотя мы находим четкие и интересные взаимосвязи, их функциональное значение еще предстоит полностью выяснить.

    Ответы цАМФ на различные другие переходы сахаров и у сигнальных мутантов показывают, что динамика цАМФ является сложной и сильно зависит от контекста. Из этих данных мы могли бы сделать вывод о нескольких особенностях передачи сигналов цАМФ.

    Сначала были испытаны девять сахаров, и только сахароза (дающая самый высокий пик) и продукты ее распада, глюкоза и фруктоза индуцировали пик цАМФ.Примечательно, что дрожжи выработали сигнальный каскад только для этих сахаров. С другой стороны, сахароза часто является конечным продуктом фотосинтеза растений и, следовательно, одним из наиболее распространенных сахаров в растениях 75 . В природе дрожжи обитают на растениях или фруктах, и потребление внеклеточной сахарозы, вероятно, улучшает приспособленность дрожжей.

    Во-вторых, данные показывают, что пик цАМФ возникает, когда либо начальный метаболизм сахара достаточно быстрый, либо активируется Gpr1.Комбинированная активация необходима для достижения максимального пикового отклика. Мы обнаружили, что фруктоза не взаимодействует с Gpr1, но индуцирует пик цАМФ. В случае фруктозы пик ниже пиков, индуцированных агонистами Gpr1 сахарозой или глюкозой, что указывает на усиливающий эффект комбинированной активации.

    В отличие от пиковых реакций, вызванных сахарозой, глюкозой и фруктозой, манноза, которая является антагонистом Gpr1, не показывает никакого пика цАМФ. Одним из объяснений отсутствия пика является ослабление сигнала за счет ингибирования Gpr1.Другое объяснение заключается в том, что манноза транспортируется гораздо медленнее, поскольку переносчики гексозы имеют более низкий V max и более высокий K m для маннозы по сравнению с глюкозой и фруктозой, что, вероятно, снижает начальную скорость поглощения маннозы 76,77 . Тем не менее, мы обнаружили, что манноза вызывает постепенное увеличение уровней цАМФ вскоре после ее добавления, что может указывать на активацию Ras посредством увеличения потока гликолиза 45 . Соответственно, добавление галактозы, которая не взаимодействует с Gpr1 и не считается быстро ферментируемым источником углерода, не вызывает пика цАМФ и еще не демонстрирует признаков постепенного увеличения уровней цАМФ вскоре после ее добавления.Действительно, клетки, растущие на этаноле или глицерине, не сразу готовы метаболизировать галактозу 78 , и мы ожидаем, что уровни цАМФ будут постепенно повышаться при индукции метаболизма галактозы. Дифференциальный ответ на маннозу клеток, выращенных на галактозе или этаноле, еще больше подчеркивает влияние условий, предшествующих росту, на способность клеток ощущать внезапные переходы сахара и реагировать на них. Манноза не показала постепенного увеличения уровней цАМФ в клетках, выращенных на галактозе, как в клетках, выращенных в этаноле.Рост галактозы подавляет экспрессию различных высокоаффинных переносчиков гексозы, таких как HXT6 и 7, по сравнению с ростом на этаноле или глицерине 79–81 . Поэтому ожидается, что скорость поглощения маннозы в клетках, выращенных на галактозе, будет намного ниже, чем в клетках, выращенных на этаноле или глицерине, что может объяснить эти наблюдения. Реакция добавления глюкозы и фруктозы к клеткам, выращенным на галактозе, ожидается, поскольку клетки, выращенные на галактозе, обладают более высокой способностью метаболизировать эти сахара, что вызывает 7,57,77,82,83 .Наконец, мы подтверждаем, что пики цАМФ явно происходят частично как от метаболизма сахара, так и от рецептора Gpr1, как описано ранее 18,22,84 . В соответствии с предыдущими исследованиями, наши данные показывают, что внутриклеточное подкисление не является обязательным, поскольку hxk1Δ, hxk2Δ, glk1Δ не обнаруживают внутриклеточного подкисления (из-за отсутствия фосфорилирования сахаров) и все еще демонстрируют продукцию цАМФ 6,15,84 .

    В целом, yEPAC впервые позволил нам исследовать динамику цАМФ в одиночных клетках и удобно объяснить различные отношения входа-выхода во время различных переходов от источника углерода.Это дало важные новые сведения: нормализованная высота пика, по-видимому, является сигналом для будущей скорости роста импульсного сахара и возникает только тогда, когда клетки должны переключиться на ферментативный рост. Возможно, высота пика служит переключателем для переключения на ферментативный метаболизм.

    Конкурирующие интересы

    Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

    Запросы материалов

    Запросы на датчик yEPAC следует направлять Кесу Джалинку (Отдел клеточной биологии, Нидерландский институт рака, Plesmanlaan 121, 1066CX Amsterdam, Нидерланды, электронная почта k.jalink{at}nki.nl). Другие запросы на материалы следует направлять Басу Теусинку (электронная почта: b.teusink{at}vu.nl)

    Supplements

    Movie S1. Ратиометрический фильм клеток W303-1A WT, экспрессирующих yEPAC. Клетки выращивали на 100 мМ пирувате и пульсировали 100 мМ глюкозой. Цвет указывает коэффициент FRET, отображаемый калибровочной полосой в правом верхнем углу.

    Рисунок S1.

    Характеристика пар FRET и датчика yEPAC. А) Спектры различных акцепторов mTq2. Сплошные линии показывают прямые слияния изображенных FP с mTq2.Пунктирные линии показывают спектры слияния T2A с mTq2, что приводит к эквимолярной экспрессии расщепленного mTq2 и акцептора, используемого в качестве контроля без FRET. Записывали спектры высеянных колоний W303-1A. B) Анализ чувствительности к рН yEPAC-R279L и пары FRET mVenus-mTq2 показывает устойчивость к pH вплоть до pH 5. Клетки, экспрессирующие yEPAC-R279L и mVenus-mTq2, выращивали до среднего логарифма в среде YNB, содержащей 100 мМ глюкозы. Клетки ресуспендировали в буфере Citric Acid/Na2HPO4, содержащем 2 мМ ионофора 2,4-динитрофенола, для уравновешивания уровней pH.Затем с помощью широкопольного микроскопа регистрировали коэффициенты FRET. Точки указывают среднее отношение FRET, нормализованное к pH 7,1, погрешности указывают на 95% CI. C) График экспрессии сенсора yEPAC (флуоресценция tdTomato, измеренная прямым возбуждением) в зависимости от отношения FRET не показывает четкой связи между уровнями экспрессии сенсора и измеряемым отношением FRET. D) Реакция yEPAC-R279L на неметаболизируемый сахарный сорбит. Клетки W303-1A WT, экспрессирующие yEPAC-R279L, выращивали на 1% EtOH и импульсно обрабатывали 100 мМ сорбитом или 100 мМ глюкозой при t=0 минут.Были получены сигналы FRET и нормализована базовая линия, линии показывают средние отношения FRET, заштрихованные области обозначают стандартное отклонение. E) характеристика созревания tdTomato. Клетки W303-1A WT, экспрессирующие tdTomato, выращивали на 1% EtOH и получали флуоресценцию CFP, GFP, RFP и YFP. Точки указывают значения флуоресценции одиночных клеток. Коробчатые диаграммы показывают медианные значения с квартилями, усы указывают наибольшую и наименьшую наблюдаемую величину в 1,5 раза больше межквартильного диапазона. расчетный срок службы mTq2 , определенный в частотной области. b Эффективность FRET рассчитывается как (1-(Срок службы донора +акцептор /срок службы донора))*100.

    Рисунок S2.

    Кривые роста клеток дикого типа W303-1A, экспрессирующих либо yEPAC, либо пустой вектор pDRF1-GW. Клетки выращивали до среднего логарифма в 1x YNB, содержащем 1% EtOH, промывали и ресуспендировали в среде, содержащей либо 10 мМ галактозы, 10 мМ глюкозы, либо 0,1% EtOH. Точки указывают на среднюю ОП, цвет указывает на штамм.

    Рисунок S3.

    Исходные отношения FRET клеток W303-1A WT, экспрессирующих yEPAC или не отвечающих на ответ yEPAC-R279L, демонстрируют небольшой исходный эффект скорости роста на уровни FRET. Точки указывают средний уровень FRET, цвета указывают на рост клеток-источников углерода.

    Рисунок S4.

    Измерения FRET динамической проточной цитометрии. B) Клетки дикого типа W303-1A выращивали на 1% EtOH, регистрировали базовый уровень (не показано на графике) и добавляли пульс глюкозы. Первый полученный момент времени после добавления глюкозы устанавливается равным t=0 секунд.Показан средний коэффициент FRET для каждой временной точки в бине, обозначенный точками. Цвет точек указывает на количество введенной глюкозы.

    Рисунок S5.

    yEPAC FRET ответы во время солевого стресса. Клетки W303-1A WT, выращенные на 1% этаноле, подвергали импульсному воздействию 100 мМ глюкозы в 0 минут и 250 мМ KCl в 10 минут (указано стрелками). Линии показывают средние отношения FRET (с поправкой на ответ yEPAC-R279L), нормализованные к исходному уровню, заштрихованные области указывают SD.

    Рисунок S6.

    Закон Вебера-Фехнера для одних и тех же ячеек во времени с 10-минутными периодами между ними.A) Клетки W303-1A, экспрессирующие yEPAC, предварительно инкубировали с 2 мМ глюкозой. После этого клетки переводили на 4 мМ глюкозы при t=0 минут и снова переводили на 8 мМ при t=25 минут. Линии показывают средний ответ популяции, нормализованный к первым 5 минутам, заштрихованные области обозначают стандартное отклонение. Б) Ответы переходов, выполненных на графике А, нормализованные к последним 3 кадрам перед каждым переходом. Цвет указывает на переход. C) График высоты пиков каждой ячейки для каждого перехода. Точки показывают высоту пика одной клетки, прямоугольники обозначают медиану с квартилями, усы обозначают 0.05–0,95 доля точек данных. D) Отношение нормализованных высот пиков одиночных ячеек между первым и вторым переходами. Точки представляют одиночные клетки.

    Рисунок S7.

    Одноклеточные ответы yEPAC FRET на различные углеродные переходы. Клетки, растущие на различных неферментативных источниках углерода, обрабатывали различными сахарами (переходы показаны над каждой панелью) в 0 минут. Линии показывают нормализованные к исходному уровню коэффициенты FRET для каждой клетки.

    Рисунок S8.

    Доля ответивших (синие столбцы) и неответивших (оранжевые столбцы) для различных переходов глюкозы и фруктозы.Были использованы только переходы, которые показали среднюю высоту пика по популяции не менее 1,15. Клетки считались отвечающими, когда они демонстрировали высоту пика не менее 30% от среднего значения пика для конкретного перехода.

    Рисунок S9.

    Длительный ответ yEPAC-R279L после перехода с 1% EtOH на 100 мМ глюкозы при t=0 минут. Те же данные с рисунка 1 изображены здесь в более длительном масштабе времени. Толстые цветные линии показывают средний ответ либо yEPAC, либо yEPAC-R279L. Серые линии показывают ответы одиночных клеток, нормализованные к исходному уровню.

    Благодарности

    Мы благодарим Kees Jalink (Отдел клеточной биологии, Нидерландский институт рака) за обмен mTurquoise2Δ-Epac(CD,ΔDEP)-cp173Venus-cp173Venus (Epac-Sh288). Мы благодарим Хуана Гарсию Вальехо и Кору Чадик (молекулярная клеточная биология и иммунология, VUmc) за помощь в проточной цитометрии.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.